李建鳳 ， 黃 茜 ， 廖立敏 *

（1.內(nèi)江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，四川內(nèi)江641100；2.四川省高等學(xué)校“果類廢棄物資源化”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川內(nèi)江641100）

杏鮑菇含蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素和鈣、鎂、銅、鋅等多種營養(yǎng)成分，此外還含有多糖、多肽、酚類、海藻糖等活性物質(zhì)，具有促進(jìn)腸胃消化、防止心血管疾病及提高免疫力等功效 （劉鵬等，2011；潘崇環(huán)等，2004）。杏鮑菇主要作為食材被利用，對它的研究大多集中在栽培技術(shù) （Shoji等，2014；李月梅等，2012）、病蟲害防治（Russo 等，2013）、加工工藝及營養(yǎng)成分（Carbonero 等，2016；李志豪等，2009）等方面，有關(guān)其生物活性成分的提取及性質(zhì)研究較少，僅見于蛋白質(zhì)、多糖等（鐘耀廣等，2007）。黃酮類化合物是普遍存在于植物、食用菌中的一類生物活性成分，具有抗氧化、增強(qiáng)免疫、抗感染、抗菌、抗病毒、抗過敏等多種生物活性；另外，黃酮類化合物對動物的生產(chǎn)性能有明顯的促進(jìn)作用，其作為飼料添加劑有助于動物的健康育肥、提高免疫力、減少抗生素使用等，對于提高肉類品質(zhì)具有重要意義，因此受到學(xué)者的廣泛關(guān)注（張冰溪等，2017；郝斯佳等，2015；馮香安等，2011；張平平等，2011）。目前，黃酮類化合物的提取方法主要有溶劑提取法、超臨界流體萃取法、微波提取法、超聲波提取法、雙水相萃取分離法、酶解法、半仿生提取法等（李淑榮等，2018；張偉等，2014；林英男等，2014；Pan 等，2012）。 其中，微波提取法具有耗時短、能耗低、得率高等優(yōu)點(diǎn)（楊京霞等，2015）。本文采用微波提取法提取杏鮑菇中的黃酮類化合物，通過試驗(yàn)探究乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、微波功率及微波時間對杏鮑菇黃酮提取的影響，利用正交設(shè)計(jì)對試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，對于開發(fā)利用杏鮑菇黃酮具有一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器 杏鮑菇粉（杏鮑菇烘干后粉碎獲得），無水乙醇、95%乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉，均為分析純。

電子分析天平（JA2003A），上海精天電子儀器有限公司；紫外可見分光光度計(jì) （UV-mini-1240），島津制作所；中藥高速粉碎機(jī)（DFT-100），溫嶺市林大機(jī)械有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9245A），上海一恒科學(xué)儀器有限公司；低速大容器離心機(jī)（DTL-5-A），上海安亭科學(xué)儀器廠；優(yōu)質(zhì)超純水機(jī)（UPT-Ⅱ-10T），四川優(yōu)普超純科技有限公司；微波·紫外·超聲波三位一體合成萃取反應(yīng)儀（UWave-1000），上海新儀微波化學(xué)科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黃酮的提取 新鮮市售杏鮑菇洗凈，60℃下烘干至恒重，高速粉碎機(jī)粉碎3 min，得到杏鮑菇粉末，置于干燥器中備用。準(zhǔn)確稱取1.000 g杏鮑菇粉末于反應(yīng)瓶中，加入一定量一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇，置于微波提取儀中，在一定的功率下提取一定的時間。提取后離心得到濾液，稀釋至50 mL得黃酮待測液。

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品測定 精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.0200 g，60%的乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，60%乙醇定容，即得質(zhì)量濃度為400μg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液（王勇等，2009）。準(zhǔn)確移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液1.0 mL于25 mL比色管中，加入5%亞硝酸鈉1.0 mL，混勻，靜置6 min，加入10%硝酸鋁1.0 mL，混勻，靜置6 min，加入4%氫氧化鈉10.0 mL，60%乙醇稀釋至刻度線，混勻，靜置15 min，在300～900 nm測定吸收光譜，得最大吸收波長為510 nm。

分別精密移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液 0.0、1.、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL至25 mL的比色管中，60%乙醇稀釋 配 制 成 0.00、16.00、32.00、48.00、64.00、96.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列。以蘆丁空白液作參比，在波長為510 nm處測定吸光度，以吸光度A為橫坐標(biāo)，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液濃度C（單位μg/mL）為縱坐標(biāo)，作線性回歸得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線：C=0.0011+0.01007A，R2=0.9997。

待測液適當(dāng)稀釋后移取2 mL，按上述步驟測定吸光度，計(jì)算杏鮑菇黃酮的得率。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 單因素試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取1.000 g杏鮑菇粉末于反應(yīng)瓶中，對乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、微波功率和微波時間4個因素進(jìn)行考察，固定其中3個因素處于中間水平，改變第4個因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

正交試驗(yàn)：選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、微波功率、微波時間為考察因素，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)各因素的水平，因素及水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn) 乙醇體積分?jǐn)?shù)對杏鮑菇黃酮提取的影響見圖1。在固定液料比40 mL/g、微波時間4 min、微波功率600 W的條件下，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別取40%、50%、60%、70%、80%進(jìn)行試驗(yàn)，杏鮑菇黃酮的得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大而增大，當(dāng)乙醇體積為70%時杏鮑菇黃酮得率接近最大值。黃酮類化合物具有一定的極性，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，乙醇溶液的極性在逐漸改變，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時乙醇溶液的極性與黃酮類化合物的極性更為接近，因而取得較大的得率，初步確定杏鮑菇黃酮提取的乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

液料比對杏鮑菇黃酮提取的影響見圖2。在固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、微波時間4 min、微波功率 600 W 的條件下，液料比分別取 20、30、40、50、60 mL/g進(jìn)行試驗(yàn)，當(dāng)液料比為20～30 mL/g時，杏鮑菇黃酮的得率逐漸增高，在液料比為30 mL/g時得率達(dá)到最大值。液料比越大，擴(kuò)散達(dá)到平衡時殘留在組織內(nèi)部的黃酮類化合物的量越小，因而表現(xiàn)出黃酮類化合物的得率越高。進(jìn)一步增大液料比，杏鮑菇黃酮的得率反而略有下降?？赡苁且毫媳冗^大，影響了物料對微波能量的吸收，另外液料比越大加大了其他雜質(zhì)的溶出，從而影響黃酮的提取。綜合各方面考慮，初步確定液料比為30 mL/g。

微波功率對杏鮑菇黃酮提取的影響見圖3。在固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、液料比40 mL/g、微波時間4 min的條件下，微波功率分別取400、500、600、700、800 W 進(jìn)行試驗(yàn)，在 400 W 到 600 W 之間，杏鮑菇黃酮的得率隨著功率的增加而升高，在600 W達(dá)到最大值，而后功率繼續(xù)增大，黃酮實(shí)際得率反而降低?？赡苁怯捎诠β蔬^大，反應(yīng)過于劇烈導(dǎo)致黃酮類化合物遭到破壞，因而表現(xiàn)出杏鮑菇黃酮得率驟然降低。綜合各方面考慮，初步確定微波功率為600 W。

微波時間對杏鮑菇黃酮提取的影響見圖4。在固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、液料比40 mL/g、微波功率600 W 的條件下， 提取時間分別取 2、3、4、5、6 min進(jìn)行試驗(yàn)，在2 min到4 min時黃酮得率隨時間的增加而升高，在提取時間為4 min時黃酮得率達(dá)到最大值。時間過長，導(dǎo)致其他雜質(zhì)溶解增加，并有少量的黃酮類化合物被破壞，杏鮑菇黃酮實(shí)際得率略有降低。在超過5 min后，大量的黃酮類化合物被破壞，導(dǎo)致杏鮑菇黃酮的得率迅速下降。因而，初步確定最佳時間為4 min。

2.2 正交試驗(yàn) 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。將表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析，結(jié)果見表3。由表3可得，極差B＞A＞D＞C，杏鮑菇黃酮得率受到各因素的影響，液料比（B）對杏鮑菇黃酮得率影響最為顯著，其次是乙醇體積分?jǐn)?shù)（A），再次是微波時間（D），最后是微波功率（C）。表 3中，乙醇體積分?jǐn)?shù) K2＞K1＞K3＞K4，選擇 A2為最優(yōu)水平；液料比 K2＞K1＞K4＞K4，選擇 B2為最優(yōu)水平；微波功率 K3＞K2＞K4＞K1，選擇C3為最優(yōu)水平；微波處理時間K3＞K2＞ K1＞K4，選擇 D3為最優(yōu)水平，最優(yōu)水平組合為A2B2C3D3。

表 2 L16（44）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 極差分析結(jié)果

通過對試驗(yàn)結(jié)果的分析，可得微波提取杏鮑菇黃酮的提取工藝：乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，液料比為30 mL/g，微波功率為600 W，微波時間為4 min。在此條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，杏鮑菇黃酮得率分別為 2.59%、2.63%、2.57%，平均值為2.60%。杏鮑菇黃酮得率高、試驗(yàn)重現(xiàn)性好，說明正交試驗(yàn)得到的杏鮑菇黃酮提取工藝可行。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，液料比為30 mL/g，微波功率為600 W，微波時間為4 min時，杏鮑菇黃酮得率可達(dá)2.60%。在此工藝下，黃酮得率高、試驗(yàn)重現(xiàn)性好，對于開發(fā)利用杏鮑菇黃酮具有一定的參考價值。