朱畇昊+董誠明+鄭曉珂+馮衛(wèi)生+劉孟奇+趙樂

[摘要]為探討山茱萸中環(huán)烯醚萜等次生代謝產(chǎn)物合成的遺傳基礎(chǔ)，采用新一代高通量測序技術(shù)對其果實進行轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得得96 032條unigenes，平均長度59053 bp；其中共有35 478條unigene能被NR，Swissprot，COG，GO，KOG，Pfam和KEGG等7個公共數(shù)據(jù)庫注釋。通過對注釋所得的unigene進行KEGG代謝通路的分析發(fā)現(xiàn)，共有84個unigene與環(huán)烯醚萜類成分的生物合成有關(guān)；487條unigene參與山茱萸其他次生代謝相關(guān)物質(zhì)代謝調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，共有153條unigene參與山茱萸次生代謝產(chǎn)物的氧化/羥基化；72條unigene參與次生代謝產(chǎn)物的糖基化。該研究首次對山茱萸轉(zhuǎn)錄組進行了分析，并獲得了山茱萸環(huán)烯醚萜類等次生代謝生物合成相關(guān)的候選基因，為山茱萸的分子生物學(xué)研究提供了豐富的數(shù)據(jù)資源，也為后續(xù)探討候選基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]山茱萸； 轉(zhuǎn)錄組； 次生代謝

Transcriptome analysis reveals genes involved in biosynthesis of

secondary metabolism in Cornus officinalis

ZHU Yunhao， DONG Chengming， Zheng Qiaoke， FENG Weisheng， LIU Mengqi， ZHAO Le*

（Collaborative Innovation Center for Respiratory Disease Diagnosis and Treatment & Chinese Medicine

Development of Henan Province， School of Pharmacy， Henan University of Traditional

Chinese Medicine， Zhengzhou 450046， China）

[Abstract]In order to explore genetic basis for the biosynthesis of secondary metabolism，the transcriptome of Cornus officinalis was sequenced by the new generation of highthroughput sequencing technology，A total of 96 032 unigenes were assembled with an average length of 59053 bp Among them， 35 478 unigenes were annotated in the public databases NR，Swissprot，COG，GO，KOG，Pfam and KEGG Based on the assignment of KEGG pathway， 84 involved in ridoid biosynthesis and 487 unigenes involved in others secondary metabolites biosynthesis were found Additionally，53 unigenes and 72 unigenes were predicted to have potential functions of cytochome P450 and UDP glycosyltransferases based on the annotation result， which may encode responsible for secondary metabolites modification This study was the first comprehensive transcriptome analysis for C officinalis， and the candidate genes involved in the biosynthesis of secondary metabolites were obtained The transcriptome data constitutes a much more abundant genetic resource that can be utilized to benefit further molecular biology studies on C officinalis

[Key words]Cornus officinalis； transcriptome； secondary metabolites

山茱萸Cornus officinalis Sieb et Zucc為山茱萸科多年生落葉喬木或灌木，其成熟干燥果實入藥具有補益肝腎、收斂固澀的功效，常用于眩暈耳鳴、肝虛寒熱等癥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，山茱萸具有免疫抑制、血糖調(diào)節(jié)、 抗血小板聚集、抗菌、抗炎等作用[1]，而其果實中富含的山茱萸苷、馬錢苷、莫諾苷等環(huán)烯醚萜類及黃酮、三萜類等次生代謝產(chǎn)物可能是其發(fā)揮上述藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。雖然山茱萸在化學(xué)和藥理學(xué)研究方面[12]已有了廣泛的研究，但其活性成分代謝途徑的研究較少，次生代謝生物合成相關(guān)基因的研究還未見報道。

目前，以邊合成邊測序為核心的新一代高通量測序方法具有快遞、轉(zhuǎn)確率高、成本低、通量高等顯著優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于藥用植物的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中[34]。轉(zhuǎn)錄組是指生物體的細胞或組織在特定的狀態(tài)下基因組所轉(zhuǎn)錄的全部mRNA，它能夠提供全部基因的表達信息和蛋白質(zhì)的功能、相互作用的信息。藥用植物轉(zhuǎn)錄組研究提供了一種快速、高通量、全面解讀藥用植物基因組信息的全新技術(shù)手段，也為藥用植物次生代謝生物合成途徑的關(guān)鍵酶的挖掘、藥用植物次生代謝成分的生物合成途徑與調(diào)控、藥用植物種質(zhì)資源收集與評價、探索中藥材道地性形成的分子機制提供了新的思路和方法。目前，已有丹參[5]、人參[6]、黃花蒿、[7]、紅豆杉[8]等大量的藥用植物已經(jīng)完成了基于高通量測序的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究已經(jīng)成為挖掘與克隆新的功能基因、探討基因功能和構(gòu)建藥用植物分子標記不可或缺的手段之一[3]。

1材料與方法

11試驗材料及RNA提取試驗材料采集于河南宛西藥業(yè)股份有限公司南陽西峽山茱萸GAP種植基地，選取長勢良好的健康果實，經(jīng)液氮速凍后保存于實驗室超低溫冰箱中備用。采用Trizol 法提取果實的總RNA，用于轉(zhuǎn)錄組測序。分別采用Nanodrop，Qubit 20，Aglient 2100方法檢測RNA樣品的純度、濃度和完整性等，以保證使用合格的樣品進行轉(zhuǎn)錄組測序。

12轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)組裝使用上述檢測合格后的總RNA樣品進行文庫構(gòu)建。庫檢合格后，使用Illumina HiSeq2500測序平臺進行高通量測序，測序讀長為PE125。測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)堿基識別轉(zhuǎn)化為原始讀序，所有的原始讀序（raw reads）通過去除接頭、重復(fù)序列、低質(zhì)量的序列，得到干凈讀序（clean reads）。使用Trinity 拼接干凈讀序得到重疊群（contigs）。在所有的轉(zhuǎn)錄本中，取最長的contig作為該轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄本（unigene）。

13功能注釋通過BLAST比對軟件將所獲得的山茱萸unigene序列與NR（Nonredundant Protein Sequence Database in GenBank，NCBI非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫），SwissProt（SwissProt Protein Sequence Database），GO（Gene ontology），COG （Clusters of Orthologous Groups），KOG（Cluster of Orthologous Groups of proteins），KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫比對。使用KOBAS20得到unigene在KEGG中的KEGG Orthology中的注釋結(jié)果，預(yù)測完unigene的氨基酸序列之后使用HMMER軟件與Pfam數(shù)據(jù)庫比對，獲得unigene的注釋信息。

2結(jié)果與分析

21測序與組裝結(jié)果通過 Illumina HiSeq 2500 技術(shù)對山茱萸果實進行轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得25 812 447個raw reads，經(jīng)過測序質(zhì)量控制，得到650 Gb clean data，Q30堿基達到9106%，GC量為4513%。mRNA片段化隨機性檢驗發(fā)現(xiàn)，mRNA片段化隨機性較高，樣品不存在嚴重降解現(xiàn)象。使用Mapped Reads對檢測到的基因數(shù)目的飽和情況進行模擬發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)飽和度較高，檢測到的基因數(shù)目會趨于飽和，能夠滿足后續(xù)分析研究的要求。

采用Trinity 軟件對序列進行拼接，共獲得3 840 190條contigs，其中，長度200～300的contigs序列有3 775 745條，占總體的9832%，其分布特征符合Illumina測序的預(yù)期結(jié)果，可為后續(xù)的數(shù)據(jù)組裝提供原始數(shù)據(jù)。在contigs數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，進一步對序列進行組裝，共獲得96 032個unigenes，序列總長度為56 709 909 bp，平均長度為59053 bp，N50為937 bp。長度在200～300 bp 的unigenes數(shù)量最多，占總基因數(shù)的4643%。Unigenes長度分布在300～500 bp的有23 7986條，占總體的2478%；分布在500～1 000 bp的有13 975條（1789%），占總體的1455%；長度分布在1 000～2 000 bp的有8 678條，占總體的904%；unigenes 長度超過2 000 bp的有4 997，占總體的520%，見表1。

22Unigene功能注釋通過選擇BLAST參數(shù)Evalue不大于1×10-5和HMMER參數(shù)Evalue不大于1×10-10，最終獲得35 478（3694%）個能被注釋的unigene，見表2。其中35 036 個（3648%）unigene 在SwissProt 數(shù)據(jù)庫中可找到相似序列；20 727

朱畇昊等：基于轉(zhuǎn)錄組測序的山茱萸次生代謝生物合成相關(guān)基因的挖掘個（4328%）unigene 在SwissProt 數(shù)據(jù)庫中可找到相似序列，60 554個（6306%）unigene 不能被已有數(shù)據(jù)庫注釋。

Unigene 在Nr 數(shù)據(jù)庫相似序列匹配的近緣物種中，葡萄Vitis vinifera所占比例最高（9 697條，2769%），隨后依次是可可Theobroma cacao，1 781條，509%、蓮Nelumbo nucifera，1 636條，467%、咖啡Coffea canephora，1 521條，434%、芝麻Sesamum indicum，1 353條，386%、谷子Setaria italica，1 157條，330%、絨毛煙草Nicotiana tomentosiformis，1 089條，263%、美花煙草N. sylvestris，921，263%、甜橙Citrus sinensis、842條，240%、巨桉Eucalyptus grandis，831條，237%和其他物種（14 195條，4053%）。

23GO分類GO（gene ontology）提供了一套動態(tài)更新的標準詞匯表來全面描述生物體中基因和基因產(chǎn)物的功能屬性，共有分子功能（molecular function）、細胞組分（cellular component）和生物學(xué)過程（biological process）3大類，各自描述了基因產(chǎn)物可能行使的分子功能，以及所處的細胞環(huán)境和參與的生物學(xué)過程。在本研究中，共有20 846（2171%）條unigenes 得到了GO注釋。所有具有GO分類信息的unigenes 被分配到98 331 條GO 條目下，包括細胞組分（19 158個），分子功能（34 461個）和生物學(xué)過程（44 712個）。所有的匹配序列被進一步富集為52個功能類別，其中，代謝進程（metabolic process，12 294 個）、細胞進程（cellular process，11 630 個）、結(jié)合活性（binding，11 620個）、催化活性（catalytic activity，11 325個）、細胞部分（cell part，8 920個）、單有機體過程（singleorganism process，8 570 個）等功能組中包含的unigene較多，而轉(zhuǎn)運活調(diào)節(jié)性（translation regulator activity，1個）、細胞殺傷（cell killing，3個）、病毒顆粒（virion part，4個）、蛋白標簽（protein tag、4個）、胞外基質(zhì)部分（extracellular matrix，5個）功能組中包含的unigene 較少，見圖1。

24COG 相關(guān)功能分類COG（clusters of orthologous groups）數(shù)據(jù)庫是對基因產(chǎn)物進行同源分類的數(shù)據(jù)庫，是一個較早的識別直系同源基因的數(shù)據(jù)庫，通過對多種生物的蛋白質(zhì)序列大量比較而來的。將山茱萸unigene與COG 數(shù)據(jù)庫進行比對，預(yù)測unigene功能并進行分類統(tǒng)計。研究結(jié)果表明，山茱萸unigene根據(jù)其功能大致可分為25類。unigene涉及的COG功能類別比較全面，其中，一般功能預(yù)測類基因最多（2 300個）；其次是復(fù)制、重組和修飾類基因（1 425個）、轉(zhuǎn)錄類基因（1 141個）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)類基因（1 013個）和翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成類基因（893個）；而核結(jié)構(gòu)類基因（5個）和細胞運動類基因（8個）較少；未發(fā)現(xiàn)胞外結(jié)構(gòu)類基因，見圖2。

25KEGG分析KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫是系統(tǒng)分析基因產(chǎn)物在細胞中的代謝途徑以及這些基因產(chǎn)物功能的數(shù)據(jù)庫。將KEGG pathway數(shù)據(jù)庫作為參考，可將11 554個unigene定位到126個具體的代謝途徑分支，其中核糖體相關(guān)基因共有569個；碳代謝相關(guān)基因共有457個；氨基酸生物合成相關(guān)基因共有400個；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工相關(guān)基因共有361個；淀粉和蔗糖代謝相關(guān)基因共有312個，而萬古霉素抗性、咖啡因代謝、花青素生物合成相關(guān)基因較少，僅分別有2，3，4條。

26山茱萸環(huán)烯醚萜苷生物合成相關(guān)基因的鑒定山茱萸中含有馬錢苷、山茱萸苷、莫諾苷、獐芽菜苷等多種環(huán)烯醚萜苷類成分，可能是其發(fā)揮降血糖、免疫抑制、抗炎等生物活性的物質(zhì)基礎(chǔ)[2]。環(huán)烯醚萜苷類成分的生物合成途徑可分為異戊烯焦磷酸（IPP） 與二甲烯丙基焦磷酸（DMAPP）前體形成；牻牛兒基二磷酸（GPP）、法尼基焦磷酸（FPP）、牻牛兒基牻牛兒基二磷酸（GGPP）等萜類骨架構(gòu)建和羥基化、糖基化等后修飾反應(yīng)等3個階段[9]。其中前2個階段研究已經(jīng)比較透徹，且為所有萜類化合物的共有途徑，而后修飾反應(yīng)的多樣性最終決定了萜類產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的多樣性。前人研究表明，在不同的物種中，IPP與DMAPP生物合成途徑基本是一致的，都可以通過定位于細胞質(zhì)中的甲羥戊酸（mevalonic acid，MVA）途徑和定位于質(zhì)體中的甲基赤蘚醇4磷酸（methylerythritol phosphate，MEP）途徑合成[10]。通過對山茱萸注釋所得的unigene進行KEGG代謝通路的分析，共有55個unigene映射到萜類骨架合成通路上（KO00900），編碼萜類骨架合成途徑中的17個關(guān)鍵酶，包括羥甲基戊二酰輔酶A合成酶（HMGS）、甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）等6個甲羥戊酸途徑（MVA）的酶；1脫氧D木酮糖5磷酸合成酶（DXS）、1脫氧D木酮糖5磷酸還原異構(gòu)酶（DXR）等8個MEP途徑的關(guān)鍵酶和牻牛兒基焦磷酸合成酶（GPPS）、法尼基焦磷酸合酶（FDPS）、牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶（GGPS）等3個催化萜類骨架直接前體生產(chǎn)的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶，見表3。

香葉醇10脫氫酶（G10H）可催化香葉醇發(fā)生羥基化作用形成10羥基香葉醇，而后10羥基香葉醇氧化還原酶（10HGO）催化10羥基香葉醇氧化形成10氧香葉醛。環(huán)烯醚萜的生物合成從10氧香葉醛開始分為裂環(huán)馬錢子苷途徑和環(huán)形環(huán)烯醚萜途徑[11]。在裂環(huán)馬錢子苷途徑中，10氧香葉醛可通過以來NADPH的10氧香葉醛環(huán)化酶（IRS）的作用形成環(huán)烯醚萜，經(jīng)過幾步依賴細胞色素P450的氧化反應(yīng)和依賴糖基轉(zhuǎn)移酶的糖基化反應(yīng)合成脫氧馬錢子苷酸，進一步甲基化生成甲基馬錢子苷，最后由裂環(huán)馬錢子苷合成酶（SLS）裂環(huán)生成裂環(huán)馬錢子苷。通過查詢在unigene在Nr和SwissProt數(shù)據(jù)庫中的注釋信息結(jié)合KEGG代謝通路的分析，發(fā)現(xiàn)有15條可能編碼G10H的unigene，6條可能編碼10HGO的unigene，2條可能編碼IRS的unigene，10條可能編碼SLS的unigene，見表3。以上環(huán)烯醚萜生物合成途徑的相關(guān)unigene的獲得，為深入開展山茱萸環(huán)烯醚萜合成代謝途徑及相關(guān)功能基因等研究奠定了基礎(chǔ)。

27山茱萸其他次生代謝相關(guān)基因的鑒定根據(jù)KEGG注釋結(jié)果，共計10條代謝通路中487條unigene可能參與山茱萸其他次生代謝相關(guān)物質(zhì)代謝調(diào)控，見圖3。其中苯丙素類的生物合成途徑（ko00940）所占比例最大，達到4641%，其次是N聚糖的生物合成（ko00510）占986%；莨菪烷、哌啶、吡啶生物堿生物合成（ko00960）占862%；異喹啉生物堿生物合成（ko00950）占801%，而黃酮、黃酮醇（ko00944）和花青素生物合成（ko00942）最少，分別占144%，082%。山茱萸中多種次生代謝相關(guān)基因的鑒定暗示著其次生代謝合成的復(fù)雜性和化學(xué)成分的多樣性，為后續(xù)再山茱萸中尋找新化合物提供了線索，也為闡明山茱萸功效的物質(zhì)基礎(chǔ)提供了理論基礎(chǔ)。

橫坐標表示unigene個數(shù)。

28山茱萸次生代謝合成中的后修飾酶相關(guān)基因的鑒定次生代謝的后修飾主要包括骨架的氧化/羥基化和糖基化，分別由不同超基因家族編碼的細胞色素P450單加氧酶和糖基轉(zhuǎn)移酶進行催化[12]。氧化是次生代謝產(chǎn)物合成后修飾中最常見的方式，其中絕大部分依賴細胞色素P450單加氧酶（CYP450）的催化。CYP450能在溫和的條件下把底物中的碳氫鍵進行氧化，進行單加氧反應(yīng)，從而參與萜類、生物堿、苯丙烷類等多種次生代謝產(chǎn)物的生物合成[13]。通過搜索山茱萸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)在SwissProt數(shù)據(jù)庫的注釋結(jié)果，共找到153條可能的CYP450，隸屬于26個CYP450家族，見表4。屬于CYP71家族的unigene最多，有1699%；其次是CYP72，CYP82，CYP714，分別為980%，784%，784%；而CYP73，CYP97，CYP703，CYP711家族僅各有1個unigene。山茱萸轉(zhuǎn)錄組中大量CYP450的發(fā)現(xiàn)為進一步分析具體CYP450的催化功能，闡述山茱萸次生代謝后修飾氧化反應(yīng)機制打下了很好的基礎(chǔ)。

糖基化是植物次生代謝產(chǎn)物的一種廣泛存在的修飾作用。尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶（UDPglycosyltransferases，UGT）其能催化糖基從UDP糖轉(zhuǎn)移到多種受體[14]。前人已經(jīng)從山茱萸中分離得到大量的糖苷類物質(zhì)，如山茱萸苷、馬錢苷等[1]，而UGT是否參與這些苷類物質(zhì)的形成尚未清晰。通過搜索山茱萸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)在SwissProt數(shù)據(jù)庫的注釋結(jié)果，共找到隸屬于13個UGT亞家族的72條可能的UGT，其中包括2個UGT71，11個UGT73，12個UGT74，3個UGT76，1個UGT82，10個UGT83，13個UGT86，6個UGT87，1個UGT88，5個UGT89，4個UGT90，3個UGT91，1個UGT92。

3討論

山茱萸作為常用大宗中藥材，隨著其在臨床及中成藥中應(yīng)用的不斷擴大，其化學(xué)成分、藥理作用等方面的研究也不斷深入，但其分子遺傳和基因組方面的研究還未見報道，嚴重影響了山茱萸的次生代謝生物合成的研究及次生代謝產(chǎn)物的開發(fā)利用。為了彌補這一空白，本研究利用HiSeq2500技術(shù)對山茱萸果實進行轉(zhuǎn)錄組測序，經(jīng)組裝以及注釋，獲得了96 032條unigene 序列，平均長度為59053 bp，N50為937 bp，轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)飽和度檢驗表明檢測到的基因數(shù)目趨于飽和。以上研究結(jié)果表明，本次序列組裝的效果較好，獲得了大量的遺傳信息，可滿足后續(xù)轉(zhuǎn)錄組分析的基本要求，且HiSeq2500測序技術(shù)可作為批量挖掘山茱萸功能基因的有效手段。

在對獲得unigene進行Nr，SwissPro等數(shù)據(jù)庫進行注釋后發(fā)現(xiàn)，約有6306%的unigene在數(shù)據(jù)庫中無法匹配到已知基因。然而，大量的unigene不能被已知數(shù)據(jù)庫注釋這一現(xiàn)象在許多物種的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中均存在，如丹參[5]、虎杖[15]、薯蕷[16]等。推測這可能與部分所得unigene片段較短、山茱萸及其近緣物種基因組研究較少，公共數(shù)據(jù)庫中缺乏屬基因組、EST 和蛋白質(zhì)序列信息、山茱萸中新基因的存在等因素都有關(guān)聯(lián)。

山茱萸中化學(xué)成分復(fù)雜，主要含有環(huán)烯醚萜、三萜、黃酮、有機酸、多糖等多種類型的次生代謝產(chǎn)物，然而對這些次生代謝產(chǎn)物的生物合成途徑仍不太清晰，山茱萸中催化這些重要次生代謝產(chǎn)物生物合成的酶及相關(guān)基因仍未見報道。本研究通過序列相似性分析及公共數(shù)據(jù)庫比對、注釋，共獲得環(huán)烯醚萜生物合成相關(guān)unigene 84條，其他次生代謝產(chǎn)物生物合成相關(guān)unigene 487條，并獲得具有氧化/羥基化功能的CYP450基因153條；具有糖基化功能的UGT72條。以上山茱萸次生代謝合成相關(guān)unigene的獲得，為進一步開山茱萸次生代謝生物合成的相關(guān)分子機制、山茱萸相關(guān)功能基因克隆及功能分析等研究奠定堅實的基礎(chǔ)，也為后續(xù)開展山茱萸的分子生物學(xué)研究提供寶貴的基因數(shù)據(jù)來源。

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[責任編輯呂冬梅]

[收稿日期]20160801

[基金項目]2014年度河南中醫(yī)學(xué)院省屬高校基本科研業(yè)務(wù)費專項（2014KYYWFZZCX03）

[通信作者]*趙樂，博士，講師，主要從事分子生物學(xué)研究，Email：zhaole1983@126com

[作者簡介]朱畇昊，博士，講師，主要從事藥用植物學(xué)研究，Email：guxinhan123@163com