馬錦濤，霍健聰

（浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江舟山 316022）

金槍魚(tuna)是一種大型遠(yuǎn)洋性重要商品食用魚，金槍魚肉色鮮紅，生活海域水體高度凈潔，使其成為一類肉味鮮美，營養(yǎng)豐富，食用安全性高的高品質(zhì)海水魚，被國際營養(yǎng)學(xué)會(huì)列為世界三大營養(yǎng)魚類之一[1-3]。近年來，隨著我國漁業(yè)不斷向遠(yuǎn)海進(jìn)發(fā)，金槍魚已成為國內(nèi)遠(yuǎn)洋漁業(yè)的重要捕撈對(duì)象，浙江舟山建立了國內(nèi)規(guī)模最大的“中國南方金槍魚交易中心”，并形成了以舟山為中心，輻射長三角地區(qū)的金槍魚捕撈、運(yùn)輸、交易和加工中心，金槍魚魚片等產(chǎn)品已成為浙江省特色農(nóng)產(chǎn)品之一。

目前，生魚片是金槍魚的主要加工產(chǎn)品，金槍魚魚片品質(zhì)的有效保持依賴于覆蓋加工、運(yùn)輸和銷售全程的超低溫冷鏈。由于技術(shù)和經(jīng)濟(jì)等原因，國內(nèi)金槍魚加工產(chǎn)業(yè)尚不能實(shí)現(xiàn)加工鏈中超低溫冷鏈的全程覆蓋，部分企業(yè)的金槍魚魚片產(chǎn)品在運(yùn)輸、銷售過程中由于部分冷鏈環(huán)節(jié)溫度升高而發(fā)生魚片品質(zhì)變差，甚至發(fā)生腐敗變質(zhì)，不僅引起重大經(jīng)濟(jì)損失，也給食品安全帶來重大隱患。本研究旨在通過對(duì)金槍魚魚片中主要腐敗菌的分離篩選，明確引起金槍魚魚片發(fā)生腐敗變質(zhì)的主要微生物，并初步建立基于溫度的金槍魚生魚片的貨架期預(yù)測(cè)模型，以期為金槍魚魚片的保藏提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

金槍魚魚片：由寧波大洋世家水產(chǎn)有限公司提供，原料為大眼金槍魚Thunnus obesus 選魚體背部赤身部位；原料裝入含有經(jīng)超低溫冰箱預(yù)凍結(jié)的冰袋的泡沫箱后，2 h 內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，并放在超低溫冰箱中，備用。

1.2 主要設(shè)備及型號(hào)

超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1D，蘇州凈化)；微生物培養(yǎng)箱(HWS-150，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；壓力蒸汽滅菌器(LDZM-40L-III，上海申安醫(yī)療器械廠)；生物顯微鏡(奧林巴斯BX-51，日本奧林巴斯)；超純水機(jī)(BDP-GS，南京權(quán)坤生物科技有限公司)；色差儀(CS-810，杭州彩譜科技有限公司)；其余均為試驗(yàn)室常用設(shè)備，所用的培養(yǎng)基及化學(xué)試劑均購自國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司，化學(xué)試劑為分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 揮發(fā)性鹽基氮(TVBN)的確定

樣品從超低溫冰箱中取出后，切成4 cm×4 cm×0.5 cm 規(guī)格的魚片，放在PE 保鮮膜覆蓋的泡沫盒中，置于0、-10 和-18 ℃條件下貯藏，定期取出測(cè)定TVBN，TVBN 的測(cè)定參考GB/T 5099.44-2003。

1.3.2 菌落總數(shù)的確定

樣品處理參照1.3.1。菌落總數(shù)的測(cè)定方法以GB/T 4789.2-2008 為標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.3 色差測(cè)定

生魚片色差測(cè)定采用色差儀。測(cè)定結(jié)果采用亮度L*、黃度b*、紅度a*和ΔE 表示，其中L*值越大則魚片亮度越大；a*值越大表示魚片紅色越深，a*值小則偏向綠色；b*值則指征魚片的黃色程度，數(shù)值大表明黃色深，反之則表明藍(lán)色深度大；ΔE 表示總色差，ΔE 越小表明魚片色澤越好。

其中ΔL*，Δa*，Δb*表示處理組同空白之間的差，以超低溫冷凍的金槍魚生魚片為空白。

1.3.4 生魚片貨架期的確定

食品貨架期是指在推薦條件下貯藏的食品，能保持高度的食品安全以及良好的感官和理化性質(zhì)等特性的時(shí)間。本研究參考上海市地方標(biāo)準(zhǔn)《生食動(dòng)物性海水產(chǎn)品(DB31/2013)》和國家標(biāo)準(zhǔn)《鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB 2733-2005)》，菌落總數(shù)超過105CFU·g-1或TVBN 超過30 mg·100-1·g-1時(shí)可看做貨架期終點(diǎn)。

1.3.5 生魚片菌相的確定[4,9]

從1.3.2 的平板上挑取單菌落進(jìn)行純化分離，而后對(duì)單菌落進(jìn)行生化特征分析。

1.3.6 生魚片貨架期方程的構(gòu)建[5]

首先構(gòu)建生魚片腐敗微生物的生長曲線模型，具體采用修正的Gompertz 方程：

式中，t 是培養(yǎng)時(shí)間(h)；N(t)是培養(yǎng)到t 小時(shí)的菌落總數(shù)；N0和Nmax分別是初始的菌落總數(shù)和菌落總數(shù)極值(Log cfu·g-1)；μmax是最大比生長速率(h-1)；Lag 意為微生物生長的遲滯時(shí)間(h)。將各種實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)得的時(shí)間(t)和對(duì)應(yīng)的菌數(shù)值logN(t)和方程通過Marquardt 迭代法進(jìn)行擬合，得到logN0和logNmax，而后得到μmax和Lag，最終確定實(shí)驗(yàn)條件下的微生物生長模型，最后利用該生長模型構(gòu)建基于Gompertz 方程的貨架期模型：

式中，SL(h)是該方程預(yù)測(cè)的貨架期，Ns為菌落總數(shù)極值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度下金槍魚生魚片TVBN 的變化

圖1 是金槍魚生魚片不同溫度下TVBN 的變化。生魚片的初始TVBN 含量僅為6 mg·100-1·g-1左右，是新鮮魚片的標(biāo)志，但隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長，溫度對(duì)生魚片TVBN 的影響很大。從圖中可以看出，盡管3 個(gè)貯藏溫度下TVBN 均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但溫度越高，上升幅度越大，其中0 ℃條件下的生魚片僅過了6 d 即超過30 mg·100-1·g-1，被認(rèn)為發(fā)生了腐敗變質(zhì)，而-10 ℃條件下的魚片達(dá)到變質(zhì)的時(shí)間為10 d，-18 ℃組的魚片則在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中始終未超標(biāo)。

圖1 魚片貯藏過程中TVBN 的變化Fig.1 Changes of TVBN during the storage of sashimi

2.2 不同溫度下對(duì)生魚片菌落總數(shù)的影響

圖2 是不同溫度對(duì)金槍魚生魚片菌落總數(shù)的影響。從圖2 可知，菌落總數(shù)的增長同溫度緊密相關(guān)，溫度越高，則菌落總數(shù)增長數(shù)量越多，速度越快。0 ℃條件下的生魚片第6 d 時(shí)已經(jīng)達(dá)到7 log，已經(jīng)達(dá)到腐敗標(biāo)準(zhǔn)，而-10 ℃魚片組達(dá)到腐敗的時(shí)間則為第10 d，-18 ℃魚片組在第14 d 時(shí)才接近腐敗標(biāo)準(zhǔn)。從菌落總數(shù)和時(shí)間的關(guān)系來看，與TVBN 的變化趨勢(shì)大致相同。因此，考慮到TVBN 指標(biāo)，將金槍魚生魚片的貨架期分別確定為14 d(-18 ℃)、10 d(-10 ℃)和6 d(0 ℃)。

圖2 貽貝貯藏過程中菌落總數(shù)的變化Fig.2 Changes of total numbers of colony during the storage of sashimi

2.3 不同溫度對(duì)金槍魚生魚片色度的影響

金槍魚鮮艷的紅色不僅是金槍魚生魚片的重要商品價(jià)值標(biāo)志，也是金槍魚鮮度的重要指標(biāo)。從表1 可以看出，不同處理組樣品在達(dá)限時(shí)間時(shí)色度同空白相比差異顯著，保存時(shí)間越長、貯藏溫度越高，則色度越差，其中0 ℃貯藏魚片的紅度達(dá)到26.8，肉色呈現(xiàn)非常黯淡的深紅發(fā)黑，而-18 ℃貯藏的魚片同空白相比，除黃度外，亮度、紅度都差異較小，外觀差異不大。

表1 不同溫度處理?xiàng)l件下魚片達(dá)限時(shí)間的色度Tab.1 The chroma of sashimi at the end of storage with different temperature

2.4 金槍魚生魚片中主要微生物的分離及種屬鑒定

表2 是從金槍魚生魚片(-18 ℃)中分離純化并經(jīng)生化鑒定后所得的微生物種類。從表2 中可知，分離得到的微生物共有10 個(gè)種屬，包括假單胞菌屬、腸桿菌屬等，其中假單胞菌屬數(shù)量最多(56 株)，占總菌株的58%。金槍魚生活環(huán)境水體高度凈潔，微生物種類相對(duì)簡單，但捕撈運(yùn)輸過程中極易受到二次污染，造成金槍魚魚體上微生物種類繁雜；捕撈后的金槍魚的貯藏環(huán)境通常都處于超低溫環(huán)境(-60 ℃)，超低溫運(yùn)輸過程中部分微生物死亡，菌相又發(fā)生巨大變化，幸存下來的微生物能夠適應(yīng)低溫環(huán)境，并可繼續(xù)生長繁殖并造成魚體腐敗，這種微生物稱為特定腐敗微生物[6]。圖3是不同溫度條件下生魚片到達(dá)貯藏終點(diǎn)時(shí)的微生物種屬結(jié)果，結(jié)果顯示不同實(shí)驗(yàn)組達(dá)限時(shí)間的微生物菌屬數(shù)量相同，且均以假單胞菌屬數(shù)量最多，這一結(jié)果與南美白對(duì)蝦中的微生物分布類似[7,10]。其中0 ℃組中假單胞菌屬比例達(dá)到62%，且該組的魚片也可以明顯感到腐敗氣味，因而將假單胞菌屬確定為金槍魚生魚片的特定腐敗微生物。藍(lán)蔚青[8]等同樣以大眼金槍魚為原料，對(duì)其冷鏈和斷鏈兩種保藏條件下的微生物進(jìn)行了分離鑒定，從中分離出希瓦氏菌數(shù)、假單胞菌數(shù)等12 種微生物，且以熱死環(huán)絲菌屬、假單胞菌數(shù)和嗜冷桿菌屬為優(yōu)勢(shì)腐敗微生物。這同本研究結(jié)果不同，可能是由于樣品選取部位不同導(dǎo)致。

圖3 不同溫度條件下貽貝貯藏終點(diǎn)時(shí)微生物菌相Fig.3 The bacteriological phase of sashimi at the end of storage with different temperature

表2 金槍魚生魚片中主要微生物Tab.2 Main microorganism in tuna sashimi

2.5 普通凍藏條件下金槍魚生魚片貨架期模型的建立

2.5.1 魚片凍藏過程中特定腐敗微生物的變化

圖4 是利用假單胞菌專屬培養(yǎng)基對(duì)魚片凍藏過程中的假單胞菌屬微生物進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果。從圖中可以看出，在達(dá)限時(shí)間內(nèi)，各實(shí)驗(yàn)組中假單胞菌屬微生物的對(duì)數(shù)值分別為3.88(-18 ℃)、4.46(-10 ℃)和5.82 d(0 ℃)。

圖4 不同溫度下貽貝中假單胞菌屬數(shù)量變化Fig.4 Changes of Pseudomonas in sashimi with different temperature

2.5.2 不同溫度下生魚片中生長模型的構(gòu)建

將2.5.1 的生魚片中微生物生長的相關(guān)數(shù)據(jù)同Gompertz 方程進(jìn)行擬合修訂，利用Marquardt 迭代法，通過非線性回歸獲得不同處理?xiàng)l件下生魚片中微生物的生長參數(shù)。

將表3 中的相關(guān)數(shù)據(jù)帶入生長模型方程，得到不同處理?xiàng)l件下假單胞菌屬微生物的生長模型。

表3 生魚片在不同溫度下假單胞菌屬生長參數(shù)Tab.3 Growth parameters of Pseudomonas in sashimi with different temperature

-18 ℃條件

-10 ℃條件

0 ℃條件

2.5.3 不同處理?xiàng)l件下魚片冷藏貨架期模型

表4 是不同處理?xiàng)l件下魚片到達(dá)貨架期終點(diǎn)時(shí)的Ns和Nmax值。

表4 不同處理?xiàng)l件下魚片組的Ns 和Nmax 值Tab.4 Ns and Nmax of different treatment of sashimi

構(gòu)建-18～0 ℃金槍魚生魚片凍藏貨架期時(shí)將Ns和Nmax取平均值后帶入方程，得到貨架期方程如下：

貨架期方程建立后，實(shí)驗(yàn)人員又對(duì)其準(zhǔn)確性進(jìn)行了驗(yàn)證，將金槍魚生魚片置于-5 ℃和-12 ℃溫度下進(jìn)行凍藏，通過檢驗(yàn)初始菌落數(shù)(2.04×103CFU·g-1和2.0×103CFU·g-1)，帶入貨架期方程后得到其預(yù)測(cè)貨架期為7.24 d 和11.68 d。試驗(yàn)期間每日檢測(cè)樣品菌落總數(shù)，結(jié)果為當(dāng)時(shí)間分別為170 h 和275 h 時(shí)菌落總數(shù)超標(biāo)，因而，該方程對(duì)于預(yù)測(cè)金槍魚生魚片的非超低溫冷凍溫度范圍內(nèi)的貨架期具有較為準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)效果。

3 結(jié)論

金槍魚品質(zhì)好，營養(yǎng)價(jià)值高，但保藏條件極為苛刻，需要全程的超低溫冷鏈。在當(dāng)前國內(nèi)超低溫冷鏈尚不能全程覆蓋的情況下，溫度波動(dòng)會(huì)引發(fā)腐敗微生物生長，引起魚片色澤變差、營養(yǎng)價(jià)值和商品價(jià)值降低、產(chǎn)生食品安全隱患。本研究以此為出發(fā)點(diǎn)，篩選和確定了大眼金槍魚赤身部位的特定腐敗微生物，并對(duì)魚片進(jìn)行了低溫冷凍范圍的貨架期預(yù)測(cè)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明假單胞菌屬微生物是金槍魚生魚片的主要腐敗微生物，構(gòu)建的貨架期預(yù)測(cè)模型能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)-18～0 ℃范圍內(nèi)魚片貨架期。