睡眠剝奪動(dòng)物模型最新研究進(jìn)展

厚玉姣　石曉靜　苗雯蓉　韓易　巴劍波

摘要 為研究建立新型且模擬度更高的睡眠剝奪模型，本文系統(tǒng)回顧近年來(lái)國(guó)內(nèi)外常用的動(dòng)物睡眠剝奪模型，分析及評(píng)價(jià)其在睡眠機(jī)制研究中的應(yīng)用。指出中醫(yī)藥研究中睡眠剝奪模型應(yīng)用尚不完善，提出基于簡(jiǎn)單生物模型研究生物鐘基因的作用及分子調(diào)節(jié)機(jī)制將是未來(lái)研究的熱點(diǎn)內(nèi)容。

關(guān)鍵詞 綜述;睡眠剝奪;動(dòng)物模型

Recent Research Progress on Animal Sleep Deprivation Models

HOU Yujiao1，SHI Xiaojing1，MIAO Wenrong1，HAN Yi1，BA Jianbo2

（1 Neurology department of naval characteristic medical center，Shanghai 200000，China; 2 Research Department of naval characteristic medical center，Shangha 200000，China）

Abstract In order to establish a new and more simulated sleep deprivation model，this paper reviews the animal sleep deprivation models commonly used at home and abroad in recent years，analyzes and evaluates their application in the study of sleep mechanism.It is pointed out that the application of sleep deprivation model in traditional Chinese medicine researches is not perfect.Further studies should consider the function and molecular regulation mechanism of biological clock gene based on simple biological models.

Keywords Review;Sleep Deprivation;Animal Models

中圖分類(lèi)號(hào)：R338.63文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.2095-7130.2020.04.076

睡眠在人類(lèi)、哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)和爬行動(dòng)物中普遍存在，它是一種以警覺(jué)性和反應(yīng)性降低為特點(diǎn)的活躍狀態(tài)，這種狀態(tài)是快速可逆的并具有極其重要的生理意義[1]。充足的睡眠對(duì)保持身心健康很重要，然而近1/3的成年人每天的睡眠時(shí)間少于6 h[2]。慢性睡眠不足會(huì)導(dǎo)致心血管疾病，代謝異常。急性睡眠剝奪或功能障礙也可能導(dǎo)致葡萄糖代謝改變、激素分泌改變和體質(zhì)量增加[3]。睡眠時(shí)間減少也會(huì)導(dǎo)致認(rèn)知功能受損，Shirley L.Zhang等[4]發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期失眠使腸道微生物群發(fā)生不健康的轉(zhuǎn)變，最終可影響“腸-腦”軸改變認(rèn)知功能，嚴(yán)重的睡眠剝奪甚至可以導(dǎo)致死亡。雖然中醫(yī)沒(méi)有睡眠剝奪這個(gè)概念，但是睡眠剝奪動(dòng)物模型廣泛應(yīng)用于中醫(yī)中藥改善睡眠機(jī)制的研究中。通過(guò)研究動(dòng)物睡眠，可以深入了解人類(lèi)睡眠機(jī)制和功能，進(jìn)而有效認(rèn)識(shí)疾病發(fā)生、發(fā)展規(guī)律。本文就近年來(lái)一些常用動(dòng)物睡眠剝奪模型的制作及評(píng)價(jià)進(jìn)行系統(tǒng)的回顧，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 分類(lèi)綜述

1.1 睡眠剝奪模型動(dòng)物選擇

1.1.1 哺乳動(dòng)物 動(dòng)物睡眠研究主要分為模型研究法和比較研究法。前者通過(guò)監(jiān)測(cè)模型生物的類(lèi)人睡眠狀態(tài)來(lái)了解人類(lèi)睡眠，這些模型生物需要接受一系列實(shí)驗(yàn)操作。而模型的生物效用通常受睡眠與人類(lèi)睡眠相似程度的限制，歷史上模型生物的研究重點(diǎn)是哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物生物鐘包括位于下丘腦視交叉上核（Suprachiasmatic Nucleus，SCN）內(nèi)的“主時(shí)鐘”和位于身體其他組織內(nèi)的“外周生物鐘”?！爸鲿r(shí)鐘”起著“交響樂(lè)隊(duì)指揮”的作用，引導(dǎo)“外周生物鐘”通過(guò)某種未知路徑使動(dòng)物適應(yīng)其進(jìn)食、活動(dòng)和新陳代謝，以適應(yīng)環(huán)境中可預(yù)測(cè)的日常變化。生物鐘通過(guò)時(shí)間調(diào)節(jié)基因表達(dá)來(lái)協(xié)調(diào)生理節(jié)律，以控制核心生物鐘基因和節(jié)律輸出程序。研究發(fā)現(xiàn)生物存在轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋回路網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)由核心轉(zhuǎn)錄激活因子（Bmal1和Clock）和抑制因子（Per和Cry）組成，控制基因表達(dá)的節(jié)律性[6]。而癌癥驅(qū)動(dòng)基因的TP53、MYC以及多功能核受體（Nuclear Receptor Superfamily，NRS），包括Revib、Ror和Ppar家族[7]，也是晝夜節(jié)律鐘的重要調(diào)節(jié)器。目前有幾種關(guān)于睡眠時(shí)間的可能機(jī)制，提示體質(zhì)量與睡眠的關(guān)系可能起著關(guān)鍵作用，較輕的體質(zhì)量代表更高的代謝率和睡眠[8]，也有研究表明大腦體積與睡眠周期中各階段的長(zhǎng)度呈正相關(guān)[9]，雖然多數(shù)研究都闡述過(guò)睡眠，但對(duì)于哺乳動(dòng)物而言，仍然沒(méi)有任何方法可以預(yù)測(cè)睡眠發(fā)作的持續(xù)時(shí)間，不同生物其睡眠結(jié)構(gòu)存在異質(zhì)性，生物鐘均不能完全模擬人類(lèi)的睡眠周期及時(shí)相。

嚙齒類(lèi)動(dòng)物作為低等哺乳動(dòng)物與人類(lèi)睡眠穩(wěn)態(tài)和神經(jīng)生化調(diào)節(jié)機(jī)制相似，較常用于睡眠剝奪模型的建立，同時(shí)具有易繁殖、飼養(yǎng)，手術(shù)操作簡(jiǎn)單及經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢(shì)。經(jīng)皮層腦電描記發(fā)現(xiàn)齲齒類(lèi)動(dòng)物睡眠-覺(jué)醒呈現(xiàn)一定節(jié)律性。大鼠各睡眠周期由不同睡眠時(shí)相構(gòu)成，各睡眠時(shí)相持續(xù)時(shí)間較短，轉(zhuǎn)換頻繁。雖然大鼠睡眠呈片段化，但隨著睡眠潛伏期延長(zhǎng)，大鼠累積覺(jué)醒總時(shí)間呈同步增加趨勢(shì)，累積睡眠總時(shí)間呈同步減少趨勢(shì)。大鼠并不能由覺(jué)醒狀態(tài)（Wake）直接進(jìn)入慢波睡眠（Slow Wave Sleep，SWS），需經(jīng)歷淺睡眠期，同時(shí)也不能直接進(jìn)快入速眼球運(yùn)動(dòng)睡眠（Rapid Eye Movement Sleep，REM），需經(jīng)歷NREM階段[10]。Sprague-Dawley和Wistar是2種常用的雜交鼠，Wistar較Sprague-Dawley有顯著高的睡眠總量比值L/D，因此，光照期睡眠剝奪的Wistar有可能表現(xiàn)出黑暗期睡眠總量的明顯增加。尤為重要的是，大鼠體質(zhì)量和性別對(duì)睡眠均有影響，表現(xiàn)為睡眠時(shí)相的差異，與人類(lèi)睡眠有相似之處[11]。在進(jìn)行睡眠剝奪和腦電記錄時(shí)，應(yīng)充分考慮到上述因素。

一些高級(jí)哺乳動(dòng)物，例如貓、狗、海豚等也用于睡眠剝奪模型的構(gòu)建。2010年R Ursin等人[12]研究貓完全睡眠剝奪對(duì)睡眠波形的影響。Wu MF等人在《美國(guó)生理學(xué)雜志》發(fā)表新發(fā)現(xiàn)的下丘腦神經(jīng)肽，食欲素與嗜睡癥的病因有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)[13]48 h不進(jìn)食不會(huì)引起狗腦脊液下丘腦分泌素1（Hypocretin-1，HCRT-1）水平的顯著變化。然而與基線(xiàn)水平相比，24 h睡眠剝奪使狗HCRT-1水平增加70%，與人類(lèi)有相似的表現(xiàn)。由于海豚睡眠狀態(tài)與安靜時(shí)的清醒狀態(tài)很難區(qū)分，研究者需在寬吻海豚局麻后將電極植入皮質(zhì)（硬膜外、皮質(zhì)內(nèi)等）的位置，進(jìn)行睡眠監(jiān)測(cè)。通過(guò)拍打水面來(lái)喚醒動(dòng)物，或通過(guò)微弱電刺激海豚鰭狀肢進(jìn)行睡眠剝奪的實(shí)施[14]。

1.1.2 簡(jiǎn)單模式生物 哺乳動(dòng)物睡眠結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性引發(fā)了研究者對(duì)簡(jiǎn)單模式生物的興趣，如線(xiàn)蟲(chóng)、果蠅和斑馬魚(yú)，即使模型生物不能模擬人類(lèi)睡眠的各個(gè)方面，但它們?nèi)匀痪哂兄匾难芯績(jī)r(jià)值。近年來(lái)，果蠅（黑腹果蠅）已經(jīng)成為一種強(qiáng)有力的睡眠模型。果蠅繁殖周期短，且建模方法相對(duì)成熟。當(dāng)果蠅靜止?fàn)顟B(tài)大于5 min時(shí)，即處于睡眠狀態(tài)。人類(lèi)基因與果蠅的同源性高達(dá)80%，這些同源基因功能保守，在人類(lèi)和果蠅中承擔(dān)著相似的生物學(xué)功能。目前利用基因修飾技術(shù)已培育出失眠果蠅（insomnia-like，ins.1）[15]，可以從基因角度進(jìn)行睡眠障礙發(fā)生機(jī)制的研究。與哺乳動(dòng)物相比，魚(yú)類(lèi)主要依據(jù)白天的光照保持覺(jué)醒狀態(tài)，即使被剝奪1晚的睡眠，斑馬魚(yú)也不會(huì)在第2天白天打瞌睡。這引起了科學(xué)家濃厚的興趣，因此夜間重復(fù)光照刺激是斑馬魚(yú)常用于睡眠剝奪方式。近期研究發(fā)現(xiàn)生物鐘蛋白per3通過(guò)斑馬魚(yú)體內(nèi)的組胺和GABA信號(hào)促進(jìn)其睡眠穩(wěn)態(tài)，與人類(lèi)有相同之處[16]。簡(jiǎn)單模式生物不僅具有類(lèi)似于哺乳動(dòng)物的睡眠或睡眠相似狀態(tài)，也具有嚙齒動(dòng)物所不具備的研究?jī)?yōu)勢(shì)。

1.1.3 其他模式生物 鳥(niǎo)類(lèi)和哺乳動(dòng)物的睡眠有很多相似之處。在NREM睡眠期間，腦電圖顯示高振幅慢波，與哺乳動(dòng)物一樣，鳥(niǎo)類(lèi)的慢波似乎反映了神經(jīng)元膜電位在動(dòng)作電位的去極化“開(kāi)啟狀態(tài)”和神經(jīng)元靜止?fàn)顟B(tài)的超極化“關(guān)閉狀態(tài)”之間的緩慢振蕩[17]。最近一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在短期（8 h）睡眠剝奪后鴿子腦電圖顯示SWA增加[18]。爬行動(dòng)物在行為和體植物學(xué)上表現(xiàn)出與鳥(niǎo)類(lèi)和哺乳動(dòng)物慢波睡眠和異相睡眠相似的2個(gè)睡眠階段[19]，研究者通過(guò)構(gòu)建蜥蜴鬣蜥睡眠剝奪模型，進(jìn)一步打開(kāi)研究睡眠機(jī)制的大門(mén)。

1.2 睡眠剝奪動(dòng)物模型的建立 保持長(zhǎng)時(shí)間覺(jué)醒的不同方法常用于研究睡眠剝奪可能產(chǎn)生的神經(jīng)生理影響。目前界定睡眠的行為標(biāo)準(zhǔn)為：1）自發(fā)且具有特定姿勢(shì);2）保持行為的不動(dòng)性;3）行為反應(yīng)閾值升高，反映在喚醒刺激的強(qiáng)度和/或行為反應(yīng)的頻率、潛伏期或持續(xù)時(shí)間;4）外界刺激下行為快速可逆[20]。目前常用于研究神經(jīng)生理的動(dòng)物睡眠剝奪模型。見(jiàn)表1。

1.2.1 睡眠剝奪法 睡眠剝奪法根據(jù)剝奪時(shí)相分為異相睡眠剝奪法和全睡眠剝奪法。

1.2.1.1 異相睡眠剝奪法（Paradoxical Sleep Deprivation，PSD） 又稱(chēng)快速動(dòng)眼相睡眠剝奪法。是選擇性睡眠剝奪常用的方式。齲齒類(lèi)模型生物均利用了大鼠畏水的特點(diǎn)，主要包括水平臺(tái)環(huán)境剝奪法，水上網(wǎng)格法等。經(jīng)典水平臺(tái)法由Cohen等[21]于1966年首次建立用于大鼠的睡眠剝奪實(shí)驗(yàn)。此后演變出多平臺(tái)及改良多平臺(tái)的大鼠睡眠剝奪模型。直徑6 cm的平臺(tái)可用于大鼠最大程度的異相睡眠剝奪，小鼠多使用2.4 cm小平臺(tái)。改良多平臺(tái)則將對(duì)照組由小平臺(tái)改大平臺(tái)，或者平臺(tái)下放置尼龍網(wǎng)防止大鼠跌落入水。水上網(wǎng)格法增加了大鼠活動(dòng)范圍，消除了固定和隔離的干擾，大鼠可以自由活動(dòng)。平臺(tái)模型主要用于REM選擇性睡眠剝奪，但均對(duì)慢波睡眠造成干擾，一定程度上影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定性，網(wǎng)格法則對(duì)環(huán)境應(yīng)激有所消除。見(jiàn)表2。

1.2.1.2 完全睡眠剝奪法（Total Sleep Deprivation，TSD） 輕柔刺激法和強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng)法常用于大鼠、小鼠完全睡眠剝奪，近年用于研究氧化應(yīng)激通路的運(yùn)動(dòng)模型常使用水平轉(zhuǎn)臺(tái)剝奪法，由Rechtschaffen等[22]于1983年首次應(yīng)用。見(jiàn)表3。雖然果蠅不能表現(xiàn)出類(lèi)似于哺乳動(dòng)物睡眠時(shí)腦電圖相關(guān)波形變化，但將果蠅置于旋轉(zhuǎn)裝置中，可以記錄到20～30 Hz的局部場(chǎng)電位，睡眠狀態(tài)下果蠅可表現(xiàn)出相應(yīng)的電位變化[23]。

1.2.2 化學(xué)試劑刺激法 通過(guò)向大鼠體內(nèi)注射特定化學(xué)試劑，使其體內(nèi)發(fā)生相應(yīng)變化，達(dá)到剝奪睡眠的目的。Lu等向大鼠下丘腦腹外側(cè)視前區(qū)（Ventrolateral Preoptic Area，VLPO）注射鵝膏蕈氨酸，探究VLPO缺失對(duì)大鼠NREM及REM睡眠的影響[24];韋啟志等[25]通過(guò)向大鼠腹腔注射氯苯丙氨酸，以探究化痰安神方治療失眠癥的藥效學(xué)基礎(chǔ)及其對(duì)失眠大鼠下丘腦食欲素表達(dá)影響。該方法在操作性和準(zhǔn)確性上差異較大，重復(fù)性有待提高，從不同方面影響結(jié)果的可靠性。

1.2.3 生物鐘基因修飾動(dòng)物模型 基因修飾動(dòng)物模型是現(xiàn)代生命科學(xué)研究的重要工具。per家族基因是生物鐘調(diào)節(jié)的核心基因，1971年首次在果蠅中發(fā)現(xiàn)。該基因具有調(diào)節(jié)生物節(jié)律的作用，哺乳動(dòng)物per家族基因包括per1、per2和per3。利用基因敲除小鼠生物鐘模型發(fā)現(xiàn)，per1、per2、cry1和cry2這4個(gè)基因存在任意一個(gè)基因即可以維持晝夜節(jié)律。而在per1和per2雙敲除小鼠模型中，僅per 3蛋白存在不足以維持晝夜節(jié)律[26]。利用基因修飾技術(shù)，Ins l果蠅連續(xù)繁衍60代后，可以穩(wěn)定地表達(dá)出失眠性狀。全基因組分析顯示，果蠅差異表達(dá)基因主要參與代謝，神經(jīng)元活動(dòng)和感官知覺(jué)[27]。Ins-l果蠅模型在揭示睡眠機(jī)制及生物鐘基因方面具有重要的意義。

1.2.4 中醫(yī)睡眠剝奪模型的應(yīng)用 睡眠剝奪模型常用于中醫(yī)辨證治療失眠癥的研究中。例如肝郁化火證失眠大鼠模型、心腎不交失眠大鼠模型、陰虛血少證等大鼠失眠模型等。肝郁化火證是失眠的常見(jiàn)證型之一，研究常用慢性束縛法構(gòu)建肝郁證大鼠模型。2018年何林熹等[28]人探索采用慢性束縛法（限制性制動(dòng)）復(fù)合慢性疼痛刺激法（夾尾刺激）建立失眠的肝郁化火證大鼠模型，分析研究動(dòng)物宏觀表征和微觀生物學(xué)指標(biāo)。

2 小結(jié)

建立新型且模擬度更高的睡眠剝奪模型是決定實(shí)驗(yàn)?zāi)芊癯晒Φ那疤?。本文主要展示了近年?lái)睡眠剝奪研究動(dòng)物模型的應(yīng)用和構(gòu)建的證據(jù)。目前中醫(yī)對(duì)于失眠癥的診治，在模型的構(gòu)建上缺乏客觀統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，常使用的睡眠剝奪模型與失眠癥尚不能辨證統(tǒng)一，中藥藥效機(jī)制不明，同時(shí)缺乏有力的基礎(chǔ)研究及大規(guī)模的隨機(jī)雙盲對(duì)照試驗(yàn)[29]。目前尚無(wú)可以完全選擇性消除的睡眠剝奪模型，慢波睡眠功能尚不明確，干擾因素在所難免。設(shè)計(jì)新的藥物或機(jī)械方法選擇性地消除SWS可能是未來(lái)研究發(fā)展的方向。基于簡(jiǎn)單生物模型研究生物鐘基因在晝夜節(jié)律和睡眠平衡2個(gè)過(guò)程中的作用及分子調(diào)節(jié)機(jī)制，將是未來(lái)研究的熱點(diǎn)內(nèi)容。

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