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      利用芥菜轉(zhuǎn)錄組信息挖掘SSR標(biāo)記及用于種質(zhì)分析

      2020-06-19 07:47:36李永平張雙照薛珠政溫慶放
      福建農(nóng)業(yè)學(xué)報 2020年2期
      關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)錄組芥菜多態(tài)性

      李永平 張雙照 薛珠政 溫慶放

      摘要:[目的]為開發(fā)高效的芥菜Brassicajuncea.分子標(biāo)記。[方法]本研究通過對芥菜轉(zhuǎn)錄組測序的信息搜索SSR位點并分析其分布特點,應(yīng)用Primer 3.0軟件設(shè)計SSR引物,隨機選擇50對引物擴(kuò)增44份芥菜種質(zhì),檢測其多態(tài)性。[結(jié)果]芥菜轉(zhuǎn)錄組測序共獲得55636條tmigene,全部序列有48193376bp;有7834條unigene包含SSR的序列,從中鑒定出9526個SSR位點,其中有1371條序列包含1個以上SSR,復(fù)合SSR有572個,SSR發(fā)生頻率為14.08%。優(yōu)勢重復(fù)基序為三核苷酸和二核苷酸,分別占總SSR的51.12%和41.91%。二核苷酸重復(fù)基元中以AG/CT為優(yōu)勢重復(fù)基元,占總位點的34.74%,三核苷酸重復(fù)基元以AAG/CTT為主,占總位點的18.30%。共設(shè)計出21282對SSR引物,隨機選擇50對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其中41對擴(kuò)增出清晰可重復(fù)的預(yù)期條帶,17對(占34%)在44份芥菜種質(zhì)中表現(xiàn)出多態(tài)性。應(yīng)用UPGMA得到將44份供試材料分為4大類聚類圖,可準(zhǔn)確地體現(xiàn)了芥菜種質(zhì)材料的關(guān)系。[結(jié)論]根據(jù)芥菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)能開發(fā)出類型豐富、效率較高的SSR標(biāo)記,為芥菜親緣關(guān)系分析和遺傳圖譜構(gòu)建等提供更可靠的標(biāo)記。

      關(guān)鍵詞:芥菜;轉(zhuǎn)錄組;SSR;多態(tài)性

      中圖分類號:S649文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號:1008-0384(2020)02-0169-09

      (研究意義)芥菜(Brassicajuncea)十字花科蕓薹屬植物,原產(chǎn)中國,并在中國發(fā)生豐富的變異和分化,全國有1000多份不同的芥菜品種。收集的種質(zhì)資源混雜多樣,因此對芥菜的種質(zhì)資源的親緣關(guān)系鑒定及分類意義重大,有利于提高芥菜種質(zhì)的利用效率。(前人研究進(jìn)展)目前對芥菜的起源進(jìn)化、分類和遺傳多樣性已有研究。依據(jù)葉形態(tài)特征,如基生葉的裂刻、刺毛的有無、葉形的變化、莖與根的變異等,Vauzb8n等將芥菜劃分了4個類群。孟秋峰等對17個芥菜變種植物學(xué)性狀進(jìn)行聚類,結(jié)果分為葉用芥菜、莖用芥菜、根用芥菜、薹用芥菜和籽用芥菜等5個類。(本研究切入點)微衛(wèi)星序列(Simple sequence repeat,SSR)分子標(biāo)記,在生物基因組中普遍存在,是一種可信賴的、使用方便分子標(biāo)記之一,常用于作物遺傳信息分析、品種鑒別、建立遺傳圖譜等。EST-SSR標(biāo)記較基于基因組序列開發(fā)的SSR標(biāo)記種間通用性更高,更經(jīng)濟(jì)方便。EST-SSR標(biāo)記在辣椒、菜薹、菠菜、大白菜、甘藍(lán)和洋蔥等一些主要蔬菜作物中都有開發(fā)與應(yīng)用,芥菜的EST-SSR標(biāo)記開發(fā)利用未見報道。(擬解決的關(guān)鍵問題)本研究中應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測序獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行SSR標(biāo)記搜索,設(shè)計EST-SSR引物,評價引物的多態(tài)性效率,為芥菜種質(zhì)遺傳信息鑒定、遺傳信息利用等開發(fā)可靠、高效的分子標(biāo)記。

      1 材料與方法

      1.1轉(zhuǎn)錄組測序

      測序材料“龍芥2號”于9月15日播種,lo月5日定植于福建省龍巖市新羅區(qū)龍門鎮(zhèn)赤水村,11月5日,選取3株健康無病植株,每株選幼葉葉稍處取5g樣品,液氮速凍,-80℃保存?zhèn)溆?。廣州基迪奧生物科技有限公司采用Illumina HiSeq TM 2500PEl25系統(tǒng),設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序(無參),經(jīng)過濾得到4.82G的有效RNA-seq數(shù)據(jù)。

      1.2材料及其DNA提取

      項目組收集的44份芥菜種質(zhì)材料(表1)用于SSR引物篩選和有效性評價。供試材料基因組DNA用CTAB法提取。

      1.3 SSR位點搜索及SSR引物設(shè)計

      用MISA程序(http://pgrc.ikp-gatersleben.de/misa)對轉(zhuǎn)錄組的所有Unigene進(jìn)行搜索,尋找Unigene中的SSR,搜索參數(shù)為二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)次數(shù)分別大等于6、5、5、4和4次且2個SSR序列的距離不短于100bp;用Primer 3.0軟件對每條SSR設(shè)計3對引物并評價。引物要求為:序列長度18~25bp,GC含量40%~60%,上、下游引物的Tm值≤2℃,預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物100~400bp,不產(chǎn)生二聚體。

      1.4 SSR引物篩選

      20uLPCR反應(yīng)體系:lommol·L-1dNTPs0.4uL,5U Taq酶0.3uL,100ng DNA 1.0uL,10umol·L-1的上、下游引物各0.8uL,10× Buffer(Mg2+)2.0uL,ddH2O 14.7ul.PCR熱程序如下:94℃5m;94℃30s,58℃30s,72℃ 30s,30個循環(huán);72℃5min.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測。

      1.5 數(shù)據(jù)分析

      SSR發(fā)生頻率=SSR的unigene數(shù)量/總unigene數(shù);SSR出現(xiàn)頻率=SSR個數(shù)/總unigene數(shù),SSR平均分布距離=unigene堿基數(shù)/SSR數(shù)?!?”:“0”法統(tǒng)計電泳數(shù)據(jù),應(yīng)用NTsys2.10e聚類分析。

      2 結(jié)果與分析

      2.1SSR的分布特征

      芥菜轉(zhuǎn)錄組測序獲得55636條unigene(總長約48193376bp),經(jīng)MISA軟件搜索發(fā)現(xiàn)9526個SSR位點發(fā)布于7834條unigene上。SSR發(fā)生頻率14.08%,出現(xiàn)頻率、17.12%,平均5.06kb有1個SSr.包含有二至六核苷酸重復(fù)類型,其中三核苷酸和二核苷酸重復(fù)是主要形式,分別占總SSR的51.12%與41.91%;其他3種苷酸重復(fù)類型數(shù)量較少共占總數(shù)的6.97%(表2)。

      芥菜轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)最低4次,最高位42次,共有9241個SSR重復(fù)次數(shù)為4~10次,占總數(shù)的97.01%;285個SSR重復(fù)次數(shù)在11~42次,占總數(shù)的2.99%。芥菜轉(zhuǎn)錄組SSR的長度為12~324bp,主要集中于12~18bp,此長度間SSR達(dá)8230個,占總數(shù)的86.40%,長度大于18bp的SSR有1296個,只占13.60%。

      2.2 轉(zhuǎn)錄組中SSR基序重復(fù)類型和頻率特征

      芥菜轉(zhuǎn)錄組的重復(fù)基序較為豐富,共有172種重復(fù)基序,分布見表3.AG/CT重復(fù)基序發(fā)生頻率最高為34.74%,占二核苷酸重復(fù)的總數(shù)的82.89%;其次是AAG/CTT重復(fù)基序,發(fā)生頻率為18.30%,占三核苷酸總數(shù)的35.79%。四核苷酸有25種重復(fù)基序、五核苷酸41重復(fù)基序、六核苷酸重復(fù)基序達(dá)92種,分布較散,發(fā)生的頻率不高。

      2.3 芥菜轉(zhuǎn)錄組SSR引物設(shè)計與篩選

      遵照引物設(shè)計的標(biāo)準(zhǔn),7834條含SSR位點的unigene序列,共設(shè)計得引物21282對。從不同核苷酸重復(fù)單元的引物中隨機挑選50對,PCR擴(kuò)增龍芥2號DNa.結(jié)果為50對引物均能擴(kuò)增,其中4l對(82.00%)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度為100~400bp,9對(18%)擴(kuò)增產(chǎn)物長度超400bp.

      2.4多態(tài)性分析

      用上述擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期大小相符的41對引物擴(kuò)增44份芥菜種質(zhì)資源(圖1),有17對(41.46%)引物具有特異性(表4)。17對多態(tài)性引物擴(kuò)增46個多態(tài)性片段,平均每對引物擴(kuò)增2.71個多態(tài)性片段。PIC值的大小代表多態(tài)性息的豐富程度,17對引物的PIC最高值達(dá)到0.82,平均值為0.60,僅BaSSR007、BaSSR043引物PIC值較低為0.43和0.47,表明這些17對芥菜SSR標(biāo)記含有豐富的多態(tài)信息。17對多態(tài)性引物中二核苷、三核苷酸、五核苷重復(fù)的各4、6、3對,四核苷酸重復(fù)和六核苷酸重復(fù)的各2對。

      對多態(tài)性SSR引物的擴(kuò)增結(jié)果聚類分析,在遺傳距離0.82處,44份芥菜種質(zhì)材料被分成四大類(圖2)。

      第Ⅰ大類包括36個莖用、葉用芥菜材料;第Ⅱ大類包括5個結(jié)球芥材料:17、35、22、4l、43;第Ⅲ大類包括2個紫葉芥材料:2、42;第Ⅳ大類:薹芥品種38單獨成類。第Ⅰ大類36個材料在遺傳距離0.67處聚為4個亞類:(1)此亞類包含1、4、9、15、44、30、36、40、39、37、11等11個莖用材料和21、16、7、24、19、23、29、20、18等9個葉用材料;(2)含葉面有刺毛4個材料25、26、27、28;(3)此亞類包含5個株型半直立的材料32、31、12、33、34;(4)此亞類包含7個葉面平滑材料3、14、5、13、8、6、10.

      3 討論

      高通量測序快速發(fā)展,EST數(shù)量得到迅速增加,為EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)應(yīng)用提供了條件,許多植物的EST-SSR標(biāo)記已被開發(fā)應(yīng)用。芥菜EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)利用國內(nèi)未見報道。本研究從芥菜的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的55636條unigene搜索獲得7834條unigene序列共9526個SSR位點,SSR發(fā)生頻率為14.08%,出現(xiàn)頻率為17.12%。此結(jié)果較菠菜、洋蔥、黨參等4.33%~16,10%的頻率范圍略高,但低于菜薹19.26%和蘿卜23.79%和的SSR位點頻率。SSR發(fā)生頻率與物種基因組差異、轉(zhuǎn)錄組測序的時期選擇、獲得數(shù)據(jù)量大小與質(zhì)量、SSR搜索工具的選擇及篩選的參數(shù)設(shè)置等因素密切相關(guān)。芥菜SSR含二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)5種類型,以三核苷酸和二核苷酸重復(fù)為主要形式,分別占總SSR的51.12%與41.91%;四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)類型數(shù)量較少,分別占總數(shù)的3.70%、1.40%和1.87%,與菜薹、芝麻、蘿卜等作物的研究結(jié)果有所不同,這與SSR搜索參數(shù)設(shè)置有關(guān)。二、四和五核苷酸重復(fù)多在非翻譯區(qū)(UTR),三、六核苷酸重復(fù)與編碼序列(CDS)密切相關(guān),芥菜三核苷酸重復(fù)SSR占絕對優(yōu)勢,說明芥菜轉(zhuǎn)錄組unigene中的CDS信息更豐富。AAG/CTT和AG/CT重復(fù)基序在眾多基序占優(yōu)勢,與在大白菜、黃秋葵的結(jié)果一致。選取的50對SSR引物擴(kuò)增‘龍芥2號DNA,9對(18%)引物擴(kuò)增產(chǎn)物超預(yù)期,擴(kuò)增不成功的因素可能是引物內(nèi)含子在啟動位點引起SNPS/InDel變異,或是組裝錯誤。多態(tài)性引物占有效引物的41.46%,低于洋蔥(45.00%),高于辣椒(36.84%)、菠菜(17.43.00%),說明所設(shè)計的芥菜SSR標(biāo)記引物多態(tài)性較好。有研究認(rèn)為,SSR標(biāo)記的多態(tài)性可能與重復(fù)序列長度呈正相關(guān),重復(fù)序列長于20bp的SSR,表現(xiàn)多態(tài)性的概率高;重復(fù)序列長度小于20bp的SSR呈多態(tài)性的可能性明顯較低。本研究中17對多態(tài)性引物僅有2對來自于長度小于20bp重復(fù)序列。PIC值可用于衡量標(biāo)記的多態(tài)信息,本研究中17對多態(tài)引物的平均PIC值為0.60,最低值0.43發(fā)生在重復(fù)序列最短序列的引物BaSSR007上,15對引物PIC值均大于0.5,結(jié)果說明本研究開發(fā)的芥菜EST-SSR有較高的多態(tài)性。

      李寧等用SRAP標(biāo)記將111份芥菜歸為薹芥、葉用芥和莖用芥、紫葉芥和長柄芥5類,遺傳相似系數(shù)為0.38~0.89,表明芥菜在分子水平上遺傳多樣性較豐富。本研究應(yīng)用EST-SSR標(biāo)記分類44份芥菜種質(zhì)材料的結(jié)果與其相似,但與運用AFLP、RAPD、ISSRL等標(biāo)記研究的結(jié)果不盡相同,這可能與不同分子標(biāo)記所揭示的基因組片段的變異方式不同有關(guān)。

      RAPD、ISSR、SRAP等標(biāo)記技術(shù)均開發(fā)于無基因組(或轉(zhuǎn)錄組)序列信息,隨機性強、穩(wěn)定性差。EST-SSR來自基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)并與功能基因緊密連鎖,具有豐富多態(tài)性,較高靈敏度,可重復(fù)性強等優(yōu)勢。本研究利用基于芥菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選得17對SSR引物,對44份芥菜種質(zhì)材料進(jìn)行遺傳多樣性分析,以遺傳距離0.82為閾值,44份芥菜種質(zhì)材料分為四大類,SRAP標(biāo)記等無法將結(jié)球和不結(jié)球芥菜完全分開,而SSR標(biāo)記可以準(zhǔn)確分開,較ISSR、SRAP等標(biāo)記的分析結(jié)果,SSR標(biāo)記更準(zhǔn)確地體現(xiàn)了芥菜種質(zhì)材料的關(guān)系。

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