孔子榮，李 凡，李三木，何奇松，曾詠芳，楊可妍，馮淑萍 ，孫翔翔，熊 毅，顏健華*

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530004；3.廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西 南寧 530001)

【研究意義】豬流感病毒(Swine influenza virus，SIV)可引起豬群暴發(fā)急性、高度接觸性傳染病，屬于正粘病毒科A型屬單股負(fù)鏈分節(jié)段RNA病毒，由8個(gè)獨(dú)立RNA片段組成，分別編碼流感病毒結(jié)構(gòu)蛋白(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1和M2)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1和NS2)[1]。20世紀(jì)70年代之前，豬流感主要在歐美大陸以地方性方式流行，之后傳到我國(guó)，迄今已遍布世界各地。SIV在以不為人知的速度和方式悄然進(jìn)化，而豬作為“混合器”和“孵育器”[2]，扮演著流感病毒進(jìn)化的中間宿主角色。在豬群中流行的流感病毒亞型包括H1N1、H3N2、H1N7、H4N6、H5N1和H9N2等，而H9N2亞型流感病毒相對(duì)于H5N1亞型流感病毒更容易跨越物種屏障，可在人群中傳播[3]。因此，對(duì)SIV進(jìn)行序列分析不僅對(duì)其流行防控意義重大，還具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】流感病毒8個(gè)基因節(jié)段中的HA基因編碼血凝素蛋白，該蛋白是流感病毒重要的表面蛋白，可與靶細(xì)胞表面的唾液酸受體位點(diǎn)結(jié)合，幫助病毒顆粒黏附于細(xì)胞表面而侵入細(xì)胞，種間傳播的機(jī)制取決于HA序列上受體結(jié)合位點(diǎn)與宿主細(xì)胞表面病毒受體的結(jié)合特性[4]。HA蛋白的裂解性、受體特異性和糖基化是決定流感病毒感染性和致病性的重要因素[5]，因此HA基因研究是流感病毒研究工作的重要熱點(diǎn)。較多學(xué)者對(duì)各亞型流感病毒也進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查及基因組測(cè)定等研究[6]，如魏東等[7]建立H9N2亞型豬流感病毒感染BALB/c小鼠動(dòng)物模型，為研究病毒致病機(jī)制提供模型動(dòng)物；殷斌等[8]對(duì)山東H9N2亞型豬流感病毒進(jìn)行了分離鑒定及遺傳進(jìn)化分析；劉曉敏等[9]建立了禽源H9N2亞型豬流感病毒反向遺傳操作技術(shù)平臺(tái)；孫王楊吉等[10]對(duì)江蘇分離的1株H9N2亞型豬流感病毒進(jìn)行了遺傳進(jìn)化和致病性分析。張玉霞等[11]對(duì)分離的1株產(chǎn)蛋高峰雞H9N2進(jìn)行HA基因序列分析，發(fā)現(xiàn)目前H9N2病毒亞型呈現(xiàn)變異趨勢(shì)，毒力雖未增強(qiáng)，但能逃避某些疫苗所誘導(dǎo)抗體的保護(hù)作用。張瑞華等[12]利用表達(dá)的H9N2亞型豬流感病毒HA重組蛋白，建立了H9亞型豬流感病毒抗體的LAT檢測(cè)方法。【本研究切入點(diǎn)】近年來(lái)，低致病性H9N2亞型流感病毒的宿主范圍越來(lái)越寬，對(duì)HA基因的研究在疫情監(jiān)測(cè)和跨種間傳播機(jī)制等方面均具有重要意義，但目前國(guó)內(nèi)缺乏豬源H9N2流感病毒的HA基因分析數(shù)據(jù)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】對(duì)2011年從廣西百色某豬場(chǎng)分離獲得的2株H9N2豬流感病毒分離株的HA基因進(jìn)行同源性比對(duì)、進(jìn)化分析和編碼蛋白氨基酸重要功能位點(diǎn)闡述，了解廣西H9N2亞型SIV的分子生物學(xué)特征及病毒的遺傳變異特點(diǎn)，為廣西豬流感疫情監(jiān)控和人流感的防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

H9N2病毒株A/swine/Guangxi/P2/2011和A/swine/Guangxi/P3/2011(以下稱P2和P3)均由廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心從廣西百色市樂(lè)業(yè)縣送檢的豬肺臟組織病料分離鑒定并保存。SPF雞胚購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

主要試劑及引物：RNA提取試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；AMV反轉(zhuǎn)錄酶及相關(guān)試劑、TaqDNA聚合酶和pMDl8-T載體等購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。用于擴(kuò)增H9亞型豬流感病毒HA全基因的引物由寶生物工程(大連)有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

1.2 HA全基因測(cè)序及分析

將已分離鑒定病毒株的種毒使用PBS液稀釋1000倍后，按每枚0.2 mL接種9日齡SPF雞胚，收取24～96 h雞胚的尿囊液，對(duì)經(jīng)血凝試驗(yàn)鑒定為流感病毒陽(yáng)性雞胚尿囊液進(jìn)行病毒總RNA提取。使用隨機(jī)引物Uni12反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)HA基因片段。再經(jīng)1 %瓊脂凝膠電泳后回收PCR產(chǎn)物進(jìn)行pMDl8-T克隆，鑒定為陽(yáng)性的克隆質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，最后利用DNAstar對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列拼接和分析，并以MEGA 5.0繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 廣西分離株HA基因序列的測(cè)定結(jié)果

經(jīng)序列測(cè)定，P2和P3分離株的HA基因全長(zhǎng)1701 bp，開(kāi)放閱讀框(ORF)全長(zhǎng)1683 bp，共含有560個(gè)氨基酸。分離株和24株參考序列核苷酸和氨基酸的同源性比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表2。其中，在與禽源H9N2亞型流感病毒比較中，P2和P3分離株與A/ChickeiVFiyian/G9/09的核苷酸同源性最高，為98.3 %，氨基酸同源性最高，為98.2 %，二者與北美分離株A/Turkey/Wisconsin/1/66的同源性最低；在與人源H9N2亞型流感病毒的同源性比較中，核苷酸同源性在87.5 %～92.7 %，氨基酸同源性在88.1 %～90.1 %；在與豬源H9N2亞型流感病毒的比較中，與A/Swine/Shanghai/Yl/2009的同源性最高，與A/Swine/Korea/Y452/2004的同源性最低，核苷酸同源性在83.7 %～94.8 %，氨基酸同源性在86.6 %～97.0 %。

表1 引物序列

2.2 HA基因的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果

從圖1可看出，P2和P3分離株的HA基因與A/Duck/HongKong/Y280/97病毒同屬歐亞譜系的Y280亞系；與BJ型代表毒株A/Chicken/Beijing/1/94、A/Chicken/HongKong/G9/97和A/Chicken/Shanghai/F/98等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與代表毒株A/Duck/HongKong/Y439/97和A/Quail/HongKong/Gl/97的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.3 HA基因的受體結(jié)合位點(diǎn)和裂解位點(diǎn)分析

由表3可知，H9N2亞型豬源流感的HA蛋白裂解位點(diǎn)位于335～341 aa間，2株分離株的裂解位點(diǎn)附近氨基酸均為-RSSRGLF-；HA蛋白球狀受體結(jié)合位點(diǎn)由第109、161、163、191、198、202、203、146～150和232～237位氨基酸構(gòu)成；與參考毒株比較，109、161、163、202和203位較保守；第198位與CK/HK/G9/97和CK/SH/F/98均為精氨酸(R)，表明198位點(diǎn)對(duì)受體結(jié)合的親和力具有影響，親和力排序?yàn)槔i氨酸(V)>蘇氨酸(T)>精氨酸R[13]；第234位發(fā)生了谷氨酰胺(Q)→亮氨酸(L)變化，前者存在于禽流感病毒中，后者存在于人流感病毒中。因此，廣西的P2和P3分離株具有與人和豬流感受體結(jié)合的特性。

表3 HA連接肽序列及病毒結(jié)合受體結(jié)合的相關(guān)氨基酸

注：-代表潛在糖基化位點(diǎn)缺失，+代表潛在糖基化位點(diǎn)不缺失。

Note:- stands for potential glycolation site absent，+ stands for not missing.

2.4 HA基因糖基化位點(diǎn)分析

分離株HA蛋白具有8個(gè)保守的潛在糖基化位點(diǎn)，分別位于HA1鏈29、141、218、298、305、313位點(diǎn)和HA2鏈492、551位點(diǎn)(表4)。其中313位點(diǎn)上發(fā)生了脯氨酸(P)→絲氨酸(S)變化，導(dǎo)致新增一個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，該位點(diǎn)在HA1和HA2裂解位點(diǎn)附近，位點(diǎn)的糖基化可影響HA鏈裂解，可能導(dǎo)致病毒的毒力和抗原性發(fā)生變化。

3 討 論

H9N2亞型流感病毒的HA基因演化主要在其北美和歐亞兩大分支中存在，其中北美分支以A/Turkey/Wisconsin/1/66為代表毒株，歐亞分支中存在3個(gè)亞分支，分別是以A/Duck/HongKong/Y280/97為代表的Y280-like、以A/Quail/HongKong/G1/97為代表的Gl-like和以A/Duck/HongKong/Y439/97為代表的Y439-like，我國(guó)大陸大部分分離株主要屬于Y280-like分支，在Y280-like亞分支中還有2個(gè)亞分支[14]。從HA基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)圖可看出，本研究的毒株SW/GX/P2/2011和SW/GX/P3/2011均屬于歐亞分支中的Y280-like，相較于其他物種來(lái)源的流感病毒HA基因，其與禽源HA基因的親緣關(guān)系更近，說(shuō)明本研究的HA基因應(yīng)來(lái)源于禽源H9N2亞型流感病毒，與伍和明等[15]分析認(rèn)為H9N2亞型SIV的HA基因在遺傳演化分支中屬于Y280-like亞分支、且來(lái)源于禽的觀點(diǎn)基本一致，表明在幾年間廣西地區(qū)豬H9N2流感病毒HA基因均處于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，未出現(xiàn)明顯的抗原漂移或突變，可能與H9N2亞型流感病毒具有適應(yīng)性感染豬只的某些HA基因特征有關(guān)，具體的感染和致病機(jī)理需進(jìn)一步探究。但值得注意的是，在基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)中出現(xiàn)了與試驗(yàn)毒株HA基因核苷酸同源性極高的犬H9N2亞型流感病毒，說(shuō)明該型流感病毒具備感染其他哺乳動(dòng)物的基因特征，提示應(yīng)警惕H9N2亞型流感的跨種屬傳播問(wèn)題，與伍和明等[15]的研究結(jié)果一致。本研究中2株分離株的氨基酸裂解位點(diǎn)在335～341 aa間，為RSSR↓GLF，表明HA1和HA2是由兩個(gè)堿性氨基酸互相連接，沒(méi)有多個(gè)堿性氨基酸插入，具有低致病性禽流感病毒特點(diǎn)，但從核苷酸水平分析，絲氨酸(S)與精氨酸(R)僅有一個(gè)堿基的差異，即AGC/AGU-AGG/AGA，因此，此位點(diǎn)附近的氨基酸有突變成堿性氨基酸類(R)的可能，從而使病毒的毒力增強(qiáng)。

H9N2亞型流感病毒的HA蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)形成一個(gè)球狀結(jié)構(gòu)，由第109、161、163、191、198、202和203位的氨基酸組成。本研究的2株分離株在HA蛋白上的第109、161、163、202和203位均高度保守，在198位上為丙氨酸(A)，在其他位為纈氨酸(V)、蘇氨酸(T)和谷氨酸(E)，符合Y280-like亞分支毒株的分子標(biāo)志。Weis等[16]對(duì)H3亞型流感病毒位點(diǎn)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)H9亞型流感病毒HA蛋白的234位為亮氨酸(L)時(shí)，具有結(jié)合SAα-2和6Gal受體特異性，優(yōu)先與人的流感病毒受體蛋白結(jié)合，而HA蛋白的234位為甘氨酸(G)時(shí)具有結(jié)合SAα-2和3Gal受體特異性，優(yōu)先結(jié)合禽的流感病毒受體，當(dāng)HA蛋白的234位為蛋氨酸(M)時(shí)則對(duì)2種受體具有相同的結(jié)合能力。本研究中2株分離株的234位氨基酸均為亮氨酸(L)，說(shuō)明2株分離株具有與人流感受體結(jié)合的傾向。

HA蛋白上的糖基化位點(diǎn)對(duì)維持HA分子結(jié)構(gòu)及功能至關(guān)重要，例如裂解位點(diǎn)附近的寡糖鏈可形成空間屏障進(jìn)而阻礙HA蛋白裂解[17]。本研究的2株流感病毒株均存在于8個(gè)糖基化位點(diǎn)，其中29、141、218、298、305、492和551位點(diǎn)與參考毒株均無(wú)明顯差異，第313位點(diǎn)由于發(fā)生了脯氨酸(P)→絲氨酸(S)變化，導(dǎo)致增加了一個(gè)糖基化位點(diǎn)，這是病毒毒力的進(jìn)化還是病毒對(duì)宿主的適應(yīng)尚需進(jìn)一步探究。Baigent和Mccauley[15,18]應(yīng)用H3模型研究Hl、H5和H7等亞型毒株的HA糖基化位點(diǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，HA蛋白的158位有糖基化位點(diǎn)而NA頸部有氨基酸缺失，或158位沒(méi)有糖基化位點(diǎn)而NA頸部無(wú)氨基酸缺失，可保證病毒有效生長(zhǎng)。本研究2株分離株HA蛋白的158位無(wú)糖基化位點(diǎn)而NA頸部無(wú)氨基酸缺失，說(shuō)明該2株病毒可在宿主體內(nèi)有效生長(zhǎng)。

4 結(jié) 論

廣西2株H9N2亞型豬源流感病毒分離株A/swine/Guangxi/P2/2011和A/swine/Guangxi/P3/2011的HA基因?qū)儆跉W亞普系的Y280亞系，從HA基因的基因?qū)哟畏治?株分離毒株均有毒力增強(qiáng)趨勢(shì)并能在宿主體內(nèi)良好復(fù)制，具備典型的低致病性和與人流感受體結(jié)合的特征。因此，今后應(yīng)加強(qiáng)對(duì)H9N2亞型豬源流感病毒的監(jiān)測(cè)及防控，防止該型流感病毒和其他亞型流感病毒在豬體內(nèi)發(fā)生基因重排，引發(fā)更嚴(yán)重的傳播后果。