黃 銘 王林燕 竇曉兵 杜仲燕#

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 浙江 杭州 310053

2 浙江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院 浙江 杭州 310053

酒精性肝?。ˋLD）是一種由于長(zhǎng)期過度飲酒導(dǎo)致的脂肪性肝臟疾病。近年來研究顯示，我國(guó)酒精性肝硬化占肝硬化發(fā)病總數(shù)的比例呈逐年上升態(tài)勢(shì)[1-2]。然而ALD的臨床治療缺乏理想用藥，中醫(yī)中藥正受到肝病學(xué)界的廣泛關(guān)注。1992年，中國(guó)中醫(yī)藥學(xué)會(huì)肝病委員會(huì)制定了脂肪肝的辨證分型標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)過臨床統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)以肝郁脾虛型患者較多[3]。因此，益氣健脾在ALD的治療中非常重要，四君子湯是益氣健脾的代表方，據(jù)臨床報(bào)道，運(yùn)用四君子湯加減治療ALD療效顯著，未發(fā)現(xiàn)明顯的副作用[4-5]。但作用機(jī)制尚未得知，仍亟需解決。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)四君子湯多成分-多靶點(diǎn)-多通路防治ALD的復(fù)雜網(wǎng)狀關(guān)系進(jìn)行研究，旨在為揭示四君子湯作用機(jī)制的科學(xué)內(nèi)涵提供參考。

1 資料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)工具：中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）獲取四君子湯活性成分及靶點(diǎn)；TTD數(shù)據(jù)庫(kù)、Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)獲取酒精性肝病靶點(diǎn)；基因相互作用檢索工具STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PPI分析；Venny2.1工具映射共同靶點(diǎn)并繪制韋恩圖；Cyto‐scape3.7.0軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，并通過其ClueGO插件進(jìn)行GO和KEGG分析。以上工具的使用時(shí)間截止至2019年7月。四君子湯防治ALD的研究路線圖見圖1。

圖1 四君子湯防治ALD的研究路線圖

1.2 四君子湯主要活性成分以及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)：本研究通過 TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，以 REN SHEN，GAN CAO，F(xiàn)U LING，BAI ZHU為關(guān)鍵詞，檢索四君子湯的全部化學(xué)成分。并基于TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中ADME參數(shù)對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行篩選，主要采用口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%及類藥性指數(shù)（Drug-like Index，DL）≥0.18這兩項(xiàng)指標(biāo)作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。隨后逐一收集有效活性成分的潛在靶點(diǎn)，再通過Unipot數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶點(diǎn)名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3 ALD相關(guān)靶點(diǎn)獲?。和ㄟ^TTD、Drugbank和Dis‐GeNET數(shù)據(jù)庫(kù)以“Alcoholic Liver Disease”為關(guān)鍵詞檢索獲取ALD疾病相關(guān)的靶點(diǎn)，并去重。

1.4 四君子湯防治ALD的靶點(diǎn)映射：通過Venny 2.1獲取四君子湯防治ALD的靶點(diǎn)交集，并將交集的靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件中構(gòu)建“四君子湯-防治ALD靶點(diǎn)-對(duì)應(yīng)活性成分”可視化網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 成分-靶點(diǎn)和蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析：為探索靶點(diǎn)蛋白之間的相互作用，將四君子湯防治ALD的靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中，獲取PPI網(wǎng)絡(luò)，再通過R語(yǔ)言分析STRING中獲取的文件，并繪制Barplot圖。

1.6 GO和KEGG分析：把四君子湯防治ALD的靶點(diǎn)上傳至Cytoscape的ClueGO插件，進(jìn)行GO功能注釋和KEGG信號(hào)通路的富集分析(P＜0.01)。

2 結(jié)果

2.1 四君子湯活性成分篩選：通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)Ingredients選項(xiàng)，并根據(jù)OB≥30%，DL≥0.18篩選各獲得人參22個(gè)、白術(shù)7個(gè)、茯苓15個(gè)和甘草92個(gè)活性成分，去重后，獲得四君子湯135個(gè)活性成分。

2.2 四君子湯靶點(diǎn)預(yù)測(cè)：根據(jù)獲取的135個(gè)活性成分，再通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，逐一獲取相對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，結(jié)果顯示人參對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)有256個(gè)（其中5個(gè)活性成分無(wú)靶點(diǎn)信息），白術(shù)有23個(gè)（其中3個(gè)活性成分無(wú)靶點(diǎn)信息），茯苓有30個(gè)，甘草有1769個(gè)，去重后共為258個(gè)潛在靶點(diǎn)。在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)化后，獲得214個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。通過檢索TTD、DrugBank、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)，各檢索獲得ALD相關(guān)靶點(diǎn)0個(gè)、16個(gè)、84個(gè)，去重后共100個(gè)靶點(diǎn)，與藥物靶點(diǎn)映射，共得到21個(gè)四君子湯防治ALD的靶點(diǎn)（圖2和圖3）。

圖2 四君子湯防治ALD對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)

圖3 四君子湯防治ALD具體靶點(diǎn)

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建：為了更好地理解四君子湯防治ALD的作用機(jī)制，基于PPI關(guān)系，利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建了四君子湯防治ALD相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖4）。PPI網(wǎng)絡(luò)包含21個(gè)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)，81條相互作用關(guān)系（連線），其中1個(gè)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)無(wú)相互作用關(guān)系。再通過R語(yǔ)言計(jì)算靶點(diǎn)的degree，并繪制Barplot圖，顯示IL1B、IL6、CCL2、CXCL8、IL10、STAT3、NFE2L2、PPARG、SPP1、NR3C1為排名前10的核心靶點(diǎn)（圖5）。

圖4 四君子湯防治ALD靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖5 四君子湯防治ALD排名前10的核心靶點(diǎn)

2.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析：使用Cytoscape軟件構(gòu)建ALD-四君子湯活性成分-作用靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)模型，如圖6所示。從圖中可以看出，68個(gè)活性成分的21個(gè)潛在治療靶點(diǎn)對(duì)比到ALD上，不同的活性成分可作用于相同的靶點(diǎn)，也可作用于不同的靶點(diǎn)，根據(jù)Degree值篩選，排名前2的活性成分分別為quercetin（槲皮素，18）、kaemp‐ferol（山萘酚，15）、licochalcone a（利可考酮，4）、naringenin（柚皮苷，4）、formononetin（福莫寧，4）、isorhamnetin（異鼠李素，4）；排名前3的靶點(diǎn)為PPARG（69）、MAPK14（48）、GSTP1（5）。

圖6 四君子湯防治療ALD的靶點(diǎn)-成分網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

2.5 候選靶基因功能分析：根據(jù)四君子湯防治ALD相關(guān)的靶基因，通過Cytoscape軟件的ClueGO插件進(jìn)行GO生物學(xué)功能和KEGG信號(hào)通路的富集分析，發(fā)現(xiàn)參與調(diào)節(jié)RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄pri-miRNA、急性炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、過氧化氫的生物合成過程等9個(gè)功能組被顯著富集，其作用涉及脂質(zhì)儲(chǔ)存的負(fù)調(diào)控、脂質(zhì)儲(chǔ)存、急性炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)等生物學(xué)功能的調(diào)控（圖7）。KEGG信號(hào)通路富集發(fā)現(xiàn)，主要和糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、細(xì)胞色素P450對(duì)異生物的代謝、IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路等信號(hào)通路相關(guān)（圖8）。

圖7 四君子湯治療ALD的GO生物功能富集結(jié)果

圖8 四君子湯防治ALD的KEGG信號(hào)通路富集結(jié)果

3 討論

ALD雖然致病因素單一，但致病機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為細(xì)胞損傷、氧化應(yīng)激、代謝異常、炎癥、免疫損傷等均可導(dǎo)致ALD，臨床尚缺乏安全有效的藥物[6]。中醫(yī)古籍中“傷酒”“酒疸”等描述與ALD十分相似，臨床統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)以肝郁脾虛型患者較多。四君子湯始載于《太平惠民和劑局方》，由人參、甘草、茯苓、白術(shù)四味藥組成，是益氣健脾的簡(jiǎn)易名方[7]。臨床研究發(fā)現(xiàn)四君子湯加減治療ALD療效顯著；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，四君子湯對(duì)急性酒精肝損傷模型具有較好的治療效果[8]。

為了系統(tǒng)探討四君子湯防治ALD的具體機(jī)制，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，采用TCMSP平臺(tái)篩選出四君子湯防治ALD的活性成分135個(gè)，有槲皮素、山奈酚、迪奧普、豆甾醇、β-谷固醇、菊黃素、鬼臼胺等成分直接、間接地作用于CCL2、CXCL8、IL10、STAT3、PPARG等靶點(diǎn)，涉及脂質(zhì)儲(chǔ)存的負(fù)調(diào)控、脂質(zhì)儲(chǔ)存等GO生物學(xué)功能，涉及PPAR、IL-17、TNF等信號(hào)通路。

本研究使用Cytoscape軟件構(gòu)建活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)篩選得到排名前2的核心活性成分為槲皮素和山奈酚。多項(xiàng)研究證實(shí)，槲皮素可改善ALD小鼠的氧化損傷、細(xì)胞凋亡以及肝脂肪變性，機(jī)制可能與調(diào)節(jié)脂質(zhì)吞噬[9]等相關(guān)。山奈酚可顯著降低ALD小鼠氧化應(yīng)激以及脂質(zhì)過氧化水平，并增加抗氧化防御活性，可能與降低肝臟CYP2E1的表達(dá)水平和活性有關(guān)[10]。

本研究根據(jù)STRING和Cytoscape篩選核心靶點(diǎn)，排名前1的為PPARG。PPARG是過氧化物酶體增生激活受體γ，在脂質(zhì)代謝和預(yù)防氧化應(yīng)激中具有重要作用[11]，肝臟內(nèi)的PPARγ可促進(jìn)肝臟脂肪變性及炎癥，從而導(dǎo)致酒精誘導(dǎo)的肝損傷[12]。GO生物學(xué)功能富集分析也發(fā)現(xiàn)與脂質(zhì)代謝、脂質(zhì)調(diào)控、炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。KEGG信號(hào)通路富集分析亦發(fā)現(xiàn)與PPAR信號(hào)通路密切相關(guān)。氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化是ALD的重要發(fā)病機(jī)制，由此推測(cè)四君子湯主要通過作用上述受體及對(duì)應(yīng)信號(hào)通路來防治ALD。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，驗(yàn)證了四君子湯多成分-多靶點(diǎn)-多途徑治療ALD的作用特點(diǎn)，預(yù)測(cè)了四君子湯防治ALD可能與脂質(zhì)代謝、脂質(zhì)調(diào)控、炎癥反應(yīng)等相關(guān)，涉及的通路有PPAR信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等，核心靶點(diǎn)可能是PPARG，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供了思路和依據(jù)，也為闡明四君子湯防治ALD的機(jī)制提供新思路和新方法，更為四君子湯這一中醫(yī)經(jīng)典方的現(xiàn)代臨床應(yīng)用提供依據(jù)。