王文君，王璐瑤，周 華，韋 萍

(南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800)

凝集素(lectin)是指一種能夠?qū)Ｒ恍宰R(shí)別細(xì)胞表面糖基，并且與之非共價(jià)、可逆結(jié)合的非酶非抗體來源的蛋白質(zhì)或糖蛋白[1-2]。姬松茸學(xué)名為“AgaricusblazeiMurill”(以下簡(jiǎn)稱ABM)，原產(chǎn)自巴西，是一種食藥兼用真菌[3]，因其子實(shí)體中含有多糖、核酸、甾類和凝集素等多種生理活性物質(zhì)，同時(shí)研究人員發(fā)現(xiàn)姬松茸具有抗腫瘤[4]、抗氧化[5]和免疫調(diào)節(jié)[6]等多種潛在的藥理活性，故姬松茸具有良好的應(yīng)用開發(fā)前景。由于食用菌凝集素具有促進(jìn)有絲分裂、免疫調(diào)節(jié)、抗增生和抗腫瘤等多種生物活性，目前已成為研究者尤其是免疫學(xué)家研究的焦點(diǎn)[7]。近年來，已發(fā)現(xiàn)和研究的食用菌類凝集素的數(shù)量不斷增長(zhǎng)，尤其在2000年以后，有許多食用菌凝集素的提取純化報(bào)道[8-9]，但目前關(guān)于姬松茸凝集素的研究還比較少。

本文中，筆者擬對(duì)姬松茸凝集素的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，使用柱層析對(duì)姬松茸中的凝集素進(jìn)行有效地分離純化，系統(tǒng)研究姬松茸凝集素的理化性質(zhì)(熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、金屬離子影響、糖結(jié)合性能等)，同時(shí)研究凝集素對(duì)微生物生長(zhǎng)的抑制作用，以期為姬松茸資源的綜合利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

姬松茸，采購(gòu)于市場(chǎng)，勻漿機(jī)粉碎備用。

(NH4)2SO4(AR)，永華化學(xué)科技(江蘇)有限公司；牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G250、丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉、過硫酸鈉、四甲基乙二胺(TEMED)(AR)，Sigma公司；Na2HPO4·12H2O、冰醋酸(AR),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、西瓜枯萎菌、綠色木霉及褐腐菌保存于南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。

pHS-3C型雷磁pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；HJ-3型磁力攪拌器，常州國(guó)華電器有限公司；TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；AKTATMexplorer AKTA蛋白純化儀，GE Healthcare公司；JY92-2D型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝公司；P25T型聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)，Biometra公司；G10S型紫外分光光度計(jì)，Thermo Acientific公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 姬松茸凝集素的分離純化

1)凝集素粗品溶液的制備。稱取50.0 g粉碎姬松茸干品，用500 mL 0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)在4 ℃浸泡12 h；浸泡液離心去除固形物，上清液加(NH4)2SO4沉淀(飽和度達(dá)到80%)，再次離心后收集沉淀；用PBS緩沖液溶解沉淀，選用1.0×104的超濾膜超濾除鹽、濃縮，即得粗樣品液，經(jīng)冷凍干燥獲得凝集素凍干粗品。凍干粗品用0.02 mol/L 的Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)溶解后離心去除雜蛋白沉淀，上清液即為凝集素粗品溶液。

2)姬松茸凝集素的純化。采用AKTA蛋白純化儀，使用DEAE-Sepharose FF陰離子交換柱層析[10]首先對(duì)凝集素粗樣進(jìn)行分離。根據(jù)紫外吸收?qǐng)D譜，合并穿透峰和各個(gè)洗脫峰。使用兔血球懸浮液測(cè)試各峰的凝血活性。收集有凝血活性的樣品峰后透析除鹽，留備后續(xù)純化。用SP-Sepharose強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱對(duì)前述活性樣品進(jìn)行分離，收集有凝血活性的樣品峰，透析除鹽后用聚乙二醇濃縮后保存，留備后續(xù)純化。用Sephadex G-75分子篩柱對(duì)前述活性樣品進(jìn)一步進(jìn)行分離，收集有凝血活性的樣品峰，即得到純化的凝集素。

1.2.2 凝集素的純度及分子量的測(cè)定

凝集素的純度通過SDS-聚丙烯酰胺電泳方法測(cè)定[11]，分子量采用Sephadex G-75分子篩層析測(cè)定[12]。

1.2.3 理化因素對(duì)凝集素凝血活性的影響

通過凝血實(shí)驗(yàn)檢測(cè)凝集素的凝集效價(jià)，凝集效價(jià)指能使凝集反應(yīng)發(fā)生的樣品最高稀釋倍數(shù)?？疾觳煌瑴囟?、pH、金屬離子等因素對(duì)兔紅細(xì)胞凝血活性的影響。

凝血活性檢測(cè)方法：稀釋后的凝集素溶液加入等量2%兔紅細(xì)胞懸浮液，室溫下靜置1 h，觀察其凝血活性。

1.2.4 姬松茸凝集素的糖結(jié)合專一性測(cè)定

稀釋后的凝集素溶液，加入25 μL 的糖溶液(80 mmol/L)，靜置30 min，加入50 μL兔紅細(xì)胞懸液，室溫靜置2 h，測(cè)定凝集素的凝血活性，空白對(duì)照為凝集素溶液+磷酸鹽緩沖液+兔紅細(xì)胞懸液。選用的糖分別為葡萄糖、蔗糖、乳糖、N-乙酰氨基葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、D-果糖、麥芽糖和D-甘露糖。

1.2.5 姬松茸凝集素抑菌活性的研究

采用牛津杯法測(cè)定姬松茸凝集素的抑菌活性[13]。菌懸液均勻涂布平板，靜置，培養(yǎng)基表面垂直放置2個(gè)牛津杯，一個(gè)加入200 μL的姬松茸凝集素溶液，另一個(gè)加入200 μL的磷酸緩沖液作為空白對(duì)照，置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～3 d，觀察其抑菌圈大小。

2 結(jié)果與討論

2.1 凝集素的提取與純化

2.1.1 DEAE-Sepharose FF弱陰離子交換層析

將粗提的凝集素樣品進(jìn)行DEAE-Sepharose FF陰離子交換層析，用含0.1、0.25和0.5 mol/L NaCl 的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行分步洗脫，洗脫曲線如圖1所示。

圖1 姬松茸凝集素的DEAE-Sepharose離子交換層析Fig.1 DEAE-Sepharose ion-exchange chromatography of ABM lectin

分別檢測(cè)圖1中的穿透峰D1、0.1 mol/L NaCl洗脫下來的D2和0.5 mol/L NaCl洗脫下來的D4，經(jīng)檢測(cè)無凝血活性，而0.25 mol/L NaCl洗脫下來的D3洗脫峰具有很強(qiáng)的凝血活性，收集D3洗脫峰的樣品溶液透析除鹽，留備后續(xù)純化。

2.1.2 SP-Sepharose強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱層析

將上步收集的活性樣品峰透析濃縮后使用SP-Sepharose陽(yáng)離子交換層析，利用含0.5 mol/L NaCl的乙酸鈉-乙酸緩沖液(0.02 mol/L、pH 4.4)梯度洗脫，洗脫圖譜如圖2所示。再檢測(cè)圖2中各洗脫峰的凝血活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C2峰是活性峰，收集C2峰透析除鹽，留備后續(xù)純化。

圖2 姬松茸凝集素的SP-Sepharose離子交換層析Fig.2 SP-Sepharose ion-exchange chromatography of ABM lectin

2.1.3 Sephadex G-75分子篩凝膠層析

將SP-Sepharose分離后的活性峰樣品進(jìn)一步使用Sephadex G-75分子篩凝膠層析分離，分離圖譜如圖3所示。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)B1峰顯示出很強(qiáng)的凝血活性，收集B1活性峰透析除鹽后凍干，用于純度及性質(zhì)測(cè)定。

圖3 姬松茸凝集素的Sephadex G-75分子篩層析Fig.3 Sephadex G-75 gel filtration chromatography of ABM lectin

2.2 凝集素的純度及分子量測(cè)定

純化后樣品經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果見圖4。由圖4可知，純化后樣品為單一蛋白條帶，根據(jù)純化后樣品的條帶遷移率，計(jì)算出純化得到的亞基分子量為6.0×104。使用Sephadex G-75凝膠過濾法測(cè)定其表觀分子量，凝集素出峰體積約為125 mL，得其分子量為1.2×105，表明姬松茸凝集素為同源二聚體蛋白[14]。

圖4 姬松茸凝集素的SDS-PAGE電泳Fig.4 SDS-PAGE electrophoresis of ABM lectin

2.3 姬松茸凝集素的純化回收率

姬松茸粗提液經(jīng)(NH4)2SO4分級(jí)沉淀、DEAE-52陰離子交換層析、SP陽(yáng)離子交換層析、S-75分子篩層析純化后，各步驟分離后的姬松茸凝集素回收率及純化倍數(shù)等結(jié)果如表1所示。由表1可知，姬松茸凝集素相對(duì)粗提液回收率為28.99%，純化倍數(shù)為19.04倍。

2.4 理化因素對(duì)凝集素凝血活性的影響

2.4.1 溫度對(duì)凝集素凝血活性的影響

考察不同溫度條件對(duì)姬松茸凝集素凝集活性的影響，結(jié)果見表2。

由表2可知：從20 ℃開始到70 ℃，姬松茸凝集素的凝集效價(jià)沒有變化，且保持較高的凝血活性，說明姬松茸凝集素具有較好的熱穩(wěn)定性；在70 ℃以上凝集活性才開始急速下降，直到100 ℃完全喪失凝集活力，說明姬松茸凝集素在高溫條件下會(huì)發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)變性，最后活性完全喪失。

2.4.2 pH對(duì)凝集素凝血活性的影響

考察不同pH對(duì)姬松茸凝集素活性的影響，結(jié)果見表3。

由表3可知：在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿環(huán)境下，姬松茸凝集素的活力會(huì)喪失，證明姬松茸凝集素是一種對(duì)酸堿均很敏感的蛋白；在pH為4～6時(shí)，凝血活性較低，在pH為7～9時(shí)，凝血活性較高，說明凝集素對(duì)酸的耐受性弱于堿，表明pH7～9是最適pH范圍。

表1 姬松茸凝集素的純化結(jié)果

表2 溫度對(duì)凝集素凝血活性的影響

表3 pH對(duì)凝集素凝血活性的影響

2.4.3 金屬離子對(duì)凝集素凝血活性的影響

測(cè)定了3種二價(jià)金屬離子對(duì)姬松茸凝集素活性影響，結(jié)果見表4。

表4 金屬離子對(duì)凝集素凝血活性的影響

由表4可知，姬松茸凝集素對(duì)EDTA透析后的去離子緩沖液以及對(duì)含Ca2+、Mg2+和Mn2+的3種金屬離子緩沖液透析都沒有影響它的活性，表明凝集素的凝血活性并不受二價(jià)陽(yáng)離子的影響。

2.5 姬松茸凝集素的糖結(jié)合專一性測(cè)定

如果凝集素與糖溶液中的糖鏈結(jié)合，就不能與兔紅細(xì)胞表面的糖鏈結(jié)合，那么對(duì)兔紅細(xì)胞的凝血活性就會(huì)有所下降；反之亦然。因此考察不同的糖與凝集素的結(jié)合情況，結(jié)果見表5。由表5可知，葡萄糖溶液中的姬松茸凝集素幾乎沒有凝血活性，證明葡萄糖是姬松茸凝集素專一性結(jié)合糖，可以高度抑制凝集素和兔血紅細(xì)胞的凝集反應(yīng)，D-半乳糖、蔗糖對(duì)姬松茸凝集素的血凝活性也起到了部分抑制作用。

表5 凝集素的糖結(jié)合專一性測(cè)定

2.6 姬松茸凝集素粗提物的抑菌活性測(cè)定

2.6.1 姬松茸凝集素粗提物對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用

考察姬松茸凝集素粗提物對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用，結(jié)果見圖5。由圖5可知，在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌2種菌株生長(zhǎng)的平板上，添加凝集素樣品的牛津杯周圍沒有出現(xiàn)抑菌圈，說明姬松茸凝集素對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌并沒有顯示出抑菌作用。

2.6.2 姬松茸凝集素對(duì)真菌生長(zhǎng)的抑制作用

考察姬松茸凝集素粗提物對(duì)真菌生長(zhǎng)的抑制作用，結(jié)果見圖6。由圖6可知：在西瓜枯萎病菌、綠色木霉和黑曲霉生長(zhǎng)的平板上，添加凝集素樣品的牛津杯周圍沒有出現(xiàn)抑菌圈，且各菌體都生長(zhǎng)旺盛，表明姬松茸凝集素對(duì)西瓜枯萎菌、綠色木霉和黑曲霉的生長(zhǎng)沒有抑制作用；而在接種褐腐菌的平板上，添加凝集素樣品的牛津杯周圍的菌體生長(zhǎng)完全停止，邊緣較光滑，出現(xiàn)了明顯的抑菌圈，這表明姬松茸凝集素粗品對(duì)褐腐菌有明顯的生長(zhǎng)抑制作用。

3 結(jié)論

選用柱層析法對(duì)姬松茸凝集素進(jìn)行了分離純化，使用了DEAE-Sepharose FF弱陰離子交換層析、SP-Sepharose 強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱層析和Sephadex G-75分子篩凝膠層析對(duì)姬松茸凝集素進(jìn)行了有效提取，經(jīng)SDS-PAGE變性電泳檢測(cè)純化后所得的姬松茸凝集素為單一條帶；經(jīng)SP-Sepharose凝膠過濾法分析發(fā)現(xiàn)姬松茸凝集素是一種含有2個(gè)相同亞基的同源二聚體蛋白，分子量為1.20×105，姬松茸凝集素相對(duì)粗提液的回收率為28.99%，純化倍數(shù)為19.04倍。

研究表明，姬松茸凝集素具有良好的耐熱性，其最適pH為7～9。姬松茸凝集素的凝血活性不受金屬離子的影響，葡萄糖是其專一性結(jié)合糖。通過對(duì)姬松茸凝集素粗提物抑菌性能的考察，發(fā)現(xiàn)該凝集素對(duì)褐腐菌有明顯的生長(zhǎng)抑制活性，展示出其在植物防治領(lǐng)域潛在的應(yīng)用前景。

圖5 姬松茸凝集素對(duì)枯草芽孢桿菌和大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制作用Fig.5 Effects of ABM lectin on Bacillus subtilis and Escherichia coli growth

圖6 姬松茸凝集素對(duì)真菌生長(zhǎng)的抑制作用Fig.6 Effects of ABM lectin on fungi growth