周 軍，李魁印，張 立，彭 琴，徐如宏，任明見

(1.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/國家小麥改良中心貴州分中心，貴州 貴陽 550025;2.安順學(xué)院，貴州 安順 561000)

小麥條銹病是由條形柄銹菌(Pucciniastriiformisf.sp.Tritici)引起的氣傳性葉部病害[1]，具有發(fā)生強度高、流行范圍廣等特點，嚴重威脅我國小麥生產(chǎn)。實踐證明，選育與合理使用抗病品種是控制小麥條銹病最經(jīng)濟、安全、有效的措施。病原菌的高度變異性和抗性資源的不恰當(dāng)使用，致使生理小種基因突變或遺傳重組，與寄主協(xié)同進化[2]，克服寄主原有抗性。目前，小麥抗病育種面臨的主要問題是抗源匱乏、抗性遺傳基礎(chǔ)狹窄[3-4]。要解決上述問題，只有尋找新的抗源，挖掘潛在抗性基因，拓寬廣譜抗性基礎(chǔ)，增加其遺傳多樣性。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)小麥抗條銹基因共130個，其中被正式命名的抗性基因83個(全生育期抗性基因55個，成株期抗性基因28個)[5]。明確小麥種質(zhì)的抗性水平和抗病基因是實現(xiàn)小麥種質(zhì)合理布局、抗性基因有效利用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和重要前提。條中32(CYR32)和條中33(CYR33)成為條銹菌優(yōu)勢生理小種以來，對小麥抗源產(chǎn)生了巨大毒性[6-7]。目前，僅有少數(shù)抗條銹病基因(Yr10、Yr18、Yr26等)保持良好抗性[8-9]。在四川、甘肅等省相繼發(fā)現(xiàn)對抗條銹基因Yr26和Yr10具有聯(lián)合毒性的新菌株CM42-3、G22(代號V26)，極有可能上升為新的優(yōu)勢生理小種，對小麥生產(chǎn)造成巨大危害[10-11]。不斷發(fā)掘不同類型的抗源，促進小麥抗性基因的多樣化，是防治小麥條銹病的重要手段。近年來，國內(nèi)學(xué)者為此做了大量研究。韓德俊等[12]通過田間抗性鑒定和抗條銹病分子標(biāo)記對1 980份小麥種質(zhì)進行檢測，篩選出50份優(yōu)異的抗源種質(zhì)；周新力等[13]通過對80份國外春小麥種質(zhì)進行抗條銹病鑒定，發(fā)現(xiàn)80份種質(zhì)中大部分對當(dāng)前條銹病菌生理小種(CYR31、CYR33等)等表現(xiàn)出良好的抗性；李艷麗等[14]利用條銹菌生理小種條中32、條中33及混合菌種對67份引進的小麥種質(zhì)進行抗病鑒定，發(fā)現(xiàn)這批種質(zhì)含有豐富的抗條銹病基因；侯璐等[15-16]對81份春小麥種質(zhì)進行抗條銹病鑒定，發(fā)現(xiàn)具有全生育期抗性、成株期抗性的種質(zhì)僅有7、39份。綜上，目前尚未見對貴州省自育小麥材料和其他小麥材料同時進行抗條銹病鑒定和分子檢測的研究。為此，依托貴州省復(fù)雜的條銹菌源群體，對242份小麥材料進行田間成株期抗條銹病鑒定，旨在明確供試材料的抗性水平和抗性基因類型，綜合評價各抗源的利用價值，為合理使用、布局小麥種質(zhì)資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試小麥品種(品系)來自貴州、四川、山東、河南等省，共242份，輝縣紅為小麥條銹病感病對照，所有材料均由國家小麥改良中心貴州分中心保存并提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 成株期抗條銹病鑒定 在貴州大學(xué)教學(xué)試驗場國家小麥改良中心育種基地進行條銹病田間自然誘發(fā)試驗。對供試小麥材料進行條播，每份材料播種2行，每隔10行種植2行感病對照材料輝縣紅。當(dāng)感病品種充分發(fā)病后，進行田間病情調(diào)查。按照國家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(NY/T 1443.1—2007)進行小麥抗條銹病鑒定[17]。每份材料隨機調(diào)查50片葉，分別記錄病級、嚴重度及發(fā)病率，計算病情指數(shù)，共調(diào)查2次，2次調(diào)查間隔15 d。小麥病級分為7個等級：0；0’；1-、1、1+；2-、2、2+；3-4；3；4。抗性水平分為7個等級：免疫(I)、近免疫(NIM)、高抗(HR)、中抗(MR)、慢銹(SR)、中感(MS)、高感(HS)。

1.2.2 小麥基因組DNA的提取與分子檢測 將供試小麥材料穴播于裝有營養(yǎng)土的育苗盤內(nèi)，待其幼苗兩葉期剪取葉片，用改進CTAB法[18]提取基因組DNA，然后進行Yr基因檢測，用于檢測Yr基因的分子標(biāo)記引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

1.2.3 PCR擴增體系及產(chǎn)物檢測 PCR反應(yīng)體系為10 μL，包含10×buffer(含Mg2+)1 μL，上、下游引物各1 μL，Taq0.1 μL，dNTP 0.2 μL，DNA 2 uL，其余用雙蒸水補齊。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性40 s，50～60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35～40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。產(chǎn)物均用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，并在膠片觀察燈上觀察記錄擴增條帶。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理分析采用SPSS 17.0和Excel 2010。

表1 小麥Yr基因的分子標(biāo)記Tab.1 Molecular markers of wheat Yr genes

2 結(jié)果與分析

2.1 供試小麥材料成株期抗條銹評價

供試242份小麥材料的田間成株期抗條銹鑒定結(jié)果見表2，貴協(xié)2號、貴農(nóng)25號等116份材料在田間表現(xiàn)為成株期抗條銹病，占供試材料的47.93%。其中，表現(xiàn)免疫或近免疫的材料有貴農(nóng)19號、貴協(xié)3號等38份，占供試材料的15.70%；表現(xiàn)為高抗的材料有貴農(nóng)25號、川輻9號等41份，占16.94%；表現(xiàn)為中抗的有貴農(nóng)麥32號、貴農(nóng)28號等37份，占15.29%。表現(xiàn)慢銹的材料有1份，占0.41%。表現(xiàn)中感和高感的材料有125份，占51.65%。

表2 小麥材料成株期抗條銹鑒定及分子檢測結(jié)果Tab.2 Identification and molecular detection of resistance to stripe rust in wheat materials

續(xù)表2 小麥材料成株期抗條銹性鑒定及分子檢測結(jié)果Tab.2(Continued) Identification and molecular detection of resistance to stripe rust in wheat materials

續(xù)表2 小麥材料成株期抗條銹性鑒定及分子檢測結(jié)果Tab.2(Continued) Identification and molecular detection of resistance to stripe rust in wheat materials

續(xù)表2 小麥材料成株期抗條銹性鑒定及分子檢測結(jié)果Tab.2(Continued) Identification and molecular detection of resistance to stripe rust in wheat materials

續(xù)表2 小麥材料成株期抗條銹性鑒定及分子檢測結(jié)果Tab.2(Continued) Identification and molecular detection of resistance to stripe rust in wheat materials

續(xù)表2 小麥材料成株期抗條銹性鑒定及分子檢測結(jié)果Tab.2(Continued) Identification and molecular detection of resistance to stripe rust in wheat materials

續(xù)表2 小麥材料成株期抗條銹性鑒定及分子檢測結(jié)果Tab.2(Continued) Identification and molecular detection of resistance to stripe rust in wheat materials

續(xù)表2 小麥材料成株期抗條銹性鑒定及分子檢測結(jié)果Tab.2(Continued) Identification and molecular detection of resistance to stripe rust in wheat materials

續(xù)表2 小麥材料成株期抗條銹性鑒定及分子檢測結(jié)果Tab.2(Continued) Identification and molecular detection of resistance to stripe rust in wheat materials

2.2 242份小麥材料Yr基因的分子檢測

利用已知的抗條銹基因(Yr5、Yr10、Yr15、Yr18、Yr26)分子標(biāo)記對242份小麥材料進行檢測，以便明確其利用價值。

2.2.1Yr5和Yr10本研究利用MURPHY等[19]開發(fā)的SSR標(biāo)記Xwmc175檢測Yr5基因，結(jié)果顯示，貴農(nóng)28號、貴農(nóng)25號等52份材料含有該基因(表2)。利用邵映田等[20]開發(fā)的SCAR標(biāo)記SC200檢測Yr10基因，結(jié)果顯示，遺51485等14份材料檢測呈陽性(出現(xiàn)200 bp特異條帶)(圖1、表2)。

M：DNA Marker Ⅰ；1：輝縣紅；2：R802；3：貴農(nóng)28號；4：貴農(nóng)775；5：貴農(nóng)25號；6：西科麥10號；7：R205；8：遺51485；9：R232；10：貴麥1925；11：貴農(nóng)18-9；12：興育11043；13：貴農(nóng)麥32號Marker:DNA Marker Ⅰ;1:Huixianhong;2:R802;3:Guinong No.28;4:Guinong 775;5:Guinong No.25;6:Xikemai No.10;7:R205;8:Yi 51485;9:R232;10:Guimai 1925;11:Guinong 18-9;12:Xingyu 11043;13:Guinongmai No.32圖1 部分小麥材料的Yr10基因檢測Fig.1 Detection of Yr10 gene of some wheat materials

2.2.2Yr15和Yr18利用STS標(biāo)記Xbarc8[21]檢測Yr15基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有21份小麥材料檢測到該基因(表2)。利用STS標(biāo)記CsLv34[22]檢測Yr18基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)13份材料含有Yr18基因(擴增出150 bp特異條帶)(圖2、表2)。

M：DNA Marker Ⅰ；1：川麥1580；2：輝縣紅；3：貴農(nóng)28號；4：貴農(nóng)775；5：貴農(nóng)25號；6：西科麥10號；7：34ITSN-25；8：川麥602；9：KAUZ’S/FLORKWA-1；10：Cimrmanova；11：京771；12：HUBARA-5/AAGI-1；13：百農(nóng)3217；14：鯽魚麥；15：綿陽20；16：中科糯麥1號；17：川麥1456；18：139易2011-1M:DNA Marker Ⅰ;1：Chuanmai 1580;2:Huixianhong;3:Guinong No.28;4:Guinong 775;5:Guinong No.25;6:Xikemai No.10;7:34ITSN-25;8:Chuanmai 602;9:KAUZ’S/FLORKWA-1;10:Cimrmanova;11:Jing 771;12:HUBARA-5/AAGI-1;13:Bainong 3217;14:Jiyumai;15:Mianyang 20;16:Zhongkenuomai No.1;17:Chuanmai 1456;18:139yi2011-1圖2 部分小麥材料的Yr18基因檢測Fig.2 Detection of Yr18 gene of some wheat materials

2.2.3Yr26根據(jù)WU等[23]、王春梅[24]開發(fā)的STS標(biāo)記(Xwe173)檢測Yr26基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)59份材料含有Yr26基因(出現(xiàn)451 bp特異條帶)(圖3、表2)。

2.3 抗條銹小麥材料中Yr基因組合的分子檢測

由表2可知，同時檢測到含有2個抗病基因的材料39份，其中Yr26+Yr15組合1份(貴協(xié)2號)，Yr26+Yr18組合3份(中科糯麥1號等)，Yr26+Yr10組合1份(新麥13)，Yr26+Yr5組合22份(貴綠枝麥1號、貴農(nóng)19號等)，Yr5+Yr10組合1份(百農(nóng)3217)，Yr18+Yr10組合1份(RC63)，Yr18+Yr5組合4份(綿陽20、蜀麥830等)，Yr10+Yr15組合1份(興育11043)，Yr5+Yr15組合5份(黔麥19等)。7份材料能同時檢測到3個抗病基因，其中Yr26+Yr15+Yr5組合4份(貴農(nóng)775、蜀麥1731、貴協(xié)3號等)，Yr18+Yr15+Yr5組合1份(34ITSN-25)，Yr5+Yr18+Yr26組合1份(邯6172)，Yr5+Yr10+Yr26組合1份(西科麥10號)。同時含有4個抗病基因的材料1份，為Yr26+Yr15+Yr5+Yr10組合(80F-1-4-2)。檢測到含有多個抗性基因的小麥材料(貴協(xié)2號、貴農(nóng)19號等)在田間表現(xiàn)出高抗，甚至近免疫或免疫。

M：DNA Marker D2000；1：貴農(nóng)28號；2：貴農(nóng)775；3：貴農(nóng)25號；4：西科麥10號；5：貴協(xié)2號；6：貴紫麥1905；7：貴協(xié)3號；8：貴綠麥13；9：貴綠枝麥1號；10：豐優(yōu)7號；11：貴麥1925；12：36ITSN-148；13：(01)124-2-31；14：川麥602；15：衡關(guān)35；16：農(nóng)大36；17：蜀麥697；18：綿麥16250；19：川麥65；20：川麥604；21：蜀麥137M:DNA Marker D2000;1:Guinong No.28;2:Guinong 775;3:Guinong No.25;4:Xikemai No.10;5:Guixie No.2;6:Guizimai 1905;7:Guixie No.3;8:Guilümai 13;9:Guilüzhimai No.1;10:Fengyou No.7;11:Guimai 1925;12:36ITSN-148;13:(01)124-2-31;14:Chuanmai 602;15:Hengguan 35;16:Nongda 36;17:Shumai 697;18:Mianmai 16250;19:Chuanmai 65;20:Chuanmai 604;21:Shumai 137圖3 部分小麥材料的Yr26基因檢測Fig.3 Detection of Yr26 gene of some wheat materials

3 結(jié)論與討論

3.1 充分的發(fā)病條件是抗病鑒定的基礎(chǔ)和保障

由于貴州獨特的氣候與環(huán)境，使該地區(qū)的生理小種復(fù)雜多變且獨立流行，同時也是條銹菌主要越夏區(qū)[25]。因菌源量大，常年條銹病發(fā)生普遍且嚴重，可借助自然病圃鑒定小麥材料的條銹病抗性，掌握小麥材料在自然條件下對當(dāng)?shù)鼐慈后w的抗病表現(xiàn)[26]，以便抗病資源的合理有效利用。本研究通過對242份小麥材料進行田間自然誘發(fā)集中鑒定，篩選出116份成株期表現(xiàn)穩(wěn)定抗條銹病的材料，其中表現(xiàn)為免疫、近免疫、高抗和中抗的材料分別為11份、27份、41份和37份。傳統(tǒng)田間抗病鑒定只能鑒定小麥材料的表型抗性，且常因病原菌生理小種不足或其他因素影響抗病鑒定的可靠性和準確性，因此，需要借助分子檢測手段進行鑒定。

3.2 分子標(biāo)記檢測是抗病鑒定的必要手段

分子標(biāo)記檢測技術(shù)可有效明確抗性材料所含抗病基因的種類和抗性水平，有利于抗病種質(zhì)(基因)的科學(xué)合理利用。小麥抗條銹基因Yr5、Yr10、Yr18等對我國當(dāng)前主要流行生理小種條中32等有著良好的田間抗性，并且抗條銹基因Yr18已被證實與多個抗病基因位點連鎖，是具有持久抗譜的抗病基因,還抵御多種真菌病害[27]。本研究分子標(biāo)記檢測結(jié)果顯示，攜帶Yr5、Yr10、Yr15、Yr18、Yr26基因的材料分別有52、14、21、13、59份，分別占供試材料的21.49%、5.79%、8.68%、5.37%、24.38%；其余抗性材料未檢測到上述抗性基因，可能含有其他抗病基因。黃苗苗等[28]對小麥種質(zhì)資源進行抗條銹基因分子檢測，結(jié)果顯示，供試材料中攜帶Yr26基因的頻率較高(50.22%)，其余抗性基因的分布頻率較低。本研究中，用CsLv34標(biāo)記檢測到攜帶Yr18基因的小麥材料僅13份(占供試材料的5.37%)，在今后抗病育種中可加強對該基因的利用。針對某些抗條銹基因使用頻率高的情況，應(yīng)綜合利用不同類型的抗性基因，降低對條銹菌的選擇壓力，避免產(chǎn)生新的生理小種。

3.3 分子檢測有利于實現(xiàn)多個抗病基因聚合育種

不同抗性基因通過基因聚合手段實現(xiàn)有效結(jié)合，不僅可彌補抗性基因間的差異，還能提高抗病基因強度，延長抗性基因使用壽命，使抗病表現(xiàn)更加持久[29]。本試驗的研究結(jié)果表明，含有2個或3個抗病基因的材料，在田間均表現(xiàn)出優(yōu)異的抗病性，如貴農(nóng)19號、貴農(nóng)775、貴協(xié)3號等。寄主的抗病性與抗性基因的質(zhì)量、數(shù)量和遺傳背景有關(guān)，如小麥品種貴農(nóng)19號(黔審麥2007002)自2007年審定以來，高抗條銹、白粉病。在多個抗病基因聚合育種實踐中，僅憑田間抗性鑒定難以實現(xiàn)不同抗病基因的有效結(jié)合，建議結(jié)合分子檢測開展多個抗病基因的聚合育種。