錢睿創(chuàng) 王 崢 史旭軍 王 瑞

(1.北京化工大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院， 北京 100029； 2.北京化工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 北京 100029；3.桂林長發(fā)小寨生物科技有限公司， 桂林 541000； 4.北京佰草國頤堂醫(yī)學(xué)研究院, 北京 100012)

引 言

我國人工林規(guī)模發(fā)展迅速，已經(jīng)成為世界上人工林保存面積最大的國家[1]。在人工速生豐產(chǎn)林工程中，楊樹為主要造林樹種之一。速生楊規(guī)模的快速發(fā)展在滿足人們對木材的需求的同時，產(chǎn)生了大量的采伐剩余物和加工剩余物，這些剩余物含有豐富的生物活性物質(zhì)、纖維素以及半纖維素[2-6]。鄭光耀等[7]利用楊樹木屑和樹皮替代棉籽殼栽培姬菇和金針菇；吳春山[8]用木屑制作飼料，其中利用楊樹木屑制作的飼料效果最好；李曉鳴等[9]利用楊樹木屑栽培黑木耳，黑木耳的產(chǎn)量比常規(guī)椴木屑增加7.7%。木質(zhì)纖維素量大、廉價的特點[10]使得其具有替代淀粉類生物質(zhì)水解為單糖進而發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇、益生菌等的潛能。然而，目前關(guān)于木質(zhì)纖維素水解成單糖的研究主要集中在農(nóng)作物秸稈上[11-13]，對林業(yè)剩余物的研究較少。

木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)在酶解前要進行預(yù)處理，脫除半纖維素和木質(zhì)素，增加原料的孔隙率，暴露出更多的活性位點，使得纖維素酶與纖維素的接觸更加充分，從而提高酶解速率。在酶解過程中，酶與底物充分有效的接觸是控制酶解速率的關(guān)鍵因素。Hodge等[14]研究了傳質(zhì)對玉米秸稈酶解速率的影響，結(jié)果表明，當?shù)孜餄舛冉咏?0%時傳質(zhì)的限制變得明顯；Arantes等[15]指出纖維素酶的高成本仍然是生物乙醇商業(yè)化的一大障礙。以上研究表明合適的底物濃度及纖維素酶添加量對于酶解工藝的優(yōu)化是十分必要的。

富硒酵母主要指以釀酒酵母為載體，將環(huán)境中無機硒富集并轉(zhuǎn)化為更容易被生物體利用和吸收的有機硒的一類特種酵母[16-19]。富硒酵母是一種重要的食用/飼用生產(chǎn)菌株，具有獨特的生理功能，能夠增加人體或動物體的硒含量，改善健康狀況。富硒酵母在生長過程中對氮源、碳源、磷源的要求較高，因此使用流加發(fā)酵策略有利于富硒酵母的高密度培養(yǎng)。Shi等[20]的研究表明在日糧中添加富硒酵母可以改善山羊的精液質(zhì)量，通過短期膳食補充有機硒，能夠以較低的飼養(yǎng)成本提高其繁殖性能；婁興丹等[21]從新疆富硒土壤中篩選出一株紅酵母X- 20，以甘油作為碳源，在發(fā)酵過程中流加亞硒酸鈉，使得菌株X- 20的硒含量達到5 009 μg/g；Wang等[19]研究了富硒酵母的補料發(fā)酵策略，結(jié)果表明，在酵母對數(shù)生長后期添加亞硒酸鈉對其生長影響較小，發(fā)酵結(jié)束時酵母干重102 g/L，硒含量為2 020 μg/g。富硒酵母在生長過程中對碳源的需求量很大，從資源循環(huán)、廢棄物再利用的角度來考慮，以楊木屑酶解液作為碳源替代傳統(tǒng)的葡萄糖發(fā)酵制備富硒酵母具有實際應(yīng)用意義。

本文以楊樹木屑為原料，根據(jù)文獻[22]提供的方法對木屑進行預(yù)處理。將預(yù)處理后的木屑渣作為研究對象，探究纖維素酶水解的可行性及最佳水解條件，并探討了利用酶解液作為碳源發(fā)酵制備富硒酵母的可行性，以期為人工林剩余物的工業(yè)化利用提供理論和技術(shù)參考。

1 實驗部分

1.1 實驗原料和儀器

1.1.1實驗原料

楊樹木屑原料由南京林業(yè)大學(xué)提供，粒度250～420 μm，置于105 ℃烘箱中烘干備用；纖維素復(fù)合酶由康地恩生物科技公司提供，酶活70 FPU/mL(filter paper unit，即濾紙酶活，1FPU表示在1 min內(nèi)產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所用的酶量)；酵母粉、蛋白胨，分析純，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；葡萄糖、七水硫酸鎂，分析純，北京化工廠；磷酸二氫鉀、硫酸銨，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

種子培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L。

葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，葡萄糖25 g/L，硫酸銨10 g/L，七水硫酸鎂6 g/L，磷酸二氫鉀9 g/L。

楊木屑酶解液發(fā)酵培養(yǎng)基：用酶解液替代發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖，其余成分不變。

1.1.2實驗儀器

KHY- 2H型高溫高壓反應(yīng)釜，北京金仕德科技有限公司；X- 620型筆式pH計，上海三信儀表廠；LDZX- 75KBS立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；HZQ- F100全溫震蕩培養(yǎng)箱，太倉培英實驗設(shè)備有限公司；Mini- 15K微型高速離心機，杭州奧盛儀器有限公司；RE52- 99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，北京天林恒泰科技有限公司；BIOTECH- 5JG發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備工程有限公司；SBA- 40D生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所；UV- 5500PC紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；DM500型顯微鏡，德國徠卡公司。

1.2 實驗方法

1.2.1楊樹木屑組分分析

采用美國國家可再生能源實驗室(NREL)提供的方法測定楊樹木屑組分的含量[23]。纖維素的含量以葡萄糖質(zhì)量與原料質(zhì)量的比值表示，半纖維素的含量以木糖、阿拉伯糖的質(zhì)量和與原料質(zhì)量的比值表示，計算公式如式(1)、(2)所示。

(1)

(2)

式中，wc為纖維素含量(質(zhì)量分數(shù))，%；m1為水解液中葡萄糖的質(zhì)量，g；m為原料楊樹木屑的質(zhì)量，g；wh為半纖維素含量(質(zhì)量分數(shù))，%；m2為水解液中木糖的質(zhì)量，g；m3為水解液中阿拉伯糖的質(zhì)量，g。

1.2.2楊樹木屑預(yù)處理及酶解液制備

在固液比1∶5、醋酸濃度5%、溫度170 ℃條件下保溫30 min對楊樹木屑進行預(yù)處理。保溫結(jié)束后待反應(yīng)釜自然降溫至80 ℃，取出反應(yīng)罐，置于冷水中冷卻至室溫。水洗體積倍數(shù)定義為用于對預(yù)處理液脫毒的水洗體積與預(yù)處理液體積的比值，充分水洗表示水洗液pH呈中性且基本無色，水洗的目的是去除固體剩余物上吸附的糠醛、乙酸等有害物質(zhì)。水洗后的固體置于105 ℃烘箱中干燥至恒重，進行酶解條件優(yōu)化[24-25]。葡萄糖含量采用SBA- 40D生物傳感分析儀測定，纖維素轉(zhuǎn)化率根據(jù)式(3)計算

(3)

式中，α為纖維素的轉(zhuǎn)化率，%；m4為酶解液中葡萄糖的質(zhì)量，g；m5為固體剩余物中葡聚糖的質(zhì)量，g。

1.2.3發(fā)酵制備富硒酵母

菌種活化 將斜面保存的菌種挑出一環(huán)接種于小試管中，在30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h。按照1%的接種量將試管中的酵母接種于搖瓶中，30 ℃、200 r/min下培養(yǎng)16 h。

發(fā)酵培養(yǎng) 按照5%的接種量將搖瓶中的菌種轉(zhuǎn)接到發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐裝液2 L，調(diào)節(jié)初始轉(zhuǎn)速為200 r/min，每隔1 h增加50 r至轉(zhuǎn)速為500 r/min，之后維持恒定轉(zhuǎn)速，pH=5.3±0.1，通氣量3 L/min。接種后每4 h取樣測定葡萄糖濃度和酵母生物量，用顯微鏡觀察菌種生長狀態(tài)，同時留樣用來測定硒含量。

發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化 以酵母生長必須依賴的碳源、氮源、磷源等為自變量，即硫酸銨、磷酸二氫鉀和硫酸鎂濃度為因素，設(shè)計三因素四水平正交試驗[26]，見表1，不考慮成分的交互作用，以酵母生物量作為指標判斷最適的培養(yǎng)基濃度。

表1 L9(43)正交試驗的因素和水平

1.2.4酵母硒含量測定及分析

原始培養(yǎng)基中葡萄糖消耗完畢后，開始流加含有亞硒酸鈉的高濃度葡萄糖，每隔4 h取樣，用去離子水重懸3次，離心，凍干。稱取0.1 g左右干酵母，加入濃硝酸5 mL，160 ℃下高溫高壓消解2～3 h至液體澄清透明，采用催化- 分光光度法測定酵母硒含量[19,27]。

2 結(jié)果與討論

2.1 預(yù)處理前后的楊樹木屑組分

如表2所示，與原料相比，預(yù)處理后經(jīng)充分水洗的固體剩余物中纖維素的含量提高了49.4%，半纖維素的含量下降了85.1%，表明預(yù)處理的效果十分明顯，能夠溶解大部分的半纖維素。由于稀酸對木質(zhì)素的降解作用有限，故大部分木質(zhì)素得以保留。

表2 預(yù)處理前后楊木組分含量

2.2 酶解條件優(yōu)化

2.2.1水洗體積

稀酸預(yù)處理能夠有效提高纖維素酶的酶解效果，其原理是半纖維素在稀酸溶液中降解為單糖或寡糖，造成纖維素膨脹、比表面積增大，有利于纖維素酶對纖維素的分解，從而提高了纖維素轉(zhuǎn)化率。在預(yù)處理過程中，糖類的降解產(chǎn)物如糠醛、羥甲基糠醛、甲酸、乙酸等能夠顯著抑制纖維素酶的活性，故需要對預(yù)處理后的木質(zhì)纖維材料進行脫毒。最簡單有效的脫毒方法是水洗法，即用大量水將木屑渣中的糠醛、乙酸等有害物質(zhì)除去，之后加入纖維素酶酶解。表3為不同水洗體積下固體剩余物的酶解情況，考慮到未經(jīng)充分水洗的木屑渣上可能吸附有因預(yù)處理而降解生成的葡萄糖，因此計算纖維素轉(zhuǎn)化率時需要扣除此部分葡萄糖的濃度。分別取0、5、10倍體積水洗的固體木屑渣各10 g，加入緩沖液60 mL，充分搖勻，上清液中的葡萄糖濃度分別為0.23～0.27、0、0 g/L?？鄢吮尘皾舛群?，木屑渣在不同水洗體積下的纖維素轉(zhuǎn)化率分別為26%、41%、47%和56%，充分水洗的木屑渣纖維素轉(zhuǎn)化率是未經(jīng)脫毒的2.1倍。從經(jīng)濟性上分析，充分水洗的方式雖然提高了纖維素轉(zhuǎn)化率，但是需要消耗大量的水資源，所以綜合纖維素轉(zhuǎn)化率和經(jīng)濟性雙重考慮，決定選擇10倍水洗體積的固體剩余物進行酶解最適條件的探究。

表3 水洗體積對酶解的影響

2.2.2固液比

固液比表示為烘干的木屑質(zhì)量與緩沖液體積的比值(g/mL)，固液比決定酶解液中還原糖濃度的上限，當?shù)孜锍渥闱覀鳠醾髻|(zhì)良好時，酶解效果佳。在纖維素酶添加量20 FPU/g、pH=4.8、50 ℃條件下，水解48 h，考察不同固液比下纖維素的轉(zhuǎn)化率，結(jié)果如圖1所示。在考察的固液比范圍內(nèi)，葡萄糖濃度隨著固液比的增大而增大，纖維素轉(zhuǎn)化率則是先增大后減小，當固液比為1∶5時葡萄糖濃度達到最大值，固液比1∶6時纖維素轉(zhuǎn)化率最高達到56%。葡萄糖濃度和纖維素轉(zhuǎn)化率的非同步性表明隨著固液比的增大，水解條件發(fā)生了變化。分析其原因，固液比過高阻礙了纖維素酶與纖維素的有效碰撞，使得局部底物不能充分與酶接觸；同時，水解產(chǎn)物葡萄糖、纖維二糖等由于體系流動性下降造成局部濃度過高，對纖維素酶形成產(chǎn)物抑制。因此，確定固液比1∶6作為底物添加量。

2.2.3纖維素酶添加量

纖維素酶不菲的價格要求在酶添加量和酶解率之間尋找一個平衡點。在固液比1∶6、pH=4.8、50 ℃下酶解48 h，以纖維素酶添加量為自變量探究其對酶解的影響。由圖2可知，當纖維素酶量由7.5 FPU/g提高至22.5 FPU/g時，水解液中葡萄糖濃度由39 g/L上升至55 g/L，纖維素轉(zhuǎn)化率提高41%，在此基礎(chǔ)上繼續(xù)增加酶量，轉(zhuǎn)化率基本保持不變。這是因為纖維素的結(jié)合位點有限，多余的酶不能有效攻擊這些位點，因此最佳酶用量為22.5 FPU/g。

2.2.4pH

纖維素酶是由多種水解酶組成的復(fù)雜蛋白類酶系，其活性與pH密切相關(guān)。在固液比1∶6，酶添加量22.5 FPU/g、50 ℃酶解48 h的條件下，分別考察了楊樹木屑在不同pH體系中的酶解情況。由圖3可知，隨著pH上升，葡萄糖濃度和纖維素轉(zhuǎn)化率同步先增大后減小，當pH為4.8時，葡萄糖濃度最大，酶解效果最好，因此酶解的最適pH為4.8。

2.2.5酶解時間

考察楊樹木屑在0～72 h的纖維素酶解情況，見圖4。分析不同時間段的葡萄糖濃度和平均酶解速度，平均酶解速度定義為在0～t時間內(nèi)每h每L酶解液中產(chǎn)生葡萄糖的量(單位為g/(L·h))。當酶解時間超過48 h，葡萄糖濃度基本不再增加，同時平均酶解速度下降趨勢變得極為緩慢，故最適酶解時間為48 h。

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

利用SPSS軟件對培養(yǎng)基中的硫酸銨、磷酸二氫鉀和硫酸鎂濃度進行正交優(yōu)化，見表4。從表5菌體密度表示值OD600的結(jié)果來看，因素B為最主要影響因素，其次為因素A，影響程度次序為B>A>C。

表4 正交試驗設(shè)計及描述統(tǒng)計

從表6的多重比較結(jié)果來看，A4、A3、A2和A1之間差異顯著，A2最好；同樣，從菌密度表示值OD600角度分析因素B和C，B4和C3最好。因此培養(yǎng)基最佳組合為A2B4C3，即最佳培養(yǎng)基配方為硫酸銨10 g/L，磷酸二氫鉀9 g/L，硫酸鎂6 g/L。

表5 OD600方差分析

表6 因素A各水平均值多重比較

2.4 楊樹木屑酶解液發(fā)酵制備富硒酵母

2.4.1酵母利用酶解液作為碳源的可行性探究

將酵母分別接種于酶解液及葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，探究酵母菌利用酶解液的可行性。圖5是酵母菌在兩種培養(yǎng)基中的生長曲線，可以看出，酵母在酶解液中的長勢良好，適應(yīng)力較強，能夠快速進入對數(shù)生長期，但是在對數(shù)生長中后期，即發(fā)酵16 h以后，酵母在葡萄糖培養(yǎng)基中的長勢趨于緩慢，這可能是由于酶解液中存在少量抑制物，酵母生長過程中受到的環(huán)境脅迫增強，使得發(fā)酵周期延長。發(fā)酵時長36 h，酵母菌在葡萄糖培養(yǎng)基中的生物量為5.47 g/L，在酶解液中的生物量為5.2 g/L，表明酵母菌完全能夠利用楊樹木屑酶解液作為碳源。

2.4.2酵母在5 L發(fā)酵罐中的生物量及富硒效果分析

從圖5看出，搖瓶中發(fā)酵16 h的酵母菌處于對數(shù)生長中期，活力最高，因此選擇16 h的酵母菌作為種子液接種于5 L發(fā)酵罐中。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮初始糖濃度50 g/L左右的楊木酶解液至葡萄糖濃度500 g/L，同時添加一定量的亞硒酸鈉作為補料培養(yǎng)基。

初始培養(yǎng)基中的葡萄糖被消耗殆盡后，開始流加濃縮的楊木酶解液，這樣既補充了酵母生長所需的碳源，又最大限度地降低了亞硒酸鈉對酵母的毒害作用，提高了無機硒轉(zhuǎn)化為有機硒的效率。由圖6可知，酵母菌在發(fā)酵罐中的生長情況與搖瓶中酵母的長勢高度吻合，在8 h左右進入對數(shù)生長期，36 h發(fā)酵基本結(jié)束，酵母菌在酶解液培養(yǎng)基與葡萄糖培養(yǎng)基中的生物量分別為23.9 g/L和29.5 g/L。在對數(shù)生長中期以前，酵母菌在兩種培養(yǎng)基中的長勢相當，以對數(shù)生長中期為節(jié)點，酵母菌在酶解液中的生長速度變緩，這是由于高濃度酶解液被作為碳源補充到發(fā)酵罐內(nèi)，使得罐內(nèi)的抑制物不斷積累，造成酵母長勢低于其對照組葡萄糖培養(yǎng)基。

圖7是單位酵母硒含量隨發(fā)酵時間的變化曲線。發(fā)酵8 h開始流加含有亞硒酸鈉的酶解濃縮液，單位酵母硒含量隨發(fā)酵時長呈逐步增加的趨勢，在40 h達到最大值。但是發(fā)酵時長17.7 h的單位酵母硒含量要比發(fā)酵13.2 h的下降24.4%，這是因為單位酵母硒含量是由酵母生物量和硒添加量共同決定的，由于酵母生長速度和無機硒添加量的非同步性，造成在這段時間內(nèi)單位酵母硒含量的下降，而硒濃度的下降在某種程度上降低了對酵母的毒性，使得酵母菌快速進入生長對數(shù)期。發(fā)酵30 h左右，酵母生長進入穩(wěn)定期，發(fā)酵36 h左右，發(fā)酵停止，每L發(fā)酵液中酵母干重達23.9 g，單位酵母硒含量超過3 500 μg/g。

3 結(jié)論

(1)酶解楊樹木屑的最優(yōu)條件為：固液比1∶6(g/mL)，纖維素酶添加量22.5 FPU/g，pH=4.8，酶解時間48 h。最優(yōu)條件下酶解液中葡萄糖濃度達55 g/L，纖維素轉(zhuǎn)化率56%。稀醋酸預(yù)處理后木屑渣中仍然保存大部分的木質(zhì)素，阻礙了纖維素與纖維素酶的有效接觸，故除去木質(zhì)素后纖維素轉(zhuǎn)化率有望進一步提高。

(2)酶解液作為碳源發(fā)酵制備酵母的可行性探究結(jié)果表明，酵母完全能夠利用酶解液中的葡萄糖。

(3)在5 L發(fā)酵罐中進行富硒酵母發(fā)酵實驗，發(fā)酵時間36 h，每L發(fā)酵液中酵母干重23.9 g，酵母硒含量超過3 500 μg/g。