高建華，楊大平，楊偉克，丁志偉

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101)

【研究意義】堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)能催化磷酸酯的水解，參與磷酸基團的轉(zhuǎn)移和代謝，幾乎存在于昆蟲機體的各個組織及器官，不僅參與昆蟲機體的能量代謝、生長發(fā)育、激素合成及滯育等過程，而且在對殺蟲劑解毒代謝及病原微生物免疫防御過程發(fā)揮了重要作用[1-2]。ALP酶活力與家蠶的生理狀況密切相關(guān)，激活A(yù)LP酶活性既能增強蠶體的抗逆性，而且有助于提高蠶絲產(chǎn)量和質(zhì)量[3-4]。研究家蠶遭受家蠶核型多角體病毒(Bombyxmorinuclear poyhedro virus, BmNPV)侵染后機體ALP酶活性及其基因的變化規(guī)律，明確堿性磷酸酶在家蠶抗病毒過程中發(fā)揮的功能和作用，為闡明BmNPV的侵染機制及培育抗BmNPV蠶品種的選育提供借鑒和思考。【前人研究進展】昆蟲遭受病原菌侵染時，機體不僅會通過先天性免疫防御系統(tǒng)產(chǎn)生抗菌肽等免疫活性物質(zhì)，抵御抑制或殺滅病原微生物[5]；而且由于機體的正常生理代謝平衡被打破，水解酶、氧化酶、解毒酶等相關(guān)酶的活性均會發(fā)生不同程度的變化[6]。堿性磷酸酶被認(rèn)為是一類與昆蟲抗性密切相關(guān)的水解酶[7]。Leclair等人用螟硫磷處理云杉色卷蛾，機體ALP基因在處理早期顯著上調(diào)表達，酶活性也顯著高于對照組[8]。對除蟲菊酯類殺蟲劑具有抗性的棉鈴蟲幼蟲ALP基因的表達量顯著高于敏感品系，組織表達譜顯示ALP主要在中腸、血淋巴和脂肪體等免疫器官有高表達[9-10]。于歡等研究發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲在HearNPV侵染早期，體內(nèi)ALP酶活性增加，侵染后期ALP酶活性顯著減低，ALP活性的下降與病毒抑制其編碼基因ALP的表達水平有關(guān)[11]。蘇云金芽孢桿菌或黑胸敗血芽孢桿菌感染家蠶早期，中腸ALP基因上調(diào)表達，酶活性被激活，隨著感染時間的延長，中腸組織受損，機體免疫防御功能下降，其ALP活性急劇降低[12-13]。低劑量的微孢子蟲N.B感染家蠶4齡幼蟲，機體ALP酶活性會迅速升高，隨后急劇降低；而用致病力弱的SCM6病原感染家蠶，堿性磷酸酶活性會顯著增加，暗示堿性磷酸酶在抵御病原微生物侵染過程發(fā)揮了一定的功能，但具體作用機制不清楚[14]?！颈狙芯壳腥朦c】家蠶核型多角體病毒以家蠶為寄主，誘發(fā)蠶體發(fā)生血液型濃病，傳染性極強，嚴(yán)重制約了蠶桑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[15]。關(guān)于家蠶抗BmNPV的研究雖然已有許多報道，但BmNPV與宿主的相互作用機制至今仍未能解析清楚。堿性磷酸酶作為昆蟲機體一類重要的調(diào)控酶，既參與機體磷酸基團的轉(zhuǎn)移和水解，還參與機體對外源化合物的解毒代謝及抵御病原微生物的侵染過程[16]。但遭受BmNPV侵染時，蠶體堿性磷酸酶活性及其基因的表達變化規(guī)律的研究相對較少。【擬解決的關(guān)鍵問題】以家蠶ALP為研究對象，經(jīng)口感染BmNPV，探析家蠶機體堿性磷酸酶活性及其基因的表達變化規(guī)律，以期為深入研究和闡明BmNPV的致病機制及宿主與病毒之間的互作關(guān)系提供新線索。

1 材料與方法

1.1 供試材料

家蠶品種為菁松×皓月，恒溫培養(yǎng)箱26 ℃，新鮮桑葉飼育。

主要儀器：Tana 1220 凝膠成像系統(tǒng)，熒光定量PCR儀，BioTek Synergy 2多功能酶標(biāo)儀。主要試劑：動物組織總RNA抽提試劑盒(OMEGA公司，貨號R6834-02)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司，貨號RR047A)，熒光定量試劑Hieff qPCR SYBR?Green Master Mix(上海翊圣生物科技有限公司，貨號11201ES03)。BCA蛋白測定試劑盒(Beyotime公司，貨號P0010S)。堿性磷酸酶活性測試盒(南京建成生物有限公司，貨號A059-1)。

1.2 試驗方法

1.2.1 添食病毒及樣品采集 參照唐芬芬等[17]文獻報道的方法，選取生長發(fā)育良好的家蠶幼蟲，在5齡起蠶時進行喂食BmNPV，每頭家蠶經(jīng)口添食10 μl(4.85×108個/mL)病毒懸液，以添食等量的PBS緩沖液為對照組。添食后，相同條件下用新鮮桑葉飼育。取添食后3、6、9、12和24 h家蠶的血淋巴、脂肪體和中腸，對照組同時取材，每次取樣均設(shè)5次重復(fù)，每個重復(fù)取6頭蠶，樣品收集后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 酶活性測定 取家蠶中腸組織和脂肪體，用PBS緩沖液清洗2～3次，置于電動勻漿器中勻漿5 min，4 ℃，3500 r/min，離心15 min，上清液即為待測酶液。家蠶血淋巴直接在4 ℃條件下，4500 r/min，離心20 min，棄沉淀留上清液，即為待測酶液。根據(jù)BCA蛋白測定試劑盒和堿性磷酸酶測試盒說明書，分別測定蛋白含量及酶活性。

1.2.3 基因表達分析 按照高純總RNA快速提取試劑盒操作步驟提取家蠶血淋巴、脂肪體和中腸總RNA。紫外分光光度計測定RNA樣品濃度，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以家蠶Ribosomal protein 49(RP49，登錄號：NM_001098282)為內(nèi)參基因，堿性磷酸酶基因(NCBI登錄號：NM_001044071.3)為靶標(biāo)基因，利用Primer Premier 5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計定量引物。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物，序列見表1。

熒光定量PCR方法參照Hieff qPCR SYBR?Green Master Mix試劑盒操作說明進行。反應(yīng)體系20 μl，設(shè)定程序：95 ℃，30 s →(95 ℃，5 s →60 ℃，30 s)40個循環(huán)→65 ℃，5 s(然后每次加0.5 ℃，直到95 ℃，5 s)。ABI公司StepOne熒光定量PCR擴增儀記錄實驗結(jié)果，每個樣品均設(shè)4次重復(fù)，根據(jù)公式2-△△CT計算基因的相對表達量。

表1 實時熒光定量PCR引物

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2019和SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 家蠶感染BmNPV后ALP基因的表達變化

實時熒光定量PCR檢測了喂食BmNPV后，家蠶血淋巴、脂肪體和中腸堿性磷酸酶基因的相對表達量，將喂食滅菌水的對照組各個基因的相對表達量設(shè)定為1，喂食BmNPV組各基因的相對表達量若大于1，表明該基因上調(diào)表達，反之則下調(diào)表達。如圖1所示。在感染BmNPV后3和6 h，血淋巴ALP基因的相對表達量無顯著變化，在感染9和12 h時持續(xù)上調(diào)表達，相對表達量分別是對照組的1.9和2.2倍；而在感染24 h血淋巴ALP基因的表達受到抑制，呈下調(diào)表達趨勢。脂肪體ALP基因在感染3、6和9 h無明顯變化，僅在12 h被上調(diào)表達，相對表達量為對照組的2.25倍；在24 h表達量略有降低，為對照組的70 %。中腸ALP在BmNPV感染3 h，相對表達量接近1，無明顯變化；在感染6 h時，基因開始上調(diào)表達，相對表達量逐漸增加，感染12 h時表達量最高，隨后基因表達量急劇減弱，在24 h表達量降至最低，為對照組的55 %。

2.2 BmNPV對家蠶不同組織堿性磷酸酶(ALP)活性的影響

如圖2所示，在BmNPV感染3和6 h，血淋巴的ALP活性略高于對照組，但差異未達到顯著水平；在9和12 h ALP活性分別是對照組的3.1和3.3倍，差異達到極顯著水平(P<0.01)；在24 h，ALP活性顯著低于對照組(P<0.05)。由圖3可知，在BmNPV感染12 h，ALP活性最高為對照組的2.7倍，較對照組差異極顯著(P<0.01)；在24 h ALP活性低于對照組，但差異不顯著。圖4結(jié)果顯示，感染BmNPV，家蠶中ALP的活性在3 h較對照組無顯著變化，在6 h ALP活性顯著高于對照組(P<0.05)，9 h和12 h ALP活性均是持續(xù)高于對照組，差異達到及顯著水平(P<0.01)，而在感染24 h ALP活性極顯著低于對照組(P<0.01)。整體呈現(xiàn)一個先逐漸升高，達到一個峰值，隨后急劇降低的趨勢。

圖1 喂食BmNPV后家蠶不同組織ALP基因的表達量變化Fig.1 Expression of ALP in different tissuse of silkworm after infection by feeding BmNPV

* P <0.05，** P <0.01，表示BmNPV感染與對照組比較，下同*(P <0.05) and **(P <0.01) indicated BmNPV infection compared with the control group, the same as below圖2 喂食BmNPV后家蠶血淋巴堿性磷酸酶酶活性變化Fig.2 Changes of ALP activity in hemolymph of silkworm after feeding BmNPV

圖3 喂食BmNPV后家蠶脂肪體堿性磷酸酶酶活性變化Fig.3 Changes of ALP activity in fat body of silkworm after feeding BmNPV

圖4 喂食BmNPV后家蠶中腸堿性磷酸酶酶活性變化Fig.4 Changes of ALP activity in midgut of silkworm after feeding BmNPV

3 討 論

堿性磷酸酶被認(rèn)為是一類與昆蟲抗性密切相關(guān)的水解酶，在外源化合物和殺蟲劑的解毒代謝及抵御病原微生物的防御過程均發(fā)揮了重要作用。用低濃度的螟硫磷處理云杉色卷蛾12 h，蟲體堿性磷酸酶活性及其基因表達均會顯著增加，機體抗性增強[8]。用菊酯類殺蟲劑處理赤擬谷盜，ALP活性在處理24 h后顯著增加[18]。對除蟲菊酯類殺蟲劑具有抗性的棉鈴蟲品系，其ALP活顯著高于敏感品系[9-10]。HearNPV病毒感染棉鈴蟲，宿主中腸堿性磷酸酶活性與病毒感染劑量及感染時間成正相關(guān)。低劑量的HearNPV感染棉鈴蟲前期，會顯著增強堿性磷酸酶活性，而在感染后期ALP活性會顯著降低[11]。用質(zhì)型多角體病毒(Cytoplasmicpolyhedrosisvirus, CPV)和蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)感染家蠶，在感染早期，ALP活性會增強，而感染后期，由于中腸組織造受一定的損傷，其ALP活性急劇降低[12-13]。用致病力較強的微孢子蟲N.B感染4齡家蠶，其中腸堿性磷酸酶活性顯著降低；而用致病力弱的SCM6病原感染家蠶，堿性磷酸酶活性會出現(xiàn)一定程度的升高[14]。

本研究結(jié)果表明，在感染BmNPV早期，家蠶不同組織的堿性磷酸酶活性及ALP基因表達量均有一定程度的升高，隨著感染時間的延長，ALP基因表達受到抑制，編碼的堿性磷酸酶活性也相應(yīng)的降低。家蠶感染BmNPV后，機體不同組織的堿性磷酸酶基因?qū)Σ《卷憫?yīng)的時間存在一定差異，經(jīng)口添食BmNPV，病毒首先侵染中腸，隨后進入血淋巴，最后才侵染脂肪體，所以經(jīng)口感染BmNPV，中腸在侵染6 h時，ALP基因開始顯著上調(diào)，酶活性隨之增高；血淋巴的堿性磷酸酶及其基因在感染9 h才開始增加；而脂肪體僅在感染12 h，ALP基因上調(diào)表達，編碼的堿性磷酸酶活性也隨著增強。另外，經(jīng)口感染BmNPV，中腸和血淋巴ALP基因在感染早期無顯著變化，感染中期開始顯著上調(diào)表達，后期急劇下調(diào)表達，整體呈現(xiàn)出先增加后急劇減弱的趨勢，編碼的堿性磷酸酶活性變化規(guī)律與基因表達變化趨勢基本一致。

4 結(jié) 論

經(jīng)口感染BmNPV，家蠶中腸、血淋巴和脂肪堿性磷酸酶活性及其基因的表達量在感染中期增加，感染后期會急劇減弱，暗示ALP與BmNPV對蠶體的侵染存在一定的相關(guān)性，推測其可能參與了家蠶抗BmNPV的防御過程，但作用機制有待進一步的研究探索。