費(fèi)笑非，杜芳，張紅鴨，石曉丹，張赟，燕江云，趙鋼

隱球菌病是晚期HIV陽(yáng)性患者最重要的機(jī)會(huì)性感染之一，其最常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)是隱球菌性腦膜炎(cryptococcal meningitis，CM)[1]，發(fā)病率和病死率較高。在發(fā)達(dá)國(guó)家，大部分CM患者與HIV感染相關(guān)[2]。但在我國(guó)及其他亞洲國(guó)家，一半以上的CM患者免疫功能正常[3]。研究認(rèn)為，這些“免疫功能正?！钡腃M患者可能存在影響免疫功能的潛在疾病[4]。在發(fā)達(dá)國(guó)家，HIV陰性沒(méi)有接受器官移植的CM患者是死亡率最高的人群[5]。與HIV陽(yáng)性患者相比，這一人群的診斷往往較晚，因此早期診斷是影響CM預(yù)后的一個(gè)關(guān)鍵因素。

CM的傳統(tǒng)檢測(cè)方法包括腦脊液墨汁染色涂片和腦脊液隱球菌培養(yǎng)[3]。腦脊液隱球菌培養(yǎng)是診斷CM的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但通常需要幾天時(shí)間[6]。隱球菌莢膜抗原可在血清、腦脊液和尿液標(biāo)本中檢測(cè)到。方法包括乳膠凝集法(latex agglutination，LA)、酶免疫法(enzyme immunoassays，EIAs)和膠體金免疫層析法(lateral flow assay，LFA)[7]。LFA敏感度和特異度最高，且成本低，速度快，已廣泛應(yīng)用[4]。但是人體清除莢膜多糖抗原相對(duì)較慢，即使患者腦脊液多次隱球菌涂片和培養(yǎng)變?yōu)殛幮院?，抗原檢測(cè)仍可陽(yáng)性，所以抗原檢測(cè)是否轉(zhuǎn)陰不能作為CM停藥的標(biāo)準(zhǔn)[3]。與常規(guī)方法相比，分子生物學(xué)方法不僅可以診斷CM，還具有其他價(jià)值[8]。宏基因組二代測(cè)序(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)是一種很有潛力的病原體檢測(cè)方法，一次檢測(cè)可以識(shí)別一系列潛在的病因——病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲(chóng)。目前，該方法已經(jīng)應(yīng)用于隱球菌性腦膜炎的臨床檢測(cè)[9]。本研究旨在比較腦脊液墨汁染色、腦脊液隱球菌培養(yǎng)、LFA和mNGS等方法診斷CM的價(jià)值，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2012年1月—2018年11月西京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查室CM患者腦脊液樣本47份為病例組，患者符合以下隱球菌腦膜炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]：(1)有發(fā)熱、頭痛、腦膜刺激征等腦膜炎癥狀和體征，腦脊液細(xì)胞學(xué)、生化檢查異常；(2)腦脊液墨汁染色和/或培養(yǎng)陽(yáng)性。對(duì)照組為同期非CM患者腦脊液樣本40份，患者符合細(xì)菌性腦膜炎、病毒性腦炎、結(jié)核性腦膜炎和自身免疫性腦炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[10-13]。樣本均保存在-80℃冰箱中。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 隱球菌檢測(cè)方法

1.2.1 腦脊液墨汁染色：將腦脊液標(biāo)本離心，除去上清，沉淀物涂于干凈玻片上，以墨汁染色。若在黑色背景中觀察到如細(xì)胞大小且透光的物體，周?chē)拭髁羺^(qū)域，表現(xiàn)為典型的“星夜”現(xiàn)象，為陽(yáng)性結(jié)果。

1.2.2 腦脊液隱球菌培養(yǎng)：用無(wú)菌方法將少量腦脊液接種于沙氏葡萄糖瓊脂(SDA)培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)1周，有菌生長(zhǎng)即為陽(yáng)性。

1.2.3 LFA檢測(cè)：將腦脊液樣本離心，取上清40 μl加入試管中，滴入標(biāo)本稀釋液1滴，隨后將膠體金試紙條放入試管中，室溫孵育10 min后讀取結(jié)果。試劑條包含檢測(cè)條帶和對(duì)照條帶。2個(gè)條帶都顯示為陽(yáng)性結(jié)果，僅顯示對(duì)照條帶為陰性結(jié)果。

1.2.4 mNGS檢測(cè)：(1)DNA提取。提取腦脊液300 μl，使用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的微量樣品基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Micro DNA Kit，DP316)，按照說(shuō)明書(shū)操作提取DNA。使用無(wú)腦脊液樣本的無(wú)菌水作為陰性對(duì)照。(2)建庫(kù)及測(cè)序。用Bioruptor Pico非接觸式超聲波破碎儀將提取的DNA變成200～300 bp長(zhǎng)度的片段。添加末端修復(fù)接頭，用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA，構(gòu)建文庫(kù)。根據(jù)MiniSeq系統(tǒng)文庫(kù)變性和稀釋指南，按照稀釋、混合、變性、再稀釋、混合測(cè)序參考物PhiX(相當(dāng)于DNA總量的1%)的步驟純化文庫(kù)。使用Illumina公司的MiniSeq測(cè)序儀進(jìn)行高通量測(cè)序。(3)數(shù)據(jù)分析。按照Burrows-Wheeler Alignment tool (BWA)[14]算法，用計(jì)算機(jī)減去測(cè)序結(jié)果中的人源序列，將剩余的數(shù)據(jù)與微生物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，該數(shù)據(jù)庫(kù)由2 700個(gè)病毒、1 494個(gè)細(xì)菌、73個(gè)真菌和48個(gè)與人類(lèi)相關(guān)的寄生蟲(chóng)基因組組成。并使用Soap coverage進(jìn)一步處理數(shù)據(jù)，計(jì)算每個(gè)物種特異性序列數(shù)和基因覆蓋度及對(duì)應(yīng)的測(cè)序深度。

2 結(jié) 果

2.1 2組一般資料比較 病例組CM腦脊液樣本47份來(lái)自CM患者42例，其中男26例(61.90%)，女16例(38.10%)，年齡17～88(47.5±18.6)歲。基礎(chǔ)疾病22例(52.38%)：HIV陽(yáng)性6例，系統(tǒng)性紅斑狼瘡1例，結(jié)締組織病3例，疑似“自身免疫性腦炎”口服激素2例，慢性腎炎2例，腎病綜合征3例，腎移植1例，2型糖尿病4例。47份腦脊液樣本平均存放時(shí)間69～1 197 d，中位數(shù)420 d，其中未使用抗真菌藥物樣本29份(61.70%)，使用抗真菌藥物樣本18份(38.30%)。對(duì)照組40份樣本分別來(lái)自細(xì)菌性腦膜炎患者7例，病毒性腦炎患者9例，結(jié)核性腦膜炎患者14例和自身免疫性腦炎患者10例，其中男20例(50.00%)，女20例(50.00%)，年齡15～74(36.8±13.8)歲。

2.2 隱球菌檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 2組墨汁染色、LFA、隱球菌培養(yǎng)結(jié)果比較：病例組樣本47份均行墨汁染色和LFA檢測(cè)，其中29份樣本進(jìn)行腦脊液隱球菌培養(yǎng)檢測(cè)，結(jié)果為墨汁染色陽(yáng)性24份，陰性23份；LFA陽(yáng)性42份，陰性5份；隱球菌培養(yǎng)陽(yáng)性23份，陰性6份。對(duì)照組樣本40份均行墨汁染色和LFA檢測(cè)，其中26份樣本進(jìn)行腦脊液培養(yǎng)檢測(cè)，結(jié)果為墨汁染色和培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果均為陰性，LFA陽(yáng)性1份，陰性39份；腦脊液培養(yǎng)均陰性。見(jiàn)表1。

2.2.2 2組mNGS檢測(cè)結(jié)果比較： 病例組腦脊液樣本47份中，有39份mNGS檢測(cè)到隱球菌特異性序列數(shù)(unique reads >0)。unique reads的范圍為2～124 168，基因覆蓋度范圍為0.000 79%～31.071 1%。此外，mNGS還檢測(cè)到曲霉菌1例，細(xì)菌9例和病毒4例。對(duì)照組40份樣本中，有3份mNGS檢測(cè)到隱球菌特異性序列數(shù)(unique reads=2)，基因覆蓋度范圍為0.000 82%～0.001 22%。測(cè)序深度為1。

NGS的結(jié)果受實(shí)驗(yàn)環(huán)境和測(cè)序試劑的影響，因此目前全世界范圍內(nèi)尚無(wú)統(tǒng)一的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，也沒(méi)有特定的NGS診斷CM的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)真菌在DNA提取中該物種的基因覆蓋度比同時(shí)檢測(cè)到的其他任何真菌高出5倍的該標(biāo)準(zhǔn)[15]，病例組樣本陽(yáng)性35份，陰性12份；對(duì)照組40份樣本均為陰性，見(jiàn)表1。

2.3 病例組未用藥樣本與用藥樣本陽(yáng)性率比較 未使用抗真菌藥物腦脊液樣本29份均行墨汁染色、LFA和mNGS檢測(cè)，行腦脊液隱球菌培養(yǎng)檢測(cè)樣本22份；使用抗真菌藥物腦脊液樣本18份均行墨汁染色、LFA和mNGS檢測(cè)，行腦脊液培養(yǎng)隱球菌檢測(cè)樣本7份。未用藥與用藥腦脊液樣本比較，mNGS和隱球菌培養(yǎng)的陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他檢測(cè)方法的陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

2.4 4種檢測(cè)方法的方法學(xué)指標(biāo)比較 墨汁染色的敏感度、陰性預(yù)測(cè)值最高和準(zhǔn)確度最低，LFA的敏感度、陰性預(yù)測(cè)值和準(zhǔn)確度最高，4種檢測(cè)方法的特異度和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值均接近100%，見(jiàn)表3。墨汁染色的敏感度和準(zhǔn)確度與其他3種檢測(cè)方法比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他檢測(cè)方法間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，僅墨汁染色與LFA的陰性預(yù)測(cè)值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他檢測(cè)方法間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表4。4種檢測(cè)方法的特異度和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，根據(jù)Fisher確切概率法計(jì)算，相互之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 病例組未用藥與用藥樣本4種檢測(cè)方法陽(yáng)性率比較 [%(n/n)]

3 討 論

腦脊液墨汁染色涂片是目前CM的主要診斷方法之一，該方法操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)較短，但受墨汁質(zhì)量、操作者經(jīng)驗(yàn)與技術(shù)水平等影響，即使采用離心濃縮腦脊液的方法，敏感度也不高[7, 16]。國(guó)內(nèi)墨汁染色的敏感度為40.00%～66.67%[17-19]，低于國(guó)外報(bào)道的80.00%～93.60%，這可能與HIV陰性患者腦脊液中隱球菌量較少有關(guān)[20-23]。本研究的敏感度也較低，與國(guó)內(nèi)相似。該方法所需物資設(shè)備較簡(jiǎn)單，特別適合于資源有限的地區(qū)，但其敏感度在所有方法中最低，建議臨床使用墨汁染色方法時(shí)聯(lián)合其他方法。

腦脊液LFA檢測(cè)具有較高的敏感度和特異度，是診斷CM最敏感的方法。該方法可檢測(cè)血液、腦脊液、尿液中的隱球菌抗原，且僅耗時(shí)10 min[16]。但CM患者血液和腦脊液中的莢膜抗原可能在數(shù)月至數(shù)年后仍保持陽(yáng)性，因此LFA無(wú)法監(jiān)測(cè)治療的效果，更無(wú)法作為停藥的標(biāo)準(zhǔn)[22]。本研究中LFA的敏感度為89.36%，略低于之前報(bào)道的95.00%～100%[20-22]。但在所有方法中敏感度最高，且成本低，速度快，所需腦脊液量較少(40 μl)，建議臨床診斷CM時(shí)首選LFA檢測(cè)。

表3 4種檢測(cè)方法的方法學(xué)指標(biāo)比較 [%(n/n)]

表4 4種檢測(cè)方法的敏感度、陰性預(yù)測(cè)值和準(zhǔn)確度比較

腦脊液培養(yǎng)是診斷CM的金標(biāo)準(zhǔn)，但確診需要數(shù)天時(shí)間，最終結(jié)果可能需要1～2周。因此，使用其他診斷方法來(lái)加快診斷和治療[24]。但CM患者腦脊液LFA和墨汁染色可長(zhǎng)期陽(yáng)性，對(duì)治療效果沒(méi)有參考價(jià)值，目前腦脊液培養(yǎng)陽(yáng)性是確認(rèn)CM復(fù)發(fā)或治療失敗的惟一檢測(cè)方法[22]。本研究腦脊液培養(yǎng)的敏感度為79.31%，高于國(guó)內(nèi)其他研究報(bào)道的25.00%～60.00%[16-17, 25]，低于國(guó)外HIV陽(yáng)性患者90.00%～95.70%[20, 22, 24]。但未使用抗真菌藥物標(biāo)本敏感度遠(yuǎn)高于使用抗真菌藥物標(biāo)本(P<0.01)。該結(jié)果表明，抗真菌藥物對(duì)腦脊液隱球菌培養(yǎng)的敏感度有顯著影響。建議臨床懷疑CM的患者在使用抗真菌藥物前行腦脊液隱球菌培養(yǎng)，且判斷CM復(fù)發(fā)或治療失敗時(shí)需進(jìn)行腦脊液培養(yǎng)。

mNGS是一種無(wú)偏倚的非靶向檢測(cè)方法，目前已應(yīng)用于臨床腦脊液病原體的檢測(cè)，其優(yōu)點(diǎn)為在腦脊液樣本量有限時(shí)，可在一次試驗(yàn)中檢測(cè)出多個(gè)潛在的病原體，還可以檢測(cè)或排除合并感染，尤其對(duì)于免疫功能受損的患者有益[26]。本研究中，mNGS不僅檢測(cè)到隱球菌，還檢測(cè)到其他病原體。但mNGS目前尚無(wú)較大樣本量的CM臨床檢測(cè)研究，且無(wú)統(tǒng)一的陽(yáng)性閾值，本研究按照國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道的閾值標(biāo)準(zhǔn)確定mNGS的敏感度。mNGS的敏感度低于LFA和腦脊液培養(yǎng)，可能有以下原因：(1)文獻(xiàn)報(bào)道，腦脊液樣本存放時(shí)間較長(zhǎng)，經(jīng)歷多次凍融循環(huán)和使用抗真菌藥物可能會(huì)降低mNGS的敏感度[26]。本研究病例組樣本平均存放時(shí)間較長(zhǎng)，且未使用抗真菌藥物標(biāo)本敏感度高于使用抗真菌藥物標(biāo)本(P<0.05)。(2)Schlaberg等[27]的研究提出，臨床為減少mNGS假陽(yáng)性，故意設(shè)定保守的閾值，應(yīng)該為臨床明確的病原體設(shè)立比臨床意義不明且環(huán)境中存在的病原體更寬松的報(bào)告閾值[26]。按照目前的閾值標(biāo)準(zhǔn)，敏感度較為保守。因此，當(dāng)患者有免疫功能受損或腦脊液樣本有限時(shí)，建議臨床在使用抗真菌藥物前及時(shí)進(jìn)行mNGS檢測(cè)。

本研究有一定的局限性：(1)為回顧性研究，腦脊液樣本凍存時(shí)間較長(zhǎng)，影響mNGS結(jié)果的準(zhǔn)確性。(2)雖然比較了傳統(tǒng)方法和mNGS檢測(cè)CM臨床腦脊液本的敏感度和特異度，但樣本量較少，且目前的閾值較保守，需用大樣本前瞻性的研究，進(jìn)一步探究mNGS檢測(cè)的截?cái)嘀?、敏感度和特異度?3)mNGS對(duì)抗真菌藥物較為敏感，需用大樣本前瞻性的研究，進(jìn)一步判斷mNGS是否可用于監(jiān)測(cè)CM的治療效果和判斷CM復(fù)發(fā)或治療失敗。

綜上所述，LFA的敏感度最高，建議臨床首選；墨汁染色操作簡(jiǎn)單但敏感度較低，需與其他方法聯(lián)合使用；隱球菌培養(yǎng)和mNGS對(duì)抗真菌藥物敏感，需在使用抗真菌藥物前進(jìn)行檢測(cè)。mNGS是一種較為敏感的檢測(cè)病原體的方法，可用于CM的早期診斷，還可以檢測(cè)或排除合并感染。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

費(fèi)笑非、趙鋼：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過(guò)程，設(shè)計(jì)論文框架，撰寫(xiě)論文；杜芳：提出研究思路，指導(dǎo)研究設(shè)計(jì)；張紅鴨、石曉丹：進(jìn)行文獻(xiàn)調(diào)研與整理，修訂論文、論文審核；張赟、燕江云：數(shù)據(jù)收集，分析整理