包裝飲用水中銅綠假單胞菌4種鑒定方法的比較

王 萍，朱 淵，喬勇升，張占林

(江蘇省泰州市藥品檢驗(yàn)院，江蘇 泰州 225300)

銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)是一種重要的革蘭氏陰性致病菌，廣泛存在于自然界中,營養(yǎng)要求低，喜歡潮濕的環(huán)境，對(duì)消毒劑、干燥、紫外線等理化因素具有很強(qiáng)的抵抗力，可引起急性腸道炎、腦膜炎、敗血癥和皮膚炎癥等疾病[1]。剛出廠的包裝飲用水中銅綠假單胞菌數(shù)量較少，但因其消費(fèi)周期較長，保存期至少半個(gè)月以上，兼性化能自養(yǎng)代謝而對(duì)有機(jī)營養(yǎng)要求低的銅綠假單胞菌可生長繁殖達(dá)到104cfu/mL[2]。2015年更新實(shí)施的GB 19298—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)包裝飲用水》在原有微生物限量方面增設(shè)了銅綠假單胞菌5次抽樣作為檢測(cè)指標(biāo)。近年來，隨著國內(nèi)桶裝飲用水消費(fèi)量的不斷上升，有關(guān)銅綠假單胞菌污染桶裝水的報(bào)道也逐漸增多[3-7]，引起了諸多學(xué)者和消費(fèi)者的關(guān)注。

GB 8538.57—2016是飲用天然礦泉水中銅綠假單胞菌的檢驗(yàn)方法，但日常的檢測(cè)工作中卻發(fā)現(xiàn)該方法不是很完善，給檢驗(yàn)工作帶來一定的困擾，張帆等[8]研究發(fā)現(xiàn)根據(jù)GB 8538.57—2016鑒定出的銅綠假單胞菌中會(huì)出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果；潘盂泉[9]指出其24～48 h的培養(yǎng)條件經(jīng)常無法對(duì)銅綠假單胞菌進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。本文中，筆者采用GB 8538.57—2016、VITEK 2 Compact、API 20E、16S rRNA基因序列分析4種常用的檢測(cè)方法對(duì)從桶裝水中分離得到的菌落形態(tài)可疑的25株野生型菌株進(jìn)行復(fù)核驗(yàn)證鑒定，并對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行比較、分析，旨在對(duì)銅綠假單胞菌的快速分離與準(zhǔn)確鑒定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

銅綠假單胞菌CGMCC1.10274購于中國普通微生物菌種保藏管理中心，其余YS-465等共25株菌株為筆者按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 8538.57—2016飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法從桶裝水樣品中分離保存的野生型菌株。

1.2 儀器與試劑

營養(yǎng)肉湯、平板計(jì)數(shù)瓊脂、CN假單胞選擇性培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；乙酰胺肉湯、納氏試劑，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司和廣州環(huán)凱有限公司各買一套；Taq酶等PCR試劑，大連寶生物工程有限公司；16S rRNA引物序列，上海生工生物有限公司合成；Tween 20，上海生工生物公司；革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定卡(GN鑒定卡)及腸桿菌和其他非苛養(yǎng)革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒(API 20E)，梅里埃生物有限公司；QIAxcel高解析DNA分析試劑盒，QIAGEN公司。所有培養(yǎng)基和試劑均在有效期內(nèi)使用并通過了質(zhì)量驗(yàn)收。

VITEK 2 Compact微生物鑒定儀，法國梅里埃生物有限公司；PCR儀，默飛世爾科技公司；QIX核酸蛋白分析儀，QIAGEN公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

從標(biāo)準(zhǔn)菌株CGMCC1.10274、YS-465、YS-534、YS-536、YS-635、YS-682、YS-685、YS-686、YS-711、YS-2504、YS-2508、YS-2511、YS-3365、YS-3366、YS-3367、YS-463、YS-531、YS-535、YS-574、YS-634、YS-923、YS-1066、YS-1104、YS-1498、YS-1499及YS-2505共25株野生型菌株的保藏管中各挑取一環(huán)菌液，分別劃線接種于平板計(jì)數(shù)平板上，36 ℃過夜培養(yǎng)復(fù)蘇菌株，然后繼續(xù)傳代一次，得到活化菌株備用。

1.3.2 乙酰胺肉湯試驗(yàn)

將活化的純培養(yǎng)物分別接種到陸橋和環(huán)凱兩個(gè)不同廠家的乙酰胺液體培養(yǎng)基中，36 ℃過夜培養(yǎng)20～24 h，按照廠家說明書向每個(gè)培養(yǎng)物中滴加1～2滴納氏試劑，立刻觀察，若出現(xiàn)磚紅色，則為陽性，否則為陰性。每株菌株重復(fù)進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 VITEK生化鑒定

按照VITEK 2 Compact全自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)操作流程及GN卡使用說明書對(duì)分離保存的野生型菌株進(jìn)行鑒定，每株菌株重復(fù)3次上機(jī)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 API 20E試劑盒生化鑒定

具體操作按照API 20E試劑盒使用說明書操作，最后將生化結(jié)果輸入鑒定軟件得到鑒定結(jié)果。每株菌株重復(fù)進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 菌落PCR擴(kuò)增16S rRNA

將3種方法都鑒定為銅綠假單胞菌的13株菌株、3種方法鑒定結(jié)果不一致的6株可疑菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株CGMCC1.10274進(jìn)行16S rRNA PCR擴(kuò)增。16S rRNA引物序列：27f：5′-A￣G￣A￣G￣T￣T￣T￣G￣A￣T￣C￣C￣T￣G￣G￣C￣T￣C￣A￣G-3′，1492R：5′-G￣G￣T￣T￣A￣C￣C￣T￣T￣G￣T￣T￣A￣C￣G￣A￣C￣T￣T-3′[10]。擴(kuò)增體系(25 μL)如下。模板：用一次性接種針挑少量菌體，10×Buffer(Mg2+Plus)2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，20%吐溫(Tween 20/無菌水：V/V)2 μL，正反向引物(10 μmol/L)各為1.5 μL，Taq酶(5 U/μL)0.2 μL，無菌去離子水補(bǔ)至25 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，此步驟共35個(gè)循環(huán)；最后25 ℃冷卻5 min。所得PCR產(chǎn)物通過QIX核酸蛋白分析系統(tǒng)檢測(cè)。

1.3.6 測(cè)序比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

16S rRNA由上海生工生物工程有限公司完成測(cè)序工作，并在NCBI上用BLAST進(jìn)行同源性比較。從GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中下載銅綠假單胞菌(P.aeruginosa，MH368491.1)、惡臭假單胞菌(P.putida，AB681323.1)和熒光假單胞菌(P.fluorescens，MG576181.1)的16S rRNA基因序列，與銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CGMCC1.10274及被GB 8538.57—2016、VITEK 2 Compact及API 20E這3種方法都鑒定為銅綠假單胞菌和可疑銅綠假單胞菌菌株的序列，用Clustal X和TreeViewX生物學(xué)軟件進(jìn)行序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 GB 8538.57—2016飲用天然礦泉水檢驗(yàn)銅綠假單胞菌結(jié)果

按照GB 8538.57—2016標(biāo)準(zhǔn)，CN培養(yǎng)基上只有藍(lán)/綠色菌落不需要做乙酰胺肉湯確證性實(shí)驗(yàn)，其他的產(chǎn)熒光(非藍(lán)/綠)菌落以及紅褐色菌落都需要做乙酰胺肉湯確證性實(shí)驗(yàn)，由此可見乙酰胺肉湯實(shí)驗(yàn)是銅綠假單胞菌鑒定的一個(gè)重要生化指標(biāo)。為了防止實(shí)驗(yàn)過程中所產(chǎn)氨的揮發(fā)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，實(shí)驗(yàn)選取環(huán)凱(培養(yǎng)基裝在無蓋的安瓿瓶中培養(yǎng))和陸橋(培養(yǎng)基裝在帶蓋的西林瓶中培養(yǎng))2個(gè)廠家的乙酰胺肉湯進(jìn)行試驗(yàn)比較，結(jié)果如表1所示。從表1中可以看出，2個(gè)廠家的實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全一致，表明這25株野生型菌株不存在由于微弱產(chǎn)氨，通過無蓋的安瓿瓶揮發(fā)到空氣中，造成假陰性的結(jié)果。根據(jù)GB 8538.57—2016可以判定25株野生型菌株中，14株淺黃色產(chǎn)熒光乙酰胺肉湯陽性的菌株被鑒定為銅綠假單胞菌。

表1 GB 8538.57—2016鑒定結(jié)果

注：“+”為陽性結(jié)果;“-”為陰性結(jié)果。

2.2 VITEK 2 Compact鑒定結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)菌株及25株野生型菌株VITEK 2 Compact生化鑒定結(jié)果見表2。由表2可知，19株菌株被鑒定為銅綠假單胞菌，其中YS-463、YS-535、YS-923、YS-1066、YS-1498這5株菌株雖然乙酰胺肉湯實(shí)驗(yàn)為陰性，但卻被鑒定為銅綠假單胞菌，與按照GB 8538.57—2016檢驗(yàn)方法鑒定的結(jié)果不一致。

2.3 API 20E生化鑒定結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)菌株及25株野生型菌株API 20E鑒定結(jié)果見表2。由表2可見，13株被鑒定為銅綠假單胞菌的野生型菌株，與GB 8538.57—2016檢驗(yàn)方法及VITEK生化鑒定的結(jié)果一致；YS-463、YS-535、 YS-923、YS-1066、YS-1498這5株野生型菌株被鑒定為熒光假單胞菌，與GB 8538.57—2016檢驗(yàn)方法判定結(jié)果一致，但VITEK2 Compact卻鑒定為銅綠假單胞菌；YS-686被鑒定為惡臭假單胞菌，但GB 8538.57—2016及VITEK2 Compact卻鑒定為銅綠假單胞菌。

表2 VITEK 2 Compact及API 20E鑒定結(jié)果

注：“+”為銅綠假單胞菌;“-f”為熒光假單胞菌;“-p”為惡臭假單胞菌;“-s”為少動(dòng)鞘氨醇單胞菌;“-ab”為鮑氏不動(dòng)桿菌;“-ah”為溶血不動(dòng)桿菌。

2.4 16S rRNA PCR擴(kuò)增

16S rRNA PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1。由圖1可知，片段約為1 450 bp，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1 銅綠假單胞菌和可疑銅綠假單胞菌的 毛細(xì)管凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Capillary gel electrophoresis of P. aeruginosaand suspected P. aeruginosa strains

2.5 16S rRNA基因序列比對(duì)結(jié)果

將3種方法都鑒定為銅綠假單胞菌的13株菌株、3種方法鑒定結(jié)果不一致的6株可疑菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株CGMCC1.10274的16S rRNA基因序列經(jīng)與NCBI數(shù)據(jù)庫上BLAST程序同源性比較，結(jié)果與API 20E鑒定結(jié)果一致，證實(shí)只有13株為銅綠假單胞菌。通過比對(duì)序列發(fā)現(xiàn)可疑菌株YS-463、YS-535、YS-923、YS-1066、YS-1498和MG576181.1熒光假單胞菌序列基本一致，YS-686和AB681323.1惡臭假單胞菌序列基本一致，其余菌株和銅綠假單胞菌CGMCC1.10274的基因序列基本一致，結(jié)合細(xì)菌16S rRNA的9個(gè)可變區(qū)，發(fā)現(xiàn)序列之間的差異正好落在可變區(qū)內(nèi)，如圖2所示。通過系統(tǒng)發(fā)育樹圖3，也可以看出13株野生型銅綠假單胞菌與標(biāo)準(zhǔn)菌株CGMCC1.10274聚在一起，YS-463、YS-535、YS-923、YS-1066、YS-1498 5株菌株與熒光假單胞菌(MG576181.1) 聚為一類，而YS-686與惡臭假單胞菌(NBRC 100988)聚為一類。

圖2 16S rRNA基因序列差異Fig.2 The difference of 16S rRNA sequence

圖3 基于16S rRNA基因序列的銅綠假單胞菌和 可疑銅綠假單胞菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequence ofP. aeruginosa and suspected P. aeruginosa strains

3 討論

由于物種間高度的保守性，16S rRNA基因序列被稱為“細(xì)菌化石”，目前已被廣泛應(yīng)用于遺傳進(jìn)化分子水平上對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定[12-14]。本文中其他3種方法與16S rRNA基因序列比對(duì)結(jié)果相比，GB 8538.57—2016鑒定結(jié)果中，1株為假陽性菌株，所占比例為7.14%；VITEK 2 Compact鑒定結(jié)果中，6株為假陽性菌株，所占比例為31.58%；API 20E鑒定結(jié)果與16S rRNA基因序列比對(duì)鑒定結(jié)果一致，表明API 20E對(duì)銅綠假單胞菌的鑒定結(jié)果是準(zhǔn)確和可靠的。

GB 8538.57—2016中對(duì)銅綠假單胞菌的進(jìn)一步確認(rèn)主要通過乙酰胺試驗(yàn)，銅綠假單胞菌具有乙酰胺酶，能夠分解乙酰胺產(chǎn)氨。但已有研究顯示糞鏈球菌、洋蔥假單胞菌、熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌的部分菌株也具有乙酰胺酶，產(chǎn)氨試驗(yàn)也為陽性[15]，于是造成了一些假陽性結(jié)果的產(chǎn)生，如本文中的YS-686菌株。

VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)以方便、快捷、準(zhǔn)確率高著稱，是絕大多數(shù)微生物實(shí)驗(yàn)室、微生物工作者以及國家標(biāo)準(zhǔn)都認(rèn)可的儀器，甚至以此儀器作為微生物鑒定是否準(zhǔn)確的判斷依據(jù)，但陳冠武等[16]在檢測(cè)化妝品中銅綠假單胞菌時(shí)發(fā)現(xiàn)一株假陽性菌株，在本研究中也發(fā)現(xiàn)假陽性菌株，所占比例達(dá)31.58%。這可能與VITEK 2 Compact屬于表型鑒定有關(guān)，接種物的濃度，培養(yǎng)液的組分、孵育時(shí)間，細(xì)菌本身的一些不典型性以及儀器光學(xué)讀數(shù)頭等其他一些因素都會(huì)影響最終生化鑒定結(jié)果[17-18]。此外，本次試驗(yàn)所選可疑菌落中淺黃色發(fā)熒光居多，與假單胞屬中常見黃色、發(fā)熒光的熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌易互相干擾，導(dǎo)致本次鑒定假陽性所占比例較高。

4 結(jié)論

GB 8538.57—2016雖是目前基層食品檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)鑒定銅綠假單胞菌的首選方法，但對(duì)檢驗(yàn)人員的技術(shù)要求較高，存在一定的主觀性；VITEK 2 Compact操作簡便、耗時(shí)短，但儀器和耗材昂貴；更重要的是2種方法對(duì)銅綠假單胞菌的鑒定可能受到惡臭假單胞菌和熒光假單胞菌的干擾，有造成錯(cuò)判的可能性。API 20E和16S rRNA基因序列分析法操作簡單、準(zhǔn)確率高，但是API 20E耗時(shí)長，16S rRNA基因序列分析法試劑昂貴，對(duì)檢驗(yàn)人員的分子生物學(xué)水平有一定的要求。綜上所述，銅綠假單胞菌的鑒定在采用GB 8538.57—2016方法的基礎(chǔ)上還需根據(jù)實(shí)驗(yàn)室自身實(shí)際情況，結(jié)合VITEK 2 Compact、API 20E、16S rRNA基因序列分析法，互為佐證，提高準(zhǔn)確率，減少誤判。