龔受基,蒙彥妃,曹惠怡,劉忠義

(北部灣大學(xué)食品工程學(xué)院,廣西欽州 535011)

凡納濱對(duì)蝦(penaeusvannamei)是當(dāng)今世界養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大蝦類之一,不僅營養(yǎng)豐富、肉質(zhì)鮮美,還具有很高的營養(yǎng)價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)對(duì)蝦水解物中存在二肽基肽酶IV和脯氨酸寡肽酶抑制劑,可以獲得可溶性蛋白質(zhì)/肽、潛在的降血糖和抗抑郁化合物(DPP-IV和PO抑制肽),具有潛在的保健食品開發(fā)功能[1-2]。

高脂血癥是現(xiàn)代社會(huì)代謝性疾病的典型癥狀,大多表現(xiàn)為肥胖、BMI高、血清中膽固醇或甘油三酯含量高,高脂血癥易誘發(fā)心腦血管疾病,屬于現(xiàn)代公共衛(wèi)生的重大問題。傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)和科學(xué)研究表明,魚蛋白等多種來源蛋白質(zhì)能夠降低膽固醇和甘油三酯,改善高脂血癥[3]。鯡魚魚子蛋白不但降低小鼠的脂質(zhì)水平,而且改善葡萄糖代謝[4]。魚蛋白的酶解產(chǎn)物降低了膽固醇膠束溶解性,增加了膽汁酸結(jié)合能力,通過增加糞便膽固醇和膽汁酸排泄從而達(dá)到降膽固醇的目的[5]。魚蛋白對(duì)血漿和肝臟脂質(zhì)水平影響機(jī)制多樣,但有證據(jù)表明與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝平衡的基因表達(dá)相關(guān)[6-7]。牡蠣蛋白水解物可以降低脂肪酸合成酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性,抑制脂肪生成而降低甘油三酯水平[8]。以抑制蛋白自溶的魷魚勻漿為添加劑,可以降低大鼠血清甘油三酯和膽固醇,其機(jī)制與調(diào)節(jié)小腸血脂代謝、抑制肝臟脂肪生成有關(guān)[9]。蝦、魷魚、章魚作為蛋白質(zhì)分別添加到基礎(chǔ)飲食中,所有實(shí)驗(yàn)組小鼠的膽固醇水平都有不同程度降低[10]。

降脂研究方法較多,主要有動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、化學(xué)方法實(shí)驗(yàn)等,動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)降脂研究過程煩雜、實(shí)驗(yàn)條件要求高,而體外化學(xué)降脂評(píng)價(jià)對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求較低,主要從作用機(jī)制出發(fā),一般實(shí)驗(yàn)室都可以完成,不失為降脂成分篩選的有效方法,可以對(duì)大規(guī)模樣品進(jìn)行快速篩選。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)不同等電點(diǎn)凡納濱對(duì)蝦蛋白的體外降脂作用進(jìn)行了初步研究,以膽酸鹽吸附能力、胰脂肪酶抑制率、降膽固醇作用、膽固醇酯酶反應(yīng)作用等為研究指標(biāo),對(duì)凡納濱對(duì)蝦蛋白不同pH沉淀組分降脂特征進(jìn)行研究,以期為凡納濱對(duì)蝦的開發(fā)及其保健作用研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活對(duì)蝦 采購于廣西壯族自治區(qū)欽州市欽南區(qū)城東市場(chǎng),經(jīng)北部灣大學(xué)海洋學(xué)院方懷義副教授鑒定為凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei);福林酚試劑、橄欖油、膽固醇酯酶(≥300 U/g) 阿拉丁試劑(上海)有限公司;?；悄懰徕c、胰脂肪酶(來自豬胰臟,≥500 U/mg) 東京化成工業(yè)株式會(huì)社;甘氨膽酸鈉、脫氧膽酸鈉 九鼎化學(xué)(上海)科技有限公司;考來烯胺 武漢東康源有限公司;胃蛋白酶(≥1200 U/g) 上海展云化工有限公司;胰蛋白酶(4000 U/g) 北京奧博星生化科技有限公司;結(jié)晶牛血清白蛋白 上海新睿生物科技有限公司;膽固醇 阿法埃莎(天津)化學(xué)有限公司;對(duì)硝基苯基丁酸酯 天津希恩思生化科技有限公司。

CVCFD5-3冷凍干燥器 SIM(美國)國際集團(tuán)有限公司;Mikro220R冷凍離心機(jī) 德國Hettich科學(xué)儀器有限公司;1800可見光分光光度計(jì) 尤尼科(上海)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 將采購鮮活的凡納濱對(duì)蝦清洗干凈,然后放置于冷凍干燥托盤中于冰箱冷凍層預(yù)凍一晝夜,接著取出冷凍好的凡納濱對(duì)蝦放進(jìn)冷凍干燥器進(jìn)行冷凍干燥3 d,最后將冷凍干燥好的凡納濱對(duì)蝦用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎,收集好備用。

1.2.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 參照Folin-試劑盒說明,以結(jié)晶牛血清蛋白為對(duì)照品,測(cè)定凡納濱對(duì)蝦蛋白質(zhì)含量。

新鮮對(duì)蝦勻漿,稱取0.5 g對(duì)蝦勻漿分散于20 mL蒸餾水,攪拌后過濾得濾液。吸取0.5 mL濾液于50 mL容量瓶中,定容。量取上述定容好的溶液1 mL于試管中,加Folin-試劑甲5.0 mL,30 ℃條件下反應(yīng)10 min,然后加Folin-試劑乙0.5 mL,30 ℃條件下反應(yīng)30 min,反應(yīng)結(jié)束后于500 nm處測(cè)吸光度值,測(cè)定三組取平均值。

樣品中蛋白質(zhì)含量(mg/g)=C×V1×V2×W×1000

式(1)

式中,C:查標(biāo)準(zhǔn)曲線值(μg);V1:提取液總體積(mL);V2:測(cè)定時(shí)吸取體積(mL);W:樣品重量(g)。

1.2.3 凡納濱對(duì)蝦蛋白分離 參考Chen等[1]提取分離蛋白質(zhì)方法并加以修改,對(duì)蛋白質(zhì)最佳堿溶pH進(jìn)行研究。取6個(gè)250 mL三角瓶并編號(hào),按1∶10的比例稱取2 g凡納濱對(duì)蝦粉末溶于20 mL預(yù)冷過的蒸餾水中,分別用0.2 mol/L氫氧化鈉溶液將三角瓶內(nèi)溶液的pH調(diào)至8.0、9.0、10.0、11.0、12.0和13.0,然后用快速混勻器振蕩3 min,冰浴條件下攪拌30 min后,10000 r/min、4 ℃離心15 min,分別收集6種pH的沉淀和上清液,上清液采用福林酚法測(cè)定吸光值,計(jì)算出上清液蛋白質(zhì)含量,沉淀蛋白質(zhì)量由溶液中蛋白總質(zhì)量減去上清液中蛋白質(zhì)量所得,根據(jù)6種操作的沉淀蛋白質(zhì)量篩選出最佳堿溶pH。在上述操作中,分別收集pH8的沉淀和上清液;然后把沉淀溶于水,鹽酸調(diào)整pH至中性,冷凍干燥得pH8組分。收集pH8組分后的上清液采用福林酚法測(cè)定吸光度值,計(jì)算出蛋白質(zhì)含量。該上清液用堿調(diào)整pH為9.0,如上述操作收集沉淀干燥得pH9組分,收集pH9組分后的上清液同樣測(cè)定吸光度,計(jì)算pH9組分質(zhì)量。參照上述操作分別分離得pH10、pH11、pH12和pH13組分。

在上述篩選最佳堿溶pH研究中,pH為10時(shí)蛋白質(zhì)含量最高,確定最佳堿溶pH為10。重新取對(duì)蝦粉末溶于水中,調(diào)整pH為10。然后用0.1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至3.0,10000 r/min、4 ℃離心15 min,分別收集沉淀和上清液,上清液采用福林酚法測(cè)定吸光值。收集的沉淀調(diào)節(jié)pH至中性,冷凍干燥得pH3組分;收集pH3組分后的上清液用堿調(diào)整pH為4.0,如上述操作收集沉淀干燥得pH4組分。參照上述操作分別得組分pH5、pH6和pH7組分。

對(duì)分離得到的pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9、pH10等組分進(jìn)行針對(duì)膽酸鹽、胰脂肪酶、膽固醇和膽固醇酯酶等體系進(jìn)行體外降脂作用研究。

1.2.4 蛋白組分對(duì)膽酸鹽吸附能力的測(cè)定 參考劉淑敏等[11]方法并加以修改,對(duì)膽酸鹽吸附能力進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4.1 蛋白組分對(duì)牛磺膽酸鈉吸附能力的測(cè)定 取12支25 mL試管,編號(hào)后分別加入2 mg/mL的考來烯胺溶液0.0、0.2、0.4、0.8、1.0 mL,用蒸餾水補(bǔ)足1 mL,使每支試管中考來烯胺含量分別為0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg。接著加4 mL模擬胃液,放在37 ℃水浴消化60 min。然后用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液至pH=6.3,緊接著加入模擬腸液4 mL繼續(xù)在37 ℃水浴消化60 min。隨后加4 mL牛磺膽酸鈉溶液繼續(xù)在37 ℃水浴中反應(yīng)60 min后取出,在40000 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min。取2.5 mL離心后的上清液放于干凈的25 mL試管中,加7.5 mL 60%的硫酸,在70 ℃水浴中水浴20 min后取出立即冰浴5 min,在387 nm處測(cè)吸光度值。根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算考來烯胺吸附牛磺膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線。

稱取0.1 g冷凍干燥蛋白粉末,溶于100 mL蒸餾水中,吸取1 mL樣液,加入4 mL模擬胃液,在37 ℃水浴消化60 min后,用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH=6.3,接著加入4 mL模擬腸液繼續(xù)在37 ℃水浴消化60 min后,再加4 mL牛磺膽酸鈉溶液,在37 ℃水浴中反應(yīng)60 min,取出后4000 r/min離心20 min,取2.5 mL上清液放于干凈的25 mL試管中,加7.5 mL 60%的硫酸,70 ℃水浴20 min后立即冰浴5 min,在387 nm測(cè)定吸光度值,計(jì)算蛋白樣品對(duì)?；悄懰徕c的吸附。

ΔC=C0-C

式(2)

式中,ΔC:蛋白樣品對(duì)?；悄懰徕c的吸附濃度;C0:加入?；悄懰徕c濃度;C:反應(yīng)后上清液牛磺膽酸鈉濃度。

參考考來烯胺吸附牛磺膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線,然后以蛋白樣品和考來烯胺濃度均為1 mg/mL時(shí)對(duì)?；悄懰徕c吸附率的相對(duì)百分率衡量蛋白吸附能力。

式(3)

式中,Ac:蛋白對(duì)?；悄懰徕c的相對(duì)吸附能力;Ar:1 mg/mL蛋白樣品對(duì)?；悄懰徕c吸附率;Aro:1 mg/mL考來烯胺對(duì)?；悄懰徕c吸附率。

1.2.4.2 蛋白樣品對(duì)甘氨膽酸鈉吸附能力的測(cè)定 以甘氨膽酸鈉替代?；悄懰徕c按上述操作測(cè)定考來烯胺吸附甘氨膽酸鈉方程;同時(shí)按照上述蛋白樣品吸附甘氨膽酸鈉操作,按式(2)和式(3)計(jì)算蛋白樣品相對(duì)考來烯胺吸附甘氨膽酸鈉能力。

1.2.4.3 蛋白樣品對(duì)脫氧膽酸鈉吸附能力的測(cè)定 以脫氧膽酸鈉替代?；悄懰徕c按上述操作得測(cè)定考來烯胺吸附脫氧膽酸鈉方程;同時(shí)按照上述蛋白樣品吸附甘氨膽酸鈉操作,按式(2)和式(3)計(jì)算蛋白樣品相對(duì)考來烯胺吸附脫氧膽酸鈉能力。

1.2.5 蛋白組分對(duì)胰脂肪酶的抑制作用測(cè)定 參考蘇建輝[12]方法并略加修改,對(duì)胰脂肪酶的活性作用進(jìn)行測(cè)定。

取250 mL三角瓶數(shù)個(gè),每瓶加入5 mL 0.025 mol/L且pH=7.5的磷酸緩沖液1 mL橄欖油作為底物,置于40 ℃水浴保溫5 min,然后加入2 mg/mL的胰脂肪酶溶液1 mL(空白不加),反應(yīng)15 min后立即加95%的乙醇終止反應(yīng),加1%的酚酞2～3滴,用0.025 mol/L的氫氧化鈉溶液滴定至淡紅色,且30 s內(nèi)不變色即為滴定終點(diǎn),讀取氫氧化鈉溶液消耗量并計(jì)算抑制率。

胰脂肪酶抑制率(%)=100×(A空白管-A空白對(duì)照管-(A樣品管-A樣品對(duì)照管))/(A空白管-A空白對(duì)照管)

式(4)

1.2.6 蛋白組分清除膽固醇能力測(cè)定 參考李妍等[13]方法降膽固醇作用試驗(yàn)方法,并略加修改進(jìn)行降膽固醇作用測(cè)定。

準(zhǔn)確吸取0.8 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)膽固醇工作液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于25 mL試管中,然后用冰乙酸補(bǔ)足4 mL,接著沿著試管壁加入0.01 mol/L的硫酸亞鐵溶液2 mL,搖勻靜置60 min后,在560 nm處測(cè)定吸光度值。以膽固醇含量為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

稱取0.1 g冷凍干燥的蛋白質(zhì)樣品,溶解并定容100 mL,吸取1 mL于干凈的25 mL試管中,然后加入0.8 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)膽固醇溶液1 mL,冰乙酸3 mL,0.01 mol/mL的硫酸亞鐵溶液2 mL,搖勻靜置60 min后在560 nm處測(cè)定吸光度值。以加入膽固醇濃度減去反應(yīng)后膽固醇濃度即為清除的膽固醇濃度,計(jì)算清除的膽固醇百分?jǐn)?shù)。

1.2.7 蛋白組分對(duì)膽固醇酯酶的抑制活性測(cè)定 參考蘇建輝等[14]方法,略加修改,對(duì)膽固醇酯酶抑制活性作用進(jìn)行測(cè)定。

按表1加樣溶液和體積于25 mL的干凈試管中,最后加入胰膽固醇酯酶溶液1 mL啟動(dòng)反應(yīng),30 min后在405 nm處測(cè)吸光度值,計(jì)算膽固醇酯酶抑制率。

表1 膽固醇酯酶抑制作用測(cè)定加樣表(mL)Table 1 Samples table for cholesterol esterase inhibition test(mL)

膽固醇酯酶抑制率(%)=100×(A空白管-A空白對(duì)照管-(A樣品管-A樣品對(duì)照管))/(A空白管-A空白對(duì)照管)

式(5)

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所述所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次,結(jié)果以多次重復(fù)平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦粉樣品中蛋白質(zhì)含量

以結(jié)晶牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn),福林酚法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為y=0.2846x+0.0871,R2=0.9954,相關(guān)性好。凡納濱對(duì)蝦富含蛋白質(zhì),本實(shí)驗(yàn)中對(duì)蝦蛋白質(zhì)含量為18.40%,與張高靜等[15]測(cè)試值相當(dāng),但低于彭永興等[16]測(cè)試值。本實(shí)驗(yàn)蛋白檢測(cè)以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)、福林酚方法檢測(cè),張高靜、彭永興則采用國標(biāo)方法檢測(cè),數(shù)值差異原因可能與檢測(cè)方法、來源地有關(guān)。凡納濱對(duì)蝦蛋白質(zhì)含量高于鯉魚、武昌魚、草魚、羅非魚、黃顙魚、匙吻鱘等,與太陽魚、鳙魚、烏鱧、鲇魚相當(dāng),而低于鯽魚、鱸魚,從不同目來看,高于鯉形目、鯰形目、鱘形目,低于鱸形目[17]。王煜坤等[18]研究測(cè)定的羅非魚蛋白含量顯著高于凡納濱對(duì)蝦,而其他研究者測(cè)定含量在15.38%～18.01%間,可能與檢測(cè)品種不同有關(guān)[19]。

2.2 不同等電點(diǎn)分離的蝦蛋白含量

由于蛋白等電點(diǎn)不同,調(diào)整蛋白溶液pH,不同等電點(diǎn)的蛋白可以沉淀分離出來,不同等電點(diǎn)蛋白含量見圖1。等電點(diǎn)PI<7的蛋白質(zhì)為酸性蛋白,凡納濱對(duì)蝦中酸性蛋白含量比例最高的是pH10組分,高達(dá)87.3 mg/g,其他組分含量存在差異,但差異不大,酸性蛋白總量為474.5 mg/g;于最佳堿溶濃度pH10溶解對(duì)蝦蛋白后,依次調(diào)整上清液酸堿度為pH3、pH4、pH5、pH6、pH7,分離得蛋白分別為pH3、pH4、pH5、pH6、pH7組分,該部分蛋白PI≥7,為堿性蛋白質(zhì),含量最高的為pH5組分,含量高達(dá)91.1 mg/g,而其他組分含量不等,各個(gè)組分蛋白總量為285.7 mg/g,總蛋白以酸性蛋白質(zhì)為主。對(duì)中國對(duì)蝦[20]和凡納濱對(duì)蝦[21]蛋白的研究發(fā)現(xiàn),兩種對(duì)蝦蛋白的酸堿氨基酸含量相差幅度不同,但谷氨酸、天冬氨酸等酸性氨基酸比精氨酸、組氨酸、賴氨酸等堿性氨基酸含量高,暗示對(duì)蝦蛋白中酸性蛋白含量會(huì)比堿性蛋白含量高,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相符。

圖1 不同等電點(diǎn)的凡納濱對(duì)蝦蛋白質(zhì)含量Fig.1 Protein content of Penaeus vannameiat different isoelectric points

2.3 蛋白組分對(duì)膽酸鹽吸附能力

以考來烯胺為橫坐標(biāo)、吸附率為縱坐標(biāo)得考來烯胺吸附?；悄懰徕c回歸方程y=0.4178x+0.0104,R2值為0.9976;考來烯胺吸附甘氨膽酸鈉回歸方程為y=0.357x+0.1109,R2值為0.9981;考來烯胺吸附脫氧膽酸鈉回歸方程y=0.416x+0.0691,R2值為0.9488。

圖2表明,不同的凡納濱對(duì)蝦蛋白組分(pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9、pH10)相對(duì)于考來烯胺對(duì)牛磺膽酸鈉的吸附能力不等,不同組分對(duì)?；悄懰徕c的吸附率在45%～86%間,以pH4、pH6、pH9較高,超過了85%,pH6的吸附率最高為91.3%,而pH10吸附率僅45%,作用不大。

圖2 蛋白組分對(duì)?；悄懰徕c吸附作用Fig.2 Adsorption of sodium taurincholate by protein samples

如圖3所示,蛋白組分對(duì)甘氨膽酸鈉吸附能力差別大,pH4、pH8、pH9組分吸附作用較小,分別為4%、9%和16%,pH7、pH10有一定的吸附作用,而pH5、pH6具有較強(qiáng)的吸附作用,其中對(duì)甘氨膽酸鈉吸附能力最強(qiáng)的是pH6,為75.1%,具有較好的吸附甘氨膽酸鈉能力。

圖3 蛋白組分對(duì)甘氨膽酸鈉吸附作用Fig.3 Adsorption of sodium glycate by protein samples

對(duì)脫氧膽酸鈉吸附能力較好的是pH4(63%)、pH6(52%),具有一定的應(yīng)用價(jià)值。而其他組分pH5(43%)、pH7(38%)、pH10(37%)也具有一定的吸附作用,但吸附作用較弱,而pH8(20%)、pH9(21%)對(duì)脫氧膽酸鈉的吸附作用很弱。

膽汁酸是膽固醇的代謝物,增加膽汁酸分泌可以降低膽固醇水平[22]。膽汁酸具有親水基團(tuán)和疏水基團(tuán),疏水基團(tuán)可以與蛋白質(zhì)的疏水部分結(jié)合[23],疏水性決定其結(jié)合力大小[24]。一旦膽汁酸與蛋白質(zhì)結(jié)合,被小腸重吸收機(jī)率降低,促進(jìn)膽固醇向生成膽汁酸方向進(jìn)行,排出體外,從而降低體內(nèi)膽固醇含量。利用疏水性氨基酸容易與膽酸鹽疏水基團(tuán)結(jié)合的特點(diǎn),設(shè)計(jì)體外試驗(yàn),評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)或者多肽的清除膽固醇能力。

圖4 蛋白組分對(duì)脫氧膽酸鈉吸附作用Fig.4 Absorption of sodium deoxycholate by protein samples

對(duì)蝦蛋白按照酸堿性分離成多個(gè)組分后,其酸堿性與膽酸鹽的結(jié)合能力并沒有表現(xiàn)出相關(guān)性。羽扇豆蛋白對(duì)膽酸鹽的結(jié)合雖然沒有選擇性,但是酸溶性蛋白與?；悄懰徕c、脫氧膽酸鈉和甘氨膽酸鈉的結(jié)合力比酸不溶性蛋白大[25]。其原因可能與膽酸鹽-蛋白結(jié)合力、氨基酸的疏水性相關(guān),氨基酸的疏水性能夠促進(jìn)與膽汁酸的結(jié)合[25];膽酸鹽-蛋白結(jié)合力也與Arg/Lys比值密切相關(guān),高Arg/Lys對(duì)膽酸鹽的結(jié)合力更強(qiáng)[26],但是這種結(jié)合能力可能還包括蛋白肽長度貢獻(xiàn)在內(nèi)[27]。

對(duì)蝦蛋白對(duì)?；悄懰徕c的吸附作用相對(duì)較好,對(duì)甘氨膽酸鈉和脫氧膽酸鈉的吸附能力各異,與某些植物蛋白容易結(jié)合甘氨膽酸鈉和脫氧膽酸鈉、難結(jié)合?；悄懰徕c有差異[28]。其原因可能與對(duì)蝦蛋白中某些氨基酸比例與結(jié)合能力相關(guān),對(duì)蝦蛋白中Arg/Lys比值比較大[21],有利于與膽酸鹽的結(jié)合。

2.4 蛋白組分對(duì)胰脂肪酶的抑制作用

如圖5所示，分離蛋白組分pH6、pH7對(duì)胰脂肪酶活性具有較好的抑制作用,前者抑制率為60.1%、后者抑制率76.8%。胰脂肪酶主要在小腸內(nèi)發(fā)揮作用,分解甘油三酯為甘油和脂肪酸,利于脂肪在小腸中被吸收。能量代謝性疾病常與脂肪代謝有關(guān)系,當(dāng)出現(xiàn)高脂血癥時(shí),胰脂肪酶被當(dāng)作治療靶標(biāo),通過抑制胰脂肪酶的活性調(diào)整脂肪代謝,從而改善高脂血癥狀。胰脂肪酶催化活性中心并不暴露在外,而是被疏水基團(tuán)組成的表面層隱藏[29]。當(dāng)胰脂肪酶與底物接觸時(shí),通過電子分布的改變誘導(dǎo)胰脂肪酶三維結(jié)構(gòu)改變,使活性中心暴露而出,與底物結(jié)合發(fā)生催化反應(yīng)。分離蛋白pH6、pH7能夠抑制胰蛋白酶活性,說明pH6、pH7的化學(xué)結(jié)構(gòu)能夠阻止電子改變,或者使催化活性中心處于氨基酸基團(tuán)的保護(hù),使其無法與外界物質(zhì)接觸。

圖5 蛋白組分對(duì)胰脂肪酶抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of protein samples on pancreatic lipase

2.5 蛋白組分對(duì)膽固醇的清除效果

根據(jù)膽固醇對(duì)吸光度的關(guān)系擬合得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.4871x+0.0299,R2=0.9968。測(cè)定蛋白組分對(duì)膽固醇的結(jié)合量,從而計(jì)算清除作用,評(píng)估凡納濱對(duì)蝦蛋白組分清除膽固醇效果。

圖6 蛋白組分對(duì)膽固醇清除作用Fig.6 Cholesterol scavenging effect of protein samples

膽固醇不溶于水,但易與疏水基團(tuán)結(jié)合,當(dāng)其與蛋白質(zhì)中的疏水基團(tuán)結(jié)合后,阻礙了膽固醇在小腸中的分解和吸收,使膽固醇停留在小腸中,隨著食物殘?jiān)懦?。?duì)蝦蛋白各組分蛋白對(duì)膽固醇均有較好的吸附作用,吸附作用相差不大,吸附率在67.3%～83.9%之間。其中pH9對(duì)膽固醇的吸附率最高為83.9%,pH7對(duì)膽固醇的吸附率最低為67.3%。蛋白質(zhì)對(duì)膽固醇的吸附率可能與對(duì)蝦蛋白氨基酸組成種類和含量有關(guān),苯丙氨酸殘基等疏水性強(qiáng),則對(duì)膽固醇親和能力好,吸附率大;色氨酸殘基等疏水性弱,與膽固醇親和力差,吸附率低[30]。

2.6 蛋白組分對(duì)膽固醇酯酶的抑制作用

對(duì)蝦蛋白各組分對(duì)膽固醇酯酶的抑制率不同,從pH4的23%到pH10的83%,總體上呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。隨著等電點(diǎn)數(shù)值增加,即酸性氨基酸數(shù)目增加,其對(duì)膽固醇酯酶的抑制作用增加。膽固醇酯酶分子組成富含谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、脯氨酸、亮氨酸等氨基酸,谷氨酸、天冬氨酸為酸性氨基酸,其他三種為中性氨基酸,從總體看酶分子呈酸性[31]。蛋白與膽固醇酯酶之間物理作用力有酸堿離子間作用力、羧基間形成的氫鍵作用力,對(duì)蝦蛋白酸性越大,對(duì)膽固醇酯酶抵制率越高,可能是對(duì)蝦蛋白的酸性氨基酸與膽固醇分子中的酸性氨基酸的羧基形成氫鍵所致。

圖7 蛋白組分對(duì)膽固醇酯酶的抑制作用Fig.7 Inhibitory effect of proteinsamples on cholesterol esterase

蛋白質(zhì)經(jīng)過胃、小腸消化后水解為多肽,可能在體內(nèi)發(fā)揮抗氧化、降血壓功能[32],目前研究對(duì)象多數(shù)以水解多肽為主,對(duì)于闡明蛋白質(zhì)的生理功能機(jī)制具有重要作用。但實(shí)際上,蛋白質(zhì)并不能全部水解為氨基酸,大鼠對(duì)飼料添加的牛肉、魚蛋白消化利用率大約為80%[33],老人在餐后6 h內(nèi),碎牛肉、牛排消化利用率分別為61%和49%[34]。蛋白質(zhì)經(jīng)胃、胰酶催化水解后轉(zhuǎn)變?yōu)槎嚯?發(fā)揮生理活性的主要原因是氨基酸種類的序列,水解后的多肽具有活性,說明未水解前的蛋白質(zhì)具有該生理活性的氨基酸序列,定向酶解或者隨機(jī)水解都有可能得到活性多肽,利用蛋白作為研究對(duì)象在一定程度上能夠反映蛋白質(zhì)的生理活性,作為大規(guī)模篩選蛋白活性具有較大優(yōu)勢(shì)。

3 結(jié)論

體外研究模型針對(duì)不同降脂機(jī)制進(jìn)行,降甘油三酯機(jī)制主要從抑制胰脂肪酶、膽固醇酯酶活性角度進(jìn)行研究,凡納濱對(duì)蝦蛋白pH6、pH7等組分具有較好的抑制胰脂肪酶作用,適合制備適于血漿甘油三酯水平偏高人群服用產(chǎn)品;膽酸鹽吸附、膽固醇清除、膽堿酯酶活性抑制等主要用于研究降膽固醇作用,pH4、pH6、pH8、pH9等組分具有較好的降膽固醇作用;綜合考慮,pH6組分降甘油三酯、降膽固醇表現(xiàn)較好,是降脂最佳組分。但是從營養(yǎng)方面考慮,對(duì)蝦蛋白是一種優(yōu)質(zhì)蛋白資源,可以為人體提供優(yōu)質(zhì)蛋白和必需氨基酸,在進(jìn)行對(duì)蝦蛋白降脂產(chǎn)品開發(fā)時(shí)如必要可以另外考慮蛋白質(zhì)的使用。