楊 梟， 張志忍， 汪鐵林，2， 王為國(guó)，2， 王存文，2

（1. 武漢工程大學(xué) 化工與制藥學(xué)院， 湖北 武漢 430205； 2. 武漢工程大學(xué) 綠色化工過(guò)程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430205）

0 引言

由于人類(lèi)活動(dòng)和工業(yè)化所產(chǎn)生的溫室氣體，特別是二氧化碳（CO2），一直被認(rèn)為是導(dǎo)致全球氣候變化的主要原因[1]。 在可預(yù)見(jiàn)的未來(lái)，人類(lèi)的能源供應(yīng)仍將以傳統(tǒng)化石燃料為主，因此，如何從CO2大型排放源中對(duì)CO2進(jìn)行捕集與利用成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。CO2的捕集包括物理、化學(xué)和生物方法。 在生物方法中，微藻因?yàn)榫哂休^高的固碳和產(chǎn)脂能力而受到了廣泛的關(guān)注[2]。 在微藻固碳過(guò)程中，水和CO2轉(zhuǎn)化為有機(jī)物，不會(huì)產(chǎn)生二次污染，同時(shí)，微藻中積累的脂質(zhì)可作為生產(chǎn)第三代生物柴油的原料[3]，[4]。

微藻通常具有較好的CO2耐受性，這個(gè)特性使其有可能直接從煙道氣中捕獲CO2[5]。當(dāng)環(huán)境中CO2的體積分?jǐn)?shù)超過(guò)2%~5%時(shí)，通常會(huì)對(duì)大多數(shù)光自養(yǎng)生物的生長(zhǎng)和光合作用產(chǎn)生不利影響，而有些微藻卻對(duì)高濃度的CO2表現(xiàn)出很好的耐受性[6]。 雖然煙道氣中一般含有10-4~3×10-4的NOx和SOx， 但是，有研究表明，少量的NOx對(duì)微藻的生長(zhǎng)無(wú)顯著影響， 微藻培養(yǎng)前在培養(yǎng)基中加入CaCO3可以消除SO2對(duì)微藻生長(zhǎng)的影響[7]。 因此，利用燃煤煙氣中的CO2培養(yǎng)能源微藻是可行的。

有研究表明，在微重力環(huán)境下，植物細(xì)胞的分裂能力增強(qiáng)，微藻細(xì)胞的代謝活動(dòng)有明顯變化。G Wang 通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，在微重力條件下，微藻的生長(zhǎng)速度高于普通環(huán)境[8]。 因此，在微重力條件下培養(yǎng)微藻， 有望提高微藻的固碳能力和脂質(zhì)的積累。本文以蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）為研究對(duì)象，研究了在模擬的微重力條件下，高濃度的CO2對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)和脂質(zhì)積累的影響，并對(duì)其脂肪酸組成進(jìn)行了分析。

1 材料和方法

1.1 藻種和培養(yǎng)條件

本研究所使用的蛋白核小球藻 （編號(hào)為FACHB-9） 由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所提供，培養(yǎng)基為BG-11。 實(shí)驗(yàn)在恒溫（25±1 ℃）培養(yǎng)箱中進(jìn)行，光照強(qiáng)度為4 000 lx，光暗比為16 h∶8 h。

1.2 模擬微重力系統(tǒng)

采用The Rotary Cell Culture System（RCCS）模擬微重力環(huán)境[9]。 RCCS 的轉(zhuǎn)盤(pán)直徑為8 cm，轉(zhuǎn)速為10 r/min。 為了能夠連續(xù)通入CO2，對(duì)RCCS 進(jìn)行了改裝（圖1）。 氣體先通入吸收池內(nèi)的藻液，再通過(guò)蠕動(dòng)泵將藻液送入轉(zhuǎn)盤(pán)中。 蠕動(dòng)泵的流量應(yīng)嚴(yán)格控制，防止剪切力過(guò)大破壞FACHB-9 細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)表明， 在同樣的培養(yǎng)條件下，F(xiàn)ACHB-9 在改裝前后的RCCS 中的生長(zhǎng)無(wú)顯著差異。

圖1 微藻培養(yǎng)系統(tǒng)原理圖Fig.1 Schematic diagram of the microalgae culture system

在4 種不同的條件下對(duì)FACHB-9 進(jìn)行培養(yǎng)，初始生物量濃度均為0.343 g/L。 其中兩組在微重力條件下培養(yǎng)，一組通入CO2（記為SMGC），另一組通入空氣 （記為SMG）； 余下兩組為對(duì)照組，在普通條件（轉(zhuǎn)盤(pán)靜置）下培養(yǎng)，其中一組通入CO2（記為GCC），另一組通入空氣（記為GC）。

1.3 微藻生物量濃度的測(cè)定

藻液的pH 值采用PHS-3C 型pH 計(jì)測(cè)定。通過(guò)UV-9000 型紫外可見(jiàn)分光度計(jì)在680 nm 下測(cè)定藻液的吸光度（OD680），微藻生物量濃度W（g/L）的計(jì)算式為

1.4 脂質(zhì)提取及細(xì)胞形態(tài)觀察

將培養(yǎng)所得藻液經(jīng)4 000 r/min 離心10 min后，棄去上清液，取下層沉淀冷凍干燥至恒重，得到干燥藻粉。 采用甲醇-氯仿法從藻粉中提取油脂，將所提取的油脂轉(zhuǎn)移到硫酸和甲醇（體積比為1∶7）混合溶液中并于50 ℃下反應(yīng)24 h，再用正己烷萃取反應(yīng)產(chǎn)物（脂肪酸甲酯）。 所得脂肪酸甲酯用飽和NaCl 溶液洗滌3 次， 并用無(wú)水Na2SO4干燥后由Agilent 7890A 型氣相色譜-質(zhì)譜 （GCMS）分析其組成。

將藻液稀釋后用JSM-5510LV 型掃描電鏡（SEM）觀察微藻細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并測(cè)定微藻細(xì)胞的平均直徑。

1.5 油脂積累速率和固碳效率計(jì)算

微藻的油脂積累速率通過(guò)式（2）進(jìn)行計(jì)算。

式中：PL為微藻油脂積累速率，mg/（L·h）；W0和Wf分別為每一培養(yǎng)周期開(kāi)始與結(jié)束時(shí)的微藻生物量濃度，g/L；X0和Xf分別為每一培養(yǎng)周期開(kāi)始與結(jié)束時(shí)的微藻油脂含量，mg/g；Δt 為培養(yǎng)時(shí)間，h。

微藻總碳含量采用Elementar 型總有機(jī)碳分析儀（TOC）測(cè)定，并通過(guò)式（3）計(jì)算微藻的固碳效率。

式中：Fc為微藻的固碳效率，mg/（L·h）；ω0和ωf分別為每一培養(yǎng)周期開(kāi)始與結(jié)束時(shí)，微藻（干基）的碳含量，%。

2 結(jié)果與討論

2.1 CO2 濃度對(duì)FACHB-9 生長(zhǎng)和脂質(zhì)積累的影響

當(dāng)環(huán)境中的CO2濃度（體積濃度，下同）超過(guò)5%時(shí)，大多數(shù)微藻的生長(zhǎng)會(huì)受到抑制，但有些小球藻在CO2濃度為5%~20%的條件下仍能生長(zhǎng)良好[10]，[11]。 本文首先對(duì)FACHB-9 進(jìn)行了CO2耐受性馴化，然后在普通環(huán)境下考察了CO2濃度對(duì)其生長(zhǎng)和脂質(zhì)積累的影響 （在本實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)ACHB-9的初始接種濃度為0.310 g/L， 在培養(yǎng)箱光照結(jié)束前2 h 停止通入CO2氣體），結(jié)果如圖2 所示。

從圖2（a）可以看出：FACHB-9 在給定的不同CO2濃度下均能生長(zhǎng)良好；經(jīng)過(guò)120 h 的培養(yǎng)，通入CO2的各組FACHB-9 的生物量濃度均遠(yuǎn)高于對(duì)照組（通入空氣），其中，在CO2濃度為5%的條件下，F(xiàn)ACHB-9 的生長(zhǎng)速率最大， 最大生物量濃度為1.47 g/L。

從圖2（b）可以看出：通入的CO2濃度越高，F(xiàn)ACHB-9 的脂質(zhì)含量越高； 通入空氣培養(yǎng)120 h后，F(xiàn)ACHB-9 的脂質(zhì)含量為20.6%， 而通入濃度為20%的CO2培養(yǎng)120 h 后，F(xiàn)ACHB-9 的脂質(zhì)含量可達(dá)27.9%。 在利用燃煤電廠煙氣中的CO2培養(yǎng)微藻時(shí)，不僅要關(guān)注微藻的生長(zhǎng)速率，還要考慮微藻的油脂含量和煙氣中的CO2濃度。 燃煤電廠排放的煙氣中CO2的濃度為10%~15%， 因此，在以下研究中均采用濃度為10% 的CO2來(lái)培養(yǎng)FACHB-9， 且不考慮煙氣中NOx，SO2等氣體對(duì)FACHB-9 生長(zhǎng)的影響。

圖2 普通環(huán)境下，CO2 濃度對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)和脂質(zhì)含量的影響Fig.2 The effect of CO2 concentration on the growth and lipid content of Chlorella pyrenoidosa under general condition

2.2 FACHB-9 的生長(zhǎng)情況

模擬的微重力條件和CO2對(duì)FACHB-9 生長(zhǎng)的影響如圖3 所示。

圖3 蛋白核小球藻在不同培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.3 Growth curves of Chlorella pyrenoidosa cultivated in four different conditions

從圖3 可以看出：培養(yǎng)120 h 后，在模擬的微重力條件下，SMGC 組的最大生物量濃度為1.54 g/L，比SMG 組高出70.6%；在普通條件下，GCC 組的最大生物量濃度為1.09 g/L， 比GC 組提高了92.9%，這一結(jié)果與文獻(xiàn)[12]的研究結(jié)果相一致。 在通入的CO2濃度均為10%條件下，SMGC 組的最大生物量濃度比GCC 組提高了40.5%。 與GC 組相比，SMGC 組的最大生物量濃度提高了178%，這說(shuō)明模擬的微重力條件與CO2對(duì)FACHB-9 的生長(zhǎng)具有很好的協(xié)同促進(jìn)作用。

增大CO2的濃度會(huì)導(dǎo)致藻液的pH 值降低，而酸性過(guò)大將影響微藻的生理機(jī)能進(jìn)而抑制其生長(zhǎng)。 為了消除無(wú)光照時(shí)高濃度CO2對(duì)微藻生長(zhǎng)所產(chǎn)生的抑制作用，必須調(diào)控藻液的pH 值。 有研究表明， 在培養(yǎng)小球藻的過(guò)程中， 向藻液中添加NaOH 調(diào)控藻液的pH 值能夠提高小球藻的生物量[13]。 但是，通過(guò)向藻液中添加堿來(lái)控制藻液的pH 值，堿的消耗或循環(huán)利用會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)工藝的復(fù)雜化且成本上升。 本研究通過(guò)調(diào)節(jié)光照和CO2的通氣時(shí)間來(lái)調(diào)控藻液的pH 值。 在關(guān)閉光源前2 h停止通入CO2氣體，使藻液中部分多余的CO2在2 h 內(nèi)通過(guò)微藻的光合作用消耗掉，從而使得無(wú)光照時(shí)藻液的pH 值維持在一個(gè)適宜的范圍內(nèi)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 采用該方法調(diào)節(jié)藻液的pH 值時(shí)，F(xiàn)ACHB-9 生長(zhǎng)良好。

不同培養(yǎng)條件下， 藻液pH 值的變化曲線(xiàn)如圖4 所示。

圖4 藻液的pH 值在不同條件下的變化情況Fig.4 Changes of culture medium pH in different conditions

從圖4 可以看出：在光照條件下，SMGC 組和GCC 組的藻液pH 值為5~6， 而SMG 組和GC 組的藻液pH 值為9~10； 當(dāng)停止光照約5 h 后，4 種培養(yǎng)條件下的藻液pH 值均變?yōu)?.5 左右。在光照條件下，SMG 組的藻液pH 值低于GC 組，當(dāng)停止通入CO2后，SMGC 組的藻液pH 值的上升速度明顯比GCC 組快。這可能是因?yàn)樵谀M的微重力條件下，微藻生長(zhǎng)得更快，消耗得CO2更多。

2.3 FACHB-9 的油脂積累速率及脂肪酸組成

FACHB-9 在不同條件下培養(yǎng)120 h 后， 其油脂含量和油脂積累速率見(jiàn)表1。

表1 蛋白核小球藻在不同培養(yǎng)條件下的油脂含量與積累速率Table 1 Lipid content and accumulation rate of Chlorella pyrenoidosa under different cultivation conditions

由表1 可知：SMGC 組的油脂含量為23.2%，比相應(yīng)的GCC 組稍低，但是SMGC 組的油脂積累速率是4 種培養(yǎng)條件中最高的； 與GC 組相比， GCC，SMG 和SMGC 組的油脂積累速率分別提高了361%，202%和536%。 以上結(jié)果表明，模擬的微重力條件以及高濃度的CO2氣體對(duì)微藻的油脂積累速率有明顯的促進(jìn)作用。

不同培養(yǎng)條件下，F(xiàn)ACHB-9 油脂的主要脂肪酸組成見(jiàn)表2。 由表2 可知：C14，C15，C16 和C18這4 種脂肪酸占FACHB-9 總脂肪酸含量的98%以上，在4 種不同培養(yǎng)條件下，C14 和C15 含量的差異不顯著；SMGC 組和GCC 組的C18∶0 和C18∶2的含量顯著低于SMG 組和GC 組， 而SMGC 組和GCC 組的C18∶3 含量顯著高于SMG 組和GC 組。相較于普通條件， 在模擬的微重力條件下，F(xiàn)ACHB-9 中不飽和脂肪酸（尤其是C18∶3）的含量顯著下降。 如果將提取的油脂作為生產(chǎn)生物柴油的原料， 不飽和脂肪酸含量的下降會(huì)增加生物柴油的十六烷值， 這有利于提高生物柴油的氧化穩(wěn)定性。

表2 不同培養(yǎng)條件下蛋白核小球藻油脂的主要脂肪酸組成Table 2 Main fatty acid compositions in Chlorella pyrenoidosa under different cultivation conditions

2.4 FACHB-9 的固碳效率

FACHB-9 在不同培養(yǎng)條件下的總碳含量及相應(yīng)的固碳效率見(jiàn)表3。

表3 不同培養(yǎng)條件下蛋白核小球藻的碳含量及固碳效率Table 3 Carbon contents and carbon fixations efficiency of Chlorella pyrenoidosa under different cultivation conditions

由表3 可知， 在不同培養(yǎng)條件下，F(xiàn)ACHB-9的固碳效率差異顯著，SMGC 組的固碳效率最大，可達(dá)19.3 mg/（L·h）， 而GC 組的固碳效率僅為2.64 mg/（L·h）。 在不同CO2濃度下，F(xiàn)ACHB-9 的生長(zhǎng)速率、 脂肪酸含量和固碳效率等的變化規(guī)律和文獻(xiàn)[11]的研究結(jié)論相一致。 與普通條件相比，在模擬的微重力條件下利用CO2培養(yǎng)FACHB-9時(shí)，由于微重力條件和CO2對(duì)微藻的生長(zhǎng)具有協(xié)同促進(jìn)作用，微藻的生長(zhǎng)速率顯著加快，因此，盡管微藻的脂肪酸含量及總碳含量變化不大， 但固碳效率顯著提高。

2.5 FACHB-9 的細(xì)胞形態(tài)

為了更好地了解微重力條件和CO2對(duì)FACHB-9 生長(zhǎng)的影響，采用SEM 對(duì)FACHB-9細(xì)胞進(jìn)行了觀察，結(jié)果見(jiàn)圖5。 由圖5 可以看出，F(xiàn)ACHB-9 在不同培養(yǎng)條件下的細(xì)胞表面形態(tài)各不相同。GC 組的FACHB-9 細(xì)胞呈球形且表面光滑；GGC 組的FACHB-9 細(xì)胞較為扁平；SMGC 組和GCC 組的FACHB-9 細(xì)胞表面粗糙而且附著一些細(xì)小晶體，細(xì)胞表面附著的晶體可能是高濃度的CO2導(dǎo)致微藻細(xì)胞鈣化形成的CaCO3晶體[14]。 微藻細(xì)胞的鈣化可為其葉綠體獲取CO2降低能量消耗，從而有利于光合作用。 在微重力條件下，F(xiàn)ACHB-9 細(xì)胞發(fā)生變形，SMG 組的FACHB-9 細(xì)胞變形尤其明顯，在細(xì)胞表面可以看到明顯的褶皺，而微藻在太空中培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞表面容易發(fā)生褶皺[15]。但SMGC 組的FACHB-9 細(xì)胞表面并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的褶皺， 可能是因?yàn)橥ㄈ敫邼舛鹊腃O2后，F(xiàn)ACHB-9 細(xì)胞的光合作用增強(qiáng)， 從而擁有更多的能量去維持細(xì)胞形態(tài)。

圖5 蛋白核小球藻在不同培養(yǎng)條件下的細(xì)胞形態(tài)Fig.5 Cell morphology of Chlorella pyrenoidosa cultivated in different conditions

微重力條件和高濃度的CO2不僅改變了FACHB-9 細(xì)胞的形貌， 而且對(duì)藻細(xì)胞的大小也會(huì)產(chǎn)生影響。 在不同培養(yǎng)條件下，蛋白核小球藻細(xì)胞的直徑分布如圖6 所示。 從圖6 可以看出：GCC 組與SMGC 組的FACHB-9 細(xì)胞直徑為1.80~3.85 μm，GC 組和SMG 組的FACHB-9 細(xì)胞直徑為1.21~3.20 μm。 GCC 組與SMGC 組的FACHB-9 細(xì)胞的平均直徑分別為2.57 μm 和2.72 μm，二者均比GC 組和SMG 組的FACHB-9細(xì)胞直徑大，可能是因?yàn)橥ㄈ隒O2后，F(xiàn)ACHB-9細(xì)胞的鈣化導(dǎo)致其體積增加。

圖6 在不同培養(yǎng)條件下，蛋白核小球藻細(xì)胞的直徑分布Fig.6 Distributions of diameter size of Chlorella pyrenoidosa cultivated in different conditions

3 結(jié)論

微重力條件和CO2對(duì)蛋白核小球藻的生長(zhǎng)具有協(xié)同促進(jìn)作用。 與普通環(huán)境下采用空氣培養(yǎng)蛋白核小球藻相比， 微重力環(huán)境下通入濃度為10%的CO2培養(yǎng)蛋白核小球藻120 h 后， 蛋白核小球藻的生物量濃度提高了178%。 不同培養(yǎng)條件下，蛋白核小球藻的油脂含量變化不大，但生物量的大幅提高導(dǎo)致蛋白核小球藻的油脂積累速率和固碳效率顯著升高。 同時(shí)，高濃度的CO2會(huì)導(dǎo)致蛋白核小球藻的不飽和脂肪酸含量上升， 而微重力條件則會(huì)使其不飽和脂肪酸含量下降。