魏桂林 何青青 金強(qiáng) 楊凌

摘要 線粒體是細(xì)胞的能量工廠，同時(shí)線粒體還參與細(xì)胞分化、維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境平衡、細(xì)胞信息傳遞和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等過程。線粒體受到核DNA和線粒體DNA的雙重調(diào)控，使得線粒體對(duì)于各種外源及內(nèi)源性毒性物質(zhì)更加敏感。藥物破壞線粒體結(jié)構(gòu)與功能可導(dǎo)致細(xì)胞壞死或凋亡。近年來研究發(fā)現(xiàn)多種臟器細(xì)胞線粒體是藥物毒性作用的主要靶標(biāo)之一，藥物可通過多種途徑致線粒體毒性，線粒體損傷是許多藥物器官毒性反應(yīng)早期的重要特征。本文主要綜述常見的誘導(dǎo)不同器官線粒體毒性的臨床藥物并簡(jiǎn)要探討藥物介導(dǎo)線粒體毒性的機(jī)制。此外，我們還將重點(diǎn)討論目前常用的線粒體毒性評(píng)價(jià)模型和評(píng)價(jià)技術(shù)，以期為預(yù)防和診斷藥源性器官損傷提供思路。

關(guān)鍵詞 線粒體;線粒體毒性;器官毒性;臨床藥物;中藥;評(píng)價(jià)模型;評(píng)價(jià)技術(shù);高通量

Research Progress on Evaluation Model of Drug-induced Organ Damage Mediated by Mitochondrial Damage

WEI Guilin，HE Qingqing，JIN Qiang，YANG Ling

（Institute of Interdisciplinary Integrative Medicine Research，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China）

Abstract Mitochondria are the energy factories of cells.Meanwhile，mitochondria are also involved in processes such as cell differentiation，maintenance of the intracellular homeostasis，cell information transmission and regulation of cell apoptosis etc.Mitochondria are dually regulated by nuclear DNA and mitochondrial DNA，making mitochondria more sensitive to various exogenous and endogenous toxic substances.The destruction of mitochondrial structure and function by drugs can lead to cell necrosis or apoptosis.In recent years，studies have found that the mitochondria of various organ cells are one of the main targets of drug toxicity.Drugs can cause mitochondrial toxicity through a variety of ways.Mitochondrial damage is an important feature of many drug organ toxicity in the early stage.This paper mainly reviews common clinical drugs that induce mitochondrial toxicity in different organs and briefly discusses the mechanism of drug-mediated mitochondrial toxicity.In addition，we will also focus on the current commonly used mitochondrial toxicity evaluation models and evaluation techniques in order to provide ideas for the prevention and diagnosis of drug-mediated organ damage.

Keywords Mitochondria; Mitochondrial toxicity; Organ toxicity; Clinical drugs; Chinese medicines; Evaluation model; Evaluation technology; High throughput

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.23.001

線粒體是由雙層膜包裹的細(xì)胞器，是細(xì)胞的主要能量來源，線粒體以ATP的形式儲(chǔ)存能量，并以ATP水解釋放能量以供生命活動(dòng)之需，如用于肌肉收縮和細(xì)胞分裂，蛋白質(zhì)生物合成、折疊和降解以及膜電位的產(chǎn)生和維持等[1-2]。除了細(xì)胞呼吸和產(chǎn)生能量外，線粒體還參與其他代謝過程，包括糖類、脂肪以及蛋白質(zhì)三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的最終氧化，氨基酸、血紅素的生物合成，鈣信號(hào)傳導(dǎo)、應(yīng)激反應(yīng)以及一般的細(xì)胞信號(hào)中樞。此外，線粒體還參與細(xì)胞凋亡、壞死與衰老等過程。因此，線粒體在人類身體健康中發(fā)揮著重要作用。

線粒體功能紊亂通常會(huì)誘發(fā)細(xì)胞損傷乃至死亡，故而線粒體也是許多疾病治療的靶點(diǎn)[3]。開發(fā)靶向干擾線粒體功能的藥物一直也是很多醫(yī)藥公司設(shè)計(jì)和開發(fā)針對(duì)治療目的的主要策略[4]。但是，對(duì)于大多數(shù)制藥公司而言，藥物的安全性愈發(fā)變的不可忽視。越來越多的實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明，線粒體是許多藥物毒性產(chǎn)生的靶點(diǎn)，嚴(yán)重不良反應(yīng)可能是藥物或代謝中間體直接或間接破壞線粒體結(jié)構(gòu)與功能造成的[5-6]。擾亂線粒體的藥物通常是通過抑制電子傳遞鏈的呼吸復(fù)合物，抑制或解偶聯(lián)氧化磷酸化，誘導(dǎo)線粒體氧化應(yīng)激，降低線粒體膜電位，擾亂細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)，或抑制DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄或翻譯等過程產(chǎn)生的[7]。線粒體毒性是上市藥物撤藥以及器官毒性的一個(gè)重要原因，F(xiàn)DA等機(jī)構(gòu)也明確要求線粒體毒性作用應(yīng)納入藥物的安全評(píng)價(jià)中[8]。因此，在藥物發(fā)現(xiàn)的早期階段檢測(cè)藥物誘導(dǎo)的線粒體功能障礙是至關(guān)重要的，構(gòu)建高效地線粒體毒性評(píng)價(jià)模型來減少候選藥物的后期消耗，降低藥物不良反應(yīng)，并設(shè)計(jì)出更安全的藥物對(duì)于整體醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)、人類健康意義重大。

本綜述主要圍繞藥物誘導(dǎo)器官、組織細(xì)胞的線粒體毒性，并舉例說明了藥物誘導(dǎo)的線粒體毒性的多種機(jī)制;概述了藥物誘導(dǎo)的線粒體功能改變的傳統(tǒng)和新穎評(píng)價(jià)模型和評(píng)價(jià)技術(shù)，以期為預(yù)防、診斷、干預(yù)或改善外源性藥物引起的臟器損傷和相關(guān)疾病提供思路。

1 線粒體結(jié)構(gòu)與功能

線粒體由雙層膜結(jié)構(gòu)將線粒體分為外膜、膜間隙、內(nèi)膜和線粒體基質(zhì)四大部分。外膜平整光滑，相當(dāng)于細(xì)胞膜，外膜主要參與調(diào)控線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器以及細(xì)胞質(zhì)之間的物質(zhì)交換。外膜和內(nèi)膜之間的區(qū)域是膜間隙，由于外膜上分布有孔蛋白構(gòu)成的通道，通透性很高，所以膜間隙中的離子環(huán)境與胞質(zhì)的幾乎相同。內(nèi)膜包裹著線粒體基質(zhì)，蛋白含量高，部分內(nèi)膜向內(nèi)折疊形成嵴，在不同種類的細(xì)胞中，線粒體嵴的數(shù)目、形態(tài)和排列方式有較大差別，嵴的形成增加了線粒體內(nèi)膜的表面積，因此，內(nèi)膜通透性低并且在內(nèi)膜上進(jìn)行著更多的生化反應(yīng)。線粒體基質(zhì)含有參與三羧酸循環(huán)、脂肪酸氧化、氨基酸降解等生化反應(yīng)的酶等眾多蛋白質(zhì)，所以較細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)黏稠，線粒體基質(zhì)中一般還含有線粒體DNA，RNA和核糖體。

線粒體是細(xì)胞的動(dòng)力工廠，是真核生物進(jìn)行氧化代謝的部位，是糖類、脂肪和氨基酸最終氧化釋放能量的場(chǎng)所，細(xì)胞中95%以上的能量來源于線粒體[9]。同時(shí)，線粒體還參與調(diào)解鈣離子穩(wěn)態(tài)，活性氧的產(chǎn)生以及細(xì)胞內(nèi)信息傳導(dǎo)平臺(tái)，調(diào)控細(xì)胞死亡，如凋亡、壞死以及自噬等。

2 線粒體損傷模式及機(jī)制

線粒體損傷包括結(jié)構(gòu)和功能上損傷。很多藥物可以破壞線粒體膜完整性，導(dǎo)致線粒體裂解，從而喪失功能[10-11]。另一方面，絕大部分線粒體毒性藥物都是通過破壞線粒體功能從而誘發(fā)線粒體能量障礙，最后引起細(xì)胞的凋亡或壞死。藥物引起線粒體功能的方式主要包括4個(gè)方面：1）產(chǎn)生過量ROS;2）鈣離子紊亂和線粒體通透性轉(zhuǎn)變;3）阻斷線粒體呼吸鏈;4）損傷線粒體DNA[12-14]。見圖1。

線粒體電子呼吸鏈泄露的電子攻擊O2是線粒體產(chǎn)生ROS的主要原因，這些ROS會(huì)攻擊磷脂，蛋白質(zhì)和線粒體DNA從而損傷線粒體功能[15]。正常情況下，線粒體超氧化物歧化酶將超氧化物分解為過氧化氫，然后通過谷胱甘肽過氧化物酶將其轉(zhuǎn)化為水。此外，胞質(zhì)超氧化物歧化酶和過氧化氫酶可提供細(xì)胞具有針對(duì)ROS的其他抗氧化劑防御機(jī)制。但是，很多外源性藥物或代謝生成的活性中間體可直接產(chǎn)生大量的ROS，引起氧化應(yīng)激[16]，線粒體作為產(chǎn)生ROS的主要細(xì)胞器，因此也成為主要被攻擊

研究表明，藥物或其反應(yīng)性代謝產(chǎn)物可通過改變線粒體的結(jié)構(gòu)或功能來誘導(dǎo)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（Mitochondrial Permeability Transition，mPTP）。目前認(rèn)為主要有2種機(jī)制，一種機(jī)制涉及促凋亡分子BAX/BAK在線粒體外膜上形成孔[19]。由藥物或其他有毒化學(xué)物誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)激與BH3蛋白的激活有關(guān)。這些蛋白質(zhì)通過激活BAX/BAK促進(jìn)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞死亡，進(jìn)而誘導(dǎo)線粒體外膜上的孔形成。通過這些孔釋放的線粒體促凋亡蛋白CytC，EndoG和AIF啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。第二種機(jī)制是由于鈣穩(wěn)態(tài)的改變或mtROS產(chǎn)生的增加而引起的mPTP誘導(dǎo)，從而導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜破裂[20]。線粒體是鈣離子儲(chǔ)存的主要場(chǎng)所之一，在線粒體內(nèi)，鈣離子會(huì)增加三羧酸循環(huán)和ATP產(chǎn)生至關(guān)重要的幾種酶的活性，激活了線粒體的代謝，增加了有氧條件下許多能量消耗過程中ATP的供應(yīng)。線粒體對(duì)鈣離子的攝取和外排共同維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子的穩(wěn)態(tài)，并與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞膜共同參與調(diào)節(jié)胞質(zhì)內(nèi)游離鈣離子濃度，維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子的穩(wěn)態(tài)。很多藥物或代謝物會(huì)直接或間接破壞鈣離子平衡，導(dǎo)致大量線粒體鈣離子外流進(jìn)入胞質(zhì)中，鈣離子濃度的劇降抑制ATP合成，最終引起氧化磷酸化過程障礙。

化合物在線粒體中氧化產(chǎn)生的NADH和FADH2通過電子傳遞鏈（Electron Transfer Chain，ETC）將質(zhì)子和電子傳給O2生成水分子，電子傳遞鏈的抑制在某種程度上意味著細(xì)胞能量代謝障礙，甚至細(xì)胞生命的終結(jié)。許多藥物或其親電子代謝物可以抑制線粒體電子傳輸鏈并導(dǎo)致活性氧（ROS）形成，從而觸發(fā)MMP和細(xì)胞色素c的釋放[21]。另一方面，在完整的線粒體內(nèi)，電子傳遞與磷酸化是緊密偶聯(lián)在一起的，很多藥物可通過氫穿梭穿過膜或通過通道形成或僅通過破壞脂質(zhì)雙層來充當(dāng)解偶聯(lián)劑，導(dǎo)致電子傳遞與ATP的形成這2個(gè)過程分開，則只進(jìn)行電子傳遞而不能生成ATP[22]。

線粒體DNA是獨(dú)立于細(xì)胞核染色體外的基因組，能夠單獨(dú)進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及合成蛋白質(zhì)。但是由于mtDNA是裸露的，缺乏保護(hù)，且處于線粒體呼吸鏈產(chǎn)生的高活性氧環(huán)境中，因此，mtDNA極易受氧自由基的侵害[16]。并且氧化損傷引起的線粒體DNA突變或其基因產(chǎn)物丟失又會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)活性氧的釋放，進(jìn)而又加重線粒體DNA的損傷[23]。

3 藥源性線粒體毒性

線粒體由于其膜腔呈弱堿性（pH≈8），且處于負(fù)膜電位狀態(tài)，使得很多帶正離子藥物很容易由于電勢(shì)差而進(jìn)入線粒體內(nèi)部，大量富集造成線粒體功能障礙。不同類別藥物由于其各自獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征，使其對(duì)線粒體毒性機(jī)制存在差異。以下列舉了引起線粒體不同毒性機(jī)制的藥物。見表1。

3.1 非甾體抗炎藥 非甾體抗炎藥（NSAIDs）是一類不含有甾體結(jié)構(gòu)特征的藥物，這類藥物通常需要弱酸性基團(tuán)（羧酸）結(jié)合到COX2酶的花生四烯酸鹽結(jié)合位點(diǎn)上，抑制COX2活性來發(fā)揮藥效，具有抗炎、抗風(fēng)濕、止痛、退熱和抗凝血等作用。越來越多證據(jù)表明該酸基團(tuán)的脂溶性與細(xì)胞線粒體內(nèi)膜磷脂相互作用，起質(zhì)子體的作用，損傷線粒體功能。吲哚美辛，雙氯芬酸和其他NSAIDs，包括選擇性COX-2抑制劑，在離體大鼠心臟制劑中顯示出可解除呼吸耦合并減少ATP產(chǎn)生[22]。另外，在大鼠心肌細(xì)胞和鼠新生心肌細(xì)胞中，NSAIDs可能通過抑制線粒體電子運(yùn)輸鏈來增加ROS的產(chǎn)生。Masubuchi等人發(fā)現(xiàn)大多數(shù)NSAID的結(jié)構(gòu)成分二苯胺可解偶聯(lián)氧化磷酸化，降低肝臟ATP含量，導(dǎo)致線粒體腫脹，從而誘發(fā)大鼠肝制備中的肝細(xì)胞損傷[24]。NSAIDs解耦效果的順序?yàn)榉夷撬?雙氟尼醛>甲苯磺酸>甲芬那酸酸>雙氯芬酸>吲哚美辛>萘普生，非諾洛芬>水楊酸[25]。而不含二苯胺結(jié)構(gòu)的對(duì)乙酰氨基酚和阿司匹林也具有明顯的肝細(xì)胞線粒體毒性，則是因?yàn)閷?duì)乙酰氨基酚可以被代謝激活，其代謝物與線粒體蛋白結(jié)合并誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)變[26]。同樣，阿司匹林的主要代謝產(chǎn)物水楊酸酯可提高對(duì)開放mPTP的敏感性。尼美舒利可通過解耦線粒體呼吸并誘導(dǎo)離體大鼠肝細(xì)胞和培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞中的mPTP來破壞線粒體ATP的產(chǎn)生，表明該藥物對(duì)線粒體具有直接毒性，而不需要代謝激活[27]。

3.2 抗菌藥 抗菌藥根據(jù)結(jié)構(gòu)可分為喹諾酮類藥物、β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類和氨基糖苷類。喹諾酮類，氨基糖苷類和β-內(nèi)酰胺類被證明可通過抑制線粒體ETC導(dǎo)致線粒體功能受損，從而導(dǎo)致哺乳動(dòng)物細(xì)胞中ROS的生成增加，進(jìn)而導(dǎo)致氧化性組織損傷[28]。體外研究表明氨基糖苷類可以靶向線粒體核糖體，干擾蛋白質(zhì)合成，β-內(nèi)酰胺類抑制線粒體肉堿/?；鈮A轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白而抑制脂肪酸β氧化，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致腎毒性[29]。相較而言，四環(huán)素和大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥似乎對(duì)線粒體功能沒有不利影響。由于細(xì)菌和線粒體核糖體的相似性，用于嚴(yán)重耐藥革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌感染的利奈唑胺，可抑制線粒體蛋白質(zhì)的合成，特別是抑制呼吸鏈復(fù)合體IV[30]。

3.3 抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物 抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物主要通過抑制線粒體DNA合成和氧化損傷DNA。盡管抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物結(jié)構(gòu)差異導(dǎo)致不同程度線粒體功能異常，總體上這類藥物通過抑制線粒體DNApoly導(dǎo)致mtDNA缺失，從而損害線粒體呼吸功能，引起細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積和高乳酸血癥[31]。齊多夫定（AZT）或司他夫定（d4T）作為胸腺嘧啶類似物;去羥肌苷（腺苷類似物）;扎西他濱或拉米夫定為胞嘧啶類似物;阿巴卡韋和阿巴卡韋（鳥嘌呤類似物）是核苷和核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，用于預(yù)防AIDS患者中HIV病毒的復(fù)制。然而，由于這些藥物也抑制線粒體DNA聚合酶γ，因此在患病患者中線粒體DNA復(fù)制也受到部分影響。這些藥物線粒體毒性大小依次為：扎西他濱>地達(dá)松>司他夫定>拉米夫定>齊多夫定>阿巴卡韋[31]。

3.4 抗癌藥 抗癌藥物依據(jù)作用機(jī)制不同一般分為抑制DNA合成、直接破壞DNA結(jié)構(gòu)或與DNA結(jié)合、抑制蛋白質(zhì)的合成、抑制有絲分裂等四大類。研究顯示醌類抗腫瘤藥物如絲裂霉素C、阿霉素等具有顯著線粒體毒性。絲裂霉素C的對(duì)苯二酚結(jié)構(gòu)可作為親電試劑與基因組DNA以及單和二烷基化DNA形成交聯(lián)，從而防止腫瘤細(xì)胞增殖。但是，在這些有氧條件下，絲裂霉素C引起線粒體功能障礙，因?yàn)榫€粒體還原酶代謝產(chǎn)生的絲裂霉素半醌自由基中間體可與氧反應(yīng)形成氧化還原循環(huán)，從而形成可氧化生物分子的ROS?？鼓[瘤藥物阿霉素介導(dǎo)的線粒體功能障礙似乎是由線粒體外膜NADH：b5還原酶和內(nèi)膜復(fù)合物I還原而形成的半醌自由基間接引起的，它通過使電子從呼吸鏈轉(zhuǎn)移而損害了氧化磷酸化。隨后，半醌中間體與氧氣反應(yīng)形成超氧化物，變成過氧化氫[32]。順鉑是另一種用于實(shí)體瘤的抗癌藥物，順鉑誘導(dǎo)線粒體毒性涉及ROS的形成，ATP降低，抗氧化劑防御和線粒體呼吸[33]。

3.5 麻醉藥 體外研究表明，全身麻醉藥主要通過抑制電子傳遞鏈來降低線粒體功能。在短期全身麻醉藥（揮發(fā)性麻醉劑，異丙酚，神經(jīng)肌肉阻滯劑，苯二氮艸卓類藥物和阿片類藥物）抑制線粒體呼吸而不影響線粒體復(fù)合物的酶活性或氧化磷酸化偶聯(lián)[34]。麻醉藥異丙酚線粒體毒性可能包括抑制呼吸鏈上電子傳遞，破壞脂肪酸氧化，及抑制細(xì)胞色素C氧化酶活性[35]。在一項(xiàng)研究中，異丙酚通過消耗完仔豬大腦中的糖原和線粒體ATP來改變線粒體的代謝。氯胺酮的超臨床濃度可通過線粒體途徑誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，涉及線粒體膜電位降低，ROS水平升高，線粒體裂變?cè)黾雍虲aspase-3活性[36]。而氯胺酮增加ROS，降低線粒體ATP的內(nèi)在機(jī)制主要是由于其可抑制線粒體電子傳遞鏈[37]。局部麻醉藥布比卡因和依替卡因的嚴(yán)重心臟毒性和肌毒性限制了它們的用途，并歸因于其線粒體的解偶聯(lián)能力。作為高度親脂性的兩親性胺，它們可以通過質(zhì)子傳遞機(jī)制，通過質(zhì)子穿過線粒體膜并刺激分離的線粒體呼吸[38]。布比卡因還比羅哌卡因更有效地使心臟細(xì)胞線粒體解偶聯(lián)，特別是在復(fù)合物I處，而利多卡因在解偶聯(lián)上的活性低得多[39]。布比卡因誘導(dǎo)的肌毒性和肌病的機(jī)制被認(rèn)為是由于線粒體毒性導(dǎo)致ATP耗竭，Ca2+超載和ROS形成，從而導(dǎo)致通透性轉(zhuǎn)變開孔[40]。

3.6 降血脂藥 他汀類藥物是抑制HMG-CoA還原酶抑制藥，是目前最有效的降脂藥物。長(zhǎng)期使用他汀藥物可導(dǎo)致肝毒性和肌毒性，研究顯示這些不良反應(yīng)與線粒體功能紊亂有關(guān)。西伐他汀，洛伐他汀，辛伐他汀可以顯著降低線粒體膜電位，改變線粒體膜轉(zhuǎn)換孔，降低線粒體氧化磷酸化從而破壞肝細(xì)胞線粒體功能[41]。而他汀類藥物骨骼肌線粒體毒性則主要與消耗線粒體mtDNA關(guān)聯(lián)[42]。另一類降脂藥如非諾貝特、氯貝丁酯也有一定的線粒體毒性，它們則主要通過抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物I活性而導(dǎo)致線粒體功能障礙[43]。

3.7 抗糖尿病藥 雙胍類藥物（二甲雙胍、苯乙雙胍、丁福明）的抗糖尿病作用以及誘導(dǎo)的乳酸性酸中毒都可能歸因于線粒體呼吸復(fù)合物I的抑制[44]。復(fù)合體I的抑制機(jī)制尚不清楚，但可能涉及雙胍分子的烴部分與膜磷脂的烴鏈結(jié)合，質(zhì)子化胍基的正電荷與磷脂磷酸基相互作用。噻唑烷二酮類降糖藥包括曲格列酮，羅格列酮和吡格列酮，這些藥也通過抑制線粒體復(fù)合物I，從而降低糖異生作用，并可能具有抗糖尿病作用[45]。它們通過抑制復(fù)合物I活性，引起骨骼肌或大鼠肝勻漿中的乳酸釋放，從而導(dǎo)致毒性。曲格列酮可通過降低線粒體膜電位，減少ATP合成而誘導(dǎo)線粒體毒性。

3.8 抗癲癇藥 研究顯示許多抗癲癇藥具有不同程度的線粒體毒性。丙戊酸是一種廣譜抗癲癇藥，用量不適時(shí)也會(huì)引起線粒體毒性，其中肝毒性最明顯。丙戊酸可在肝臟中被代謝激活，活性產(chǎn)物可結(jié)合到還原的乙酰輔酶A上，從而被攝入線粒體基質(zhì)內(nèi)，抑制多種線粒體酶并降低線粒體脂肪酸氧化[46]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)丙戊酸可抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物II，誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化和膜電位降低，引起ROS產(chǎn)生增加，進(jìn)而引起線粒體功能異常[47]。其他抗癲癇藥如苯妥因納、卡馬西平，苯巴比妥也可誘發(fā)線粒體功能障礙，它們對(duì)線粒體毒性大小依次為苯妥因納>苯巴比妥>卡馬西平[48]。

3.9 抗精神病藥 抗精神病藥依據(jù)結(jié)構(gòu)主要包括吩噻嗪類（氯丙嗪）、硫雜蒽類（泰爾登）、丁酰苯胺（氟哌啶醇）及其他類藥物。研究表明，很多抗精神病藥會(huì)破壞線粒體功能，特別是對(duì)線粒體呼吸鏈復(fù)合物I活性有抑制作用。研究抗精神病藥（典型的抗精神病藥）對(duì)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用，證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)，其中線粒體呼吸鏈復(fù)合物I和III的活性被所有抗精神病藥抑制[48]。吩噻嗪類如氯丙嗪等衍生物可通過mPTP開放和細(xì)胞色素c釋放導(dǎo)致線粒體損傷，最后引起細(xì)胞凋亡[49]。氯氮平的線粒體毒性機(jī)制則主要包括破壞線粒體形態(tài)、降低線粒體膜電位及耗竭線粒體ATP[50]。

3.10 抗抑郁藥 大量的體外和體內(nèi)研究表明，常用的抗抑郁藥會(huì)抑制線粒體功能并增加氧化應(yīng)激。阿米替林誘導(dǎo)的線粒體毒性與線粒體蛋白表達(dá)降低，線粒體含量，ATP水平降低，ROS生成增加，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)變有關(guān)[51]。其他抗抑郁藥，例如氯米帕明，地昔帕明，天肽，氟西汀對(duì)線粒體有作用。研究顯示氟西汀和天肽可有效抑制線粒體呼吸，但氯米帕明，地昔帕明和去甲氟西汀則由于降低線粒體膜電位和抑制線粒體復(fù)合物活性而導(dǎo)致凋亡[52]。長(zhǎng)時(shí)間使用舍曲林導(dǎo)致ATP耗竭，mPTP誘導(dǎo)和抑制ETC而導(dǎo)致不可逆的線粒體損傷和細(xì)胞死亡[53]。奈法西酮由于抑制膜電位和線粒體呼吸道復(fù)合物I和IV活性，從而引起嚴(yán)重肝毒性[54]。

4 線粒體毒性與臟器損傷

每年都有相當(dāng)大比例的藥物由于出現(xiàn)臨床前期或中期未發(fā)現(xiàn)的不良反應(yīng)而被撤出市場(chǎng)。越來越多的證據(jù)表明，這些不良反應(yīng)很多是線粒體功能障礙引起的心臟、肝臟和腎臟毒性作用。下表列舉了主要經(jīng)由線粒體途徑的心肝腎毒性藥物[3，13，55-56]。見表2。

4.1 線粒體損傷致肝毒性 肝臟作為藥物代謝的重要臟器，也是藥物引發(fā)損傷的主要靶器官。一些抗病毒藥物、抗腫瘤藥物和抗生素等可顯著誘導(dǎo)肝臟線粒體損傷。很多肝毒性藥物主要通過改變線粒體結(jié)構(gòu)、酶的活性或減少線粒體DNA的合成，進(jìn)一步破壞脂肪酸β氧化和肝細(xì)胞的氧化能力，最終誘發(fā)肝損傷。線粒體在哺乳動(dòng)物的肝細(xì)胞中含量非常豐富，其參與肝細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)穩(wěn)態(tài)平衡的調(diào)控、離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、氧自由基生成、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞凋亡等一系列的細(xì)胞生理活動(dòng)。同時(shí)，線粒體也是最容易受損的一個(gè)細(xì)胞器，其可以顯示細(xì)胞受損的程度。越來越多的研究表明，線粒體損傷可能是藥源性肝損傷誘發(fā)因素和經(jīng)由途徑[13]。因此，認(rèn)識(shí)和深入研究線粒體損傷在藥源性肝損傷發(fā)生中的重要作用，可為藥源性肝損傷臨床早期診斷、預(yù)防及治療提供新思路。藥物誘導(dǎo)的線粒體損傷主要包括結(jié)構(gòu)改變和功能紊亂。線粒體結(jié)構(gòu)的改變主要表現(xiàn)為線粒體腫脹、體積顯著增大、內(nèi)外膜完整性破壞甚至出現(xiàn)膜溶解、線粒體脊斷裂及大量空泡化，線粒體結(jié)構(gòu)基本喪失。藥物經(jīng)由線粒體誘發(fā)肝損傷的機(jī)制主要有干擾線粒體呼吸鏈上的電子傳遞、氧化磷酸化的解偶聯(lián)、抑制線粒體脂肪酸β氧化、干擾線粒體Ca2+紊亂、促進(jìn)mPTP開放、破壞線粒體DNA等途徑。胺碘酮是常用抗心律失常藥物，研究顯示胺碘酮誘導(dǎo)肝細(xì)胞線粒體功能障礙而發(fā)生肝損傷的主要機(jī)制是其抑制呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ，阻斷呼吸鏈中電子的傳遞，最終降低ATP的生成[17]。中草藥雷公藤對(duì)細(xì)胞免疫和體液免疫均有抑制作用，其主要的有效成分和毒性成分為雷公藤甲素。雷公藤甲素引起肝損傷與直接損害肝線粒體的結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)，線粒體損傷可能是雷公藤甲素致肝損傷的機(jī)制之一[57]。研究表明雷公藤甲素肝毒性主要體現(xiàn)在肝細(xì)胞線粒體呼吸鏈的電子傳遞障礙，線粒體膜電位降低，顯著地抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅳ等。二苯胺類非甾體抗炎藥不僅可以降低線粒體膜電位，還可刺激基礎(chǔ)氧消耗并抑制ADP呼吸，使得線粒體氧化磷酸化解耦聯(lián)，ATP生成急劇減少，導(dǎo)致能量代謝障礙從而誘發(fā)肝損傷。丙戊酸是一種抗驚厥藥，越來越多研究表明丙戊酸可以消耗肉堿，減少輔酶A供應(yīng)和抑制β氧化的三大功能酶，從而阻礙線粒體β氧化，并且其代謝產(chǎn)物還能與脂質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)相關(guān)的酶，這些都是丙戊酸誘導(dǎo)肝毒性的主要原因[47]。一些抗結(jié)核藥如異煙肼和利福平的肝毒性則主要與線粒體氧化應(yīng)激和線粒體mPTP異常開放密切相關(guān)[58]。此外線粒體具有自己獨(dú)立的遺傳信息，能夠獨(dú)立進(jìn)行基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯及蛋白質(zhì)的表達(dá)。很多核苷類及單核苷酸類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑在臨床長(zhǎng)期治療時(shí)，會(huì)抑制線粒體DNA聚合酶，導(dǎo)致線粒體酶合成受阻、特別是氧化磷酸化中ETC關(guān)鍵蛋白的表達(dá)受到影響，導(dǎo)致嚴(yán)重的能量代謝障礙。并且這些藥物也還能與DNA聚合酶結(jié)合，終止DNA復(fù)制，從而減少mtDNA含量而損傷線粒體[59]。

4.2 線粒體損傷致腎毒性 腎臟由于其功能和解剖學(xué)特點(diǎn)，是藥物毒性的重要靶器官之一，藥物誘導(dǎo)的急性腎損傷是藥物研發(fā)過程中常見的問題。急性腎毒性以近端腎小管損傷為主要特征，表現(xiàn)為腎小管腫脹、腎小管上皮細(xì)胞壞死、管型形成、間質(zhì)炎性反應(yīng)及細(xì)胞凋亡等。腎小管，尤其是近端小管，對(duì)離子、葡萄糖及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重吸收均需要通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的主動(dòng)運(yùn)輸才能完成，需要維持線粒體正常功能以保證能量供應(yīng)[55]。腎臟是一個(gè)高能量需求的器官。由于腎臟的再吸收過程對(duì)能量（ATP）的持續(xù)和高度依賴，使得線粒體功能障礙成為可能參與藥物誘導(dǎo)的急性腎毒性的關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制。因此，藥物引起的線粒體損傷可以中斷化學(xué)物質(zhì)的再吸收過程，在急性腎毒性的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用。常見的具有引起急性腎毒性傾向的藥物有抗生素、化療藥物、免疫抑制藥物、抗病毒藥物、中藥、非甾體抗炎藥物、質(zhì)子泵抑制劑等。諸多研究均在AKI模型中觀察到腎小管上皮細(xì)胞線粒體嵴消失、線粒體碎片化及質(zhì)量下降、線粒體腫脹等表現(xiàn)。

近端腎小管對(duì)許多化學(xué)物質(zhì)的重吸收過程嚴(yán)重依賴于Na+/K+ATP酶產(chǎn)生的電化學(xué)梯度。Na+/K+ATP酶是一種存在于多種細(xì)胞質(zhì)膜中的酶。這種泵在不同的生理過程中起著至關(guān)重要的作用，如從胃腸道吸收化學(xué)物質(zhì)或通過神經(jīng)元傳遞脈沖。Na+/K+ATP酶將Na+泵出細(xì)胞，同時(shí)將K+泵入細(xì)胞，兩者都是逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)。Na+/K+ATP酶活性依賴于ATP。在腎臟中，Na+泵出提供的驅(qū)動(dòng)力用于將幾種化學(xué)物質(zhì)，如氨基酸、葡萄糖、磷酸鹽、蛋白質(zhì)、維生素和其他一些有機(jī)化合物導(dǎo)入近端小管細(xì)胞，進(jìn)而進(jìn)入血流。因此，細(xì)胞內(nèi)ATP含量的任何改變都會(huì)損害其功能。腎小管內(nèi)層細(xì)胞含有大量線粒體，為化學(xué)物質(zhì)的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)和再吸收提供足夠的能量。近端小管細(xì)胞具有較高的代謝率，可通過線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生大量ATP。近端小管細(xì)胞對(duì)ATP的高度依賴性使其成為外源性毒物誘導(dǎo)的線粒體損傷和能量危機(jī)的潛在靶細(xì)胞。對(duì)線粒體功能的干擾會(huì)破壞能量代謝和ATP的產(chǎn)生。因此，細(xì)胞ATP耗竭可導(dǎo)致Na+/K+ATP酶抑制和破壞化學(xué)物質(zhì)再吸收過程和血清電解質(zhì)的紊亂。

有毒物質(zhì)靶向蓄積于腎臟也是藥物誘導(dǎo)腎臟毒性的一個(gè)主要原因，這與腎小管細(xì)胞膜表面蛋白、有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)體、銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)體等密切相關(guān)。由于近端小管細(xì)胞線粒體豐富，因此藥物在近端小管的蓄積，勢(shì)必會(huì)損傷其內(nèi)含量豐富的線粒體，進(jìn)而觸發(fā)線粒體損傷。研究表明線粒體參與了藥物誘導(dǎo)的急性腎損傷的病理過程。線粒體動(dòng)力學(xué)失衡將導(dǎo)致線粒體碎片化，進(jìn)而可導(dǎo)致線粒體質(zhì)量下降[60]。線粒體碎片化是AKI發(fā)生時(shí)線粒體最早期變化，發(fā)生于腎損傷及細(xì)胞凋亡前。線粒體動(dòng)力學(xué)紊亂一方面參與腎小管上皮細(xì)胞損傷機(jī)制，由此參與多種因素導(dǎo)致的腎小管損傷。腎小管細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷是藥物誘導(dǎo)腎毒性的明顯病理學(xué)特征，其中，線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑對(duì)于藥物誘導(dǎo)的腎毒性的發(fā)生發(fā)展十分關(guān)鍵。同時(shí)由于腎臟近端小管的抗氧化防御系統(tǒng)相對(duì)薄弱，而線粒體又是機(jī)體活性氧生成的主要場(chǎng)所，因而腎臟對(duì)線粒體功能障礙更加敏感。另一方面，腎近端小管上皮細(xì)胞由于對(duì)這些藥物的高吸收和積累能力而經(jīng)常受到藥物的影響。這一事件將增加由于過度暴露于外源性藥物引起的腎臟組織損傷的風(fēng)險(xiǎn)。綜上所述，藥物在近端小管的蓄積是DAKI的物質(zhì)基礎(chǔ)，結(jié)合腎臟近端小管線粒體富集這一生理特點(diǎn)以及相關(guān)病理學(xué)特征，可認(rèn)為線粒體損傷是藥源性急性腎損傷的重要病理學(xué)機(jī)制。

總而言之，D-AKI過程中線粒體損傷主要表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)改變與功能障礙，具體涉及到氧化應(yīng)激損傷、線粒體動(dòng)力學(xué)過程紊亂、線粒體自噬水平不足、線粒體生物合成不足、線粒體呼吸鏈缺陷等多方面因素。多種因素彼此之間相互交叉、相互關(guān)聯(lián)，共同加劇了D-AKI的發(fā)生發(fā)展。

4.3 線粒體損傷致心毒性 藥物心臟毒性是因外源性藥物對(duì)心血管系統(tǒng)造成多種復(fù)雜的病理生理?yè)p害，臨床表現(xiàn)為心肌炎、心肌病、心律失常、心瓣膜損害、心肌缺血及與心肌梗死等一系列心臟功能和器質(zhì)性的改變。心臟結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有毒藥物可通過與各種受體、離子通道的相互作用，參與氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成細(xì)胞器損傷及影響細(xì)胞凋亡等多種途徑對(duì)其造成損傷。線粒體在心肌細(xì)胞中占了很大的比例，位于肌原纖維之間、內(nèi)質(zhì)膜下方。線粒體顯著的地位和數(shù)量保證了為心臟收縮、新陳代謝和離子動(dòng)態(tài)平衡提供集中高效的ATP運(yùn)輸系統(tǒng)[61]。線粒體在心肌細(xì)胞的存亡中起著關(guān)鍵的作用。多種證據(jù)表明，多種常用的抗癌藥，抗病毒化合物和抗糖尿病或非法濫用藥物，例如乙醇，可卡因，甲基苯丙胺，搖頭丸和合成大麻素涉及與線粒體相關(guān)的直接或間接毒性，主要包括干擾線粒體呼吸鏈（例如，解偶聯(lián)）或重要線粒體酶的抑制（氧化磷酸化，三羧酸循環(huán)，線粒體DNA復(fù)制，ADP/ATP易位），最終導(dǎo)致線粒體膜電位喪失，線粒體氧化/硝化應(yīng)激增加，和細(xì)胞死亡。需要更透徹的了解線粒體心血管毒性的常見機(jī)制，以開發(fā)靈敏且高通量的線粒體毒性篩選方法和體內(nèi)模型，以更好地預(yù)測(cè)新型化合物的不可預(yù)見的心臟毒性問題，并基于更具選擇性的靶向性設(shè)計(jì)新的心臟保護(hù)策略預(yù)防上述普通藥物嚴(yán)重心血管不良后果的特定線粒體過程。

5 線粒體毒性評(píng)價(jià)模型

近年來，越來越多的研究表明，線粒體是藥物毒性作用的重要靶標(biāo)，其功能異常通常會(huì)導(dǎo)致或加速細(xì)胞死亡，線粒體毒性評(píng)價(jià)已成為候選藥物安全性評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)[62]。因此評(píng)估線粒體的各項(xiàng)指標(biāo)對(duì)于內(nèi)源性或外源性物質(zhì)的安全性評(píng)價(jià)意義重大。

合適的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)于線粒體毒性的評(píng)估至關(guān)重要。盡管體內(nèi)嚙齒動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供了相當(dāng)多的毒性數(shù)據(jù)，但嚙齒動(dòng)物模型存在種屬差異大，通量低，毒性評(píng)價(jià)周期長(zhǎng)等問題。離體的線粒體或培養(yǎng)的細(xì)胞體外毒性實(shí)驗(yàn)被廣泛的用于線粒體毒性機(jī)制評(píng)價(jià)，不但可以進(jìn)行高通量的體外篩選，而且通常比嚙齒動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行的分析更有效。目前基于細(xì)胞的線粒體機(jī)制效應(yīng)或毒性模型是不夠的，因?yàn)榕囵B(yǎng)的細(xì)胞系存在高度糖酵解、有氧代謝最小化以及線粒體生理功能的改變等問題。因此，近年來，像斑馬魚、秀麗隱線蟲等可進(jìn)行高通量篩選的體內(nèi)動(dòng)物模型逐漸被廣泛應(yīng)用于體內(nèi)毒性評(píng)價(jià)[63]。

5.1 離體線粒體 離體線粒體通常被用于體外評(píng)估外源性藥物對(duì)線粒體功能的影響，以確定線粒體毒性在特定器官損傷中的作用。線粒體可以從不同臟器組織、培養(yǎng)的細(xì)胞中分離出來。所選組織被機(jī)械均質(zhì)化破壞形成組織勻漿，然后用差速離心法分離出線粒體[64];線粒體也可通過細(xì)胞裂解分離，然后進(jìn)行差速離心分離和純化[65]。使用離體的線粒體來測(cè)量有毒物質(zhì)對(duì)氧氣消耗的影響，可以避免細(xì)胞或整個(gè)生物體中存在任何非線粒體呼吸源，包括過氧化物酶體的呼吸[66]。離體線粒體中的氧化磷酸化作用不受代謝和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的影響，因此，檢測(cè)離體線粒體中的氧化磷酸化作用只能獲得完整細(xì)胞或動(dòng)物整體呼吸作用的一部分信息。但是，線粒體的分離會(huì)破壞線粒體結(jié)構(gòu)并可能改變線粒體功能。離體的線粒體類似于球形單位，具有相對(duì)均勻的大小和形狀，線粒體分離會(huì)破壞通常情況下線粒體不均勻的分支結(jié)構(gòu)，并產(chǎn)生相對(duì)均勻的球形細(xì)胞器[67]。在組織均質(zhì)化過程中，線粒體網(wǎng)狀膜結(jié)構(gòu)會(huì)被破裂，必須迅速重新組裝才能產(chǎn)生明顯的“完整”細(xì)胞器?？赡茉诰€粒體膜短暫破裂、又重新組裝的過程中，可溶性基質(zhì)酶從線粒體基質(zhì)中丟失，從而稀釋氧化磷酸化或活性氧解毒所需的基質(zhì)成分，破壞了線粒體內(nèi)膜及其呼吸鏈復(fù)合物的結(jié)構(gòu)完整性。因此，使用離體的線粒體檢測(cè)線粒體功能具有一點(diǎn)的缺陷性。

5.2 活細(xì)胞水平 目前，藥物毒性評(píng)價(jià)常用的體外細(xì)胞模型有正常細(xì)胞系、癌細(xì)胞系和原代細(xì)胞系等，主要采用2D培養(yǎng)的方式，但是2D培養(yǎng)難以維持細(xì)胞立體結(jié)構(gòu)形態(tài)和細(xì)胞間的聯(lián)系，導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)與體內(nèi)器官真實(shí)情況相差較大。3D培養(yǎng)跨越二維細(xì)胞培養(yǎng)和機(jī)體整體，模擬體內(nèi)環(huán)境，3D模型可增強(qiáng)細(xì)胞之間的黏附以及維持細(xì)胞骨架，增加細(xì)胞間交流[68]。細(xì)胞形態(tài)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通常比常規(guī)的2D細(xì)胞培養(yǎng)更具有生理學(xué)特性。在平面2D組織培養(yǎng)基質(zhì)上生長(zhǎng)的細(xì)胞在形態(tài)，細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用以及與在更接近生理環(huán)境的3D培養(yǎng)中生長(zhǎng)的細(xì)胞在功能檢測(cè)等方面可能存在很大的差異。但3D培養(yǎng)模型模仿體內(nèi)組織狀況的能力各不相同而且缺乏血管系統(tǒng)以及小分子信號(hào)傳導(dǎo)等，通常模仿靜態(tài)或者短期狀態(tài)很難代表體內(nèi)系統(tǒng)[69]。

原代細(xì)胞系是評(píng)估外源性藥物或內(nèi)源性物質(zhì)線粒體毒性的理想模型。然而，原代細(xì)胞培養(yǎng)費(fèi)時(shí)，價(jià)格昂貴，以及它們?cè)谂囵B(yǎng)中的短暫存活力，共同限制了原代細(xì)胞在藥物開發(fā)領(lǐng)域的效用。由于這些原因，腫瘤來源的、不朽的細(xì)胞系已成為用于藥物發(fā)現(xiàn)和檢測(cè)線粒體毒性的常用細(xì)胞模型。癌細(xì)胞具有永生化的分裂能力，而且生長(zhǎng)能力比較強(qiáng)。即使在氧氣充足的條件下，癌細(xì)胞也能通過糖酵解產(chǎn)生幾乎所有的ATP，然后進(jìn)行乳酸發(fā)酵[70]。因此，以葡萄糖為底物時(shí)癌細(xì)胞對(duì)線粒體毒物的敏感性較低。細(xì)胞有氧呼吸被高濃度的葡萄糖抑制，從早期的細(xì)胞培養(yǎng)開始，為了方便，細(xì)胞一直在含有25 mm葡萄糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，這比正常水平高出5倍。在這種情況下，細(xì)胞不會(huì)大量使用線粒體來產(chǎn)生ATP，因此當(dāng)評(píng)估候選藥物在這些細(xì)胞中的潛在毒性時(shí)，即使存在非常強(qiáng)的線粒體毒素，也不會(huì)檢測(cè)到細(xì)胞死亡。一種可能的辦法是更換底物，以半乳糖代替培養(yǎng)基中的葡萄糖。半乳糖很難被轉(zhuǎn)換為葡萄糖，無法通過糖酵解產(chǎn)生ATP，用于生長(zhǎng)的能量通過谷氨酰胺代謝獲得[70-71]。谷氨酰胺被線粒體谷氨酰胺酶分解為谷氨酸，然后通過谷氨酸脫氫酶轉(zhuǎn)化為酮戊二酸，并在三羧酸循環(huán)中進(jìn)一步處理，最后結(jié)合磷酸化產(chǎn)生ATP[72-73]。因此，在培養(yǎng)基中用半乳糖代替葡萄糖可迫使細(xì)胞依賴氧化磷酸化（OXPHOS）來產(chǎn)生必要的ATP，增加細(xì)胞對(duì)線粒體毒性物質(zhì)的敏感性[74-75]。

5.3 體內(nèi)評(píng)估體系 離體的線粒體，培養(yǎng)的細(xì)胞和整個(gè)生物體之間有許多重要的線粒體功能不同。這些差異包括細(xì)胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)移、細(xì)胞間基質(zhì)作用以及核受體等機(jī)體的調(diào)控作用，可能影響藥物對(duì)線粒體毒性的敏感性。體內(nèi)評(píng)估體系是在整個(gè)生物體的背景下檢測(cè)線粒體，使其在生理上更具相關(guān)性。體內(nèi)模型也是研究線粒體功能失調(diào)對(duì)早期發(fā)育影響的理想方法[76]。

斑馬魚和秀麗隱桿線蟲的體積小，可以像細(xì)胞一樣培養(yǎng)在多孔板中，繁殖力強(qiáng)且發(fā)育迅速，因此非常適合進(jìn)行體內(nèi)毒理學(xué)和藥物發(fā)現(xiàn)研究。斑馬魚和秀麗隱桿線蟲作為廉價(jià)的動(dòng)物模型，在獲得體內(nèi)關(guān)鍵數(shù)據(jù)的同時(shí)，可測(cè)量體內(nèi)多個(gè)功能指標(biāo)，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)高通量藥物的體內(nèi)檢測(cè)，不僅可以在體內(nèi)篩選化學(xué)藥物，而且也可以對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行深入分析。也可以進(jìn)行跨代研究，因?yàn)樗鼈兎敝沉?qiáng)而且胚胎是半透明的，可以可視化體內(nèi)的細(xì)胞和亞細(xì)胞現(xiàn)象，研究人員可以輕松地監(jiān)視器官的發(fā)育[77-78]。此外，秀麗隱桿線蟲和斑馬魚的基因可進(jìn)行處理，轉(zhuǎn)基因體和遺傳突變體也很容易獲得，因此增加了實(shí)驗(yàn)可行性。已被用作多個(gè)線粒體高通量檢測(cè)平臺(tái)的模型，包括使用熒光報(bào)告基因分析斑馬魚體內(nèi)神經(jīng)元線粒體，利用XFe24細(xì)胞能量分析儀測(cè)定斑馬魚幼蟲線粒體生物能，利用秀麗隱桿線蟲檢測(cè)環(huán)境污染物的線粒體毒性等[79-80]。

不同動(dòng)物、不同組織線粒體對(duì)毒性物質(zhì)的敏感性不同[81-83]。有文獻(xiàn)報(bào)道，在相同濃度的膽紅素暴露下，腦線粒體磷酸化幾乎完全解耦聯(lián)，而肝臟線粒體僅不到50%解耦聯(lián)。線粒體產(chǎn)能的閾值會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)或缺乏運(yùn)動(dòng)而減少，這表明，與年輕活躍的嚙齒動(dòng)物比較，久坐不動(dòng)的年老嚙齒動(dòng)物可能更適合研究藥物誘發(fā)的線粒體功能障礙[84-85]。因此，動(dòng)物模型的選擇應(yīng)考慮線粒體的易感性。

6 線粒體毒性評(píng)價(jià)技術(shù)

線粒體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，功能多樣，不僅是細(xì)胞的供能場(chǎng)所，還參與細(xì)胞死亡、腫瘤形成、細(xì)胞分化等重要過程。線粒體也是最容易受損的一個(gè)細(xì)胞器，其可以顯示細(xì)胞受損的程度。開發(fā)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)線粒體結(jié)構(gòu)和功能指標(biāo)變化的分析方法對(duì)于預(yù)防和診斷藥源性線粒體損傷相關(guān)疾病具有重要的意義。

6.1 熒光成像技術(shù) 線粒體內(nèi)含有各種生物活性物質(zhì)，如活性氧、活性硫、活性氮、各種生物活性離子等，它們?cè)谌梭w各種生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用，其含量水平的異常都可直接影響線粒體功能并導(dǎo)致臟器功能降低，嚴(yán)重時(shí)甚至危及生命。因此，精確檢測(cè)線粒體內(nèi)活性成分含量變化對(duì)于從分子水平上研究藥物毒性與臟器功能之間的關(guān)系具有非常重要的生物醫(yī)學(xué)意義。熒光標(biāo)記技術(shù)作為一種可視化、實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)的演示技術(shù)，熒光探針在活細(xì)胞中具有高靈敏度、高空間分辨率和實(shí)時(shí)成像等優(yōu)點(diǎn)，在研究線粒體活動(dòng)過程中被廣泛地應(yīng)用，通過熒光成像技術(shù)研究藥物對(duì)線粒體功能影響已成為熒光探針領(lǐng)域的熱點(diǎn)。目前常用特異靶標(biāo)熒光探針結(jié)合共聚焦熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀進(jìn)行藥物線粒體毒性評(píng)價(jià)。線粒體成像熒光探針主要對(duì)線粒體成像和對(duì)線粒體內(nèi)各種活性物質(zhì)成像，通過熒光成像技術(shù)對(duì)線粒體結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究，如線粒體形態(tài)變化、線粒體內(nèi)環(huán)境（pH值、黏度、電位等）變化、線粒體內(nèi)源性活性氧物質(zhì)的檢測(cè)、ATP、谷胱甘肽等。近年來，人們對(duì)各種用于檢測(cè)線粒體功能的熒光探針進(jìn)行了廣泛的研究，靶向定位于線粒體，常見的線粒體功能評(píng)價(jià)探針有線粒體膜電位探針（JC10、羅丹明123，四甲基羅丹明甲酯）、Ca2+離子探針（Fluo-4）、ROS探針（DCFH-DA）、線粒體質(zhì)量探針（MitoTracker Green FM，MitoTracker Deep Red FM）、GSH探針（mBCl）[86]。

傳統(tǒng)的熒光成像技術(shù)雖然可以實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞層面監(jiān)測(cè)藥物對(duì)線粒體功能的動(dòng)態(tài)影響，但是存在檢測(cè)通量低，操作繁瑣等局限性。高內(nèi)涵分析（HCA）是一種基于細(xì)胞表型分析的高效新藥篩選技術(shù)，能夠在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整的前提下，同時(shí)檢測(cè)待測(cè)樣品對(duì)細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)、周期、遷移、調(diào)亡、代謝途徑及信號(hào)傳導(dǎo)等方面的影響，從單一實(shí)驗(yàn)中獲取大量有關(guān)信息，從而確定化合物的生物活性以及潛在毒性[87]。目前HCA能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)體外肝細(xì)胞與毒性機(jī)制相關(guān)的多個(gè)重耍標(biāo)志分子，包括細(xì)胞核的形態(tài)和數(shù)量、線粒體膜電位以及氧化應(yīng)激狀態(tài)、調(diào)亡與早期DNA損傷的變化等，是體外評(píng)價(jià)化合物潛在肝毒性、從機(jī)制上預(yù)測(cè)候選藥物安全性的高效手段[88]。該方法能夠彌補(bǔ)動(dòng)物試驗(yàn)靈敏度低、試驗(yàn)周期長(zhǎng)，不能量化的缺點(diǎn)，因此，高通量毒性評(píng)價(jià)技術(shù)己成為藥品質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)與安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的新的技術(shù)趨勢(shì)。多指標(biāo)同步量化對(duì)藥物的毒性進(jìn)行了較為全面的分析，并可對(duì)其毒性作用機(jī)制做出初步的判斷。

6.2 生化技術(shù) 線粒體是細(xì)胞的能量源，利用氧化磷酸化（OXPHOS）產(chǎn)生細(xì)胞約95%的ATP[9]。這一過程是由氧化磷酸化復(fù)合物（I，II，IV和V）完成的。因此，OXPHOS復(fù)合物的抑制會(huì)導(dǎo)致線粒體毒性。目前，已經(jīng)開發(fā)出基于細(xì)胞/組織的免疫捕獲或傳統(tǒng)的生化方法用于測(cè)定參與氧化磷酸化的蛋白復(fù)合物的活性[89]。線粒體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，包含13個(gè)多肽且都是參與氧化磷酸化的蛋白質(zhì)亞基，由mtDNA編碼并在線粒體核糖體上合成。位于線粒體內(nèi)的所有其他蛋白質(zhì)都是核DNA編碼，在胞質(zhì)核糖體上合成，然后輸入到線粒體中。干擾mtDNA或mtDNA編碼蛋白合成的藥物會(huì)損害氧化磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞ATP供應(yīng)減少。傳統(tǒng)上，采用免疫蛋白印跡法和測(cè)流試紙免疫測(cè)定法進(jìn)行這些化合物的檢測(cè)，然而，這2種方法都不適合高通量篩選[90-91]。

線粒體具有復(fù)雜的多腔結(jié)構(gòu)，是一種復(fù)雜的細(xì)胞器，存在于每一個(gè)普通細(xì)胞中。除了產(chǎn)生能量外，線粒體還是活性氧（ROS）的來源，并在許多過程的調(diào)控中發(fā)揮核心作用，如細(xì)胞凋亡或二級(jí)信使的存儲(chǔ)[92]。生物傳感器提供了一種創(chuàng)新的工具，用于測(cè)量生物體內(nèi)代謝產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)變化。此外，生物傳感器更具有底物特異性，并且由基因編碼，且不會(huì)引起不同細(xì)胞對(duì)探針攝取的異質(zhì)性問題[93]）。而且，通過選擇合適的啟動(dòng)子，可以在時(shí)間上或空間上限制傳感器的表達(dá)。同樣，空間表達(dá)可以在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行調(diào)節(jié)，通過將引導(dǎo)傳感器的前導(dǎo)肽連接到特定的細(xì)胞器或隔室，或者通過產(chǎn)生與定位蛋白質(zhì)融合的傳感器嵌合體。因此，有可能測(cè)量單細(xì)胞的單個(gè)細(xì)胞器中的代謝物，而不是群體。目前，多種生物傳感器已被廣泛應(yīng)用到線粒體中，用于檢測(cè)線粒體功能。

6.3 細(xì)胞能量代謝 線粒體最重要的功能是通過OXPHOS為細(xì)胞產(chǎn)生能量，因此，線粒體健康的主要標(biāo)志是呼吸作用[94]。傳統(tǒng)上，利用克拉克電極或?qū)⒕€粒體和整個(gè)細(xì)胞的耗氧量進(jìn)行體外檢測(cè)，但是缺乏高通量，利用pH和O2敏探針檢測(cè)胞外酸化率（糖酵解）及線粒體電子傳遞鏈的功能[95-96]。目前較新的方法（例如使用Seahorse細(xì)胞外通量分析儀的方法）可以測(cè)量多孔板（24和96孔）中的呼吸（耗氧量）[97]。這種儀器可測(cè)量高達(dá)10 dpf的完整活斑馬魚和幼蟲的耗氧量與細(xì)胞外酸化，以及從器官中仔細(xì)解剖的器官幼體和成年斑馬魚。

6.4 代謝組學(xué)分析技術(shù) 代謝組學(xué)（Metabonomics/Metabolomics）是效仿基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究思想，對(duì)生物體內(nèi)所有代謝物進(jìn)行定量分析，小如細(xì)胞，復(fù)雜如動(dòng)物或人，并尋找代謝物與生理病理變化的相對(duì)關(guān)系的研究方式，是系統(tǒng)生物學(xué)的組成部分[98-99]。目前，代謝組學(xué)在診斷線粒體毒性方面的應(yīng)用已在涉及抑制脂肪酸β氧化的案例中得到證實(shí)?；诖x組學(xué)的分析可以很容易地檢測(cè)線粒體毒性或遺傳病，而無需分離線粒體。近年來，定量磁共振成像代謝組學(xué)已被應(yīng)用于體外藥物誘導(dǎo)線粒體毒性的研究。這種方法被用于研究C2C12肌管的整體變化，這些肌管被氧化磷酸化復(fù)合物I抑制劑（魚藤酮）或氧化磷酸化復(fù)合物III抑制劑（抗霉素A）處理[100]。

6.5 電鏡 先進(jìn)的測(cè)試表征技術(shù)是認(rèn)識(shí)微觀世界的重要手段，對(duì)于尺度和維度觀的培養(yǎng)具有重要意義。不同于傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡，原子力顯微鏡是通過其探針原子與樣品的表面原子的作用力來實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品表面形貌觀測(cè)的。傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡是通過放大微觀結(jié)構(gòu)，然后直觀的看，但是分辨率有一定的局限性，導(dǎo)致無法觀測(cè)表面的細(xì)微結(jié)構(gòu)。而AFM是通過與樣品表面的“觸覺”響應(yīng)來重現(xiàn)事物的形貌。

冷凍電鏡技術(shù)是樣品在低溫條件下迅速冷凍后，通過低溫電鏡進(jìn)行觀察和處理數(shù)據(jù)。電子顯微鏡在線粒體中的應(yīng)用主要包括：1）觀察由線粒體調(diào)控的細(xì)胞凋亡，即觀察凋亡基因蛋白復(fù)合體動(dòng)態(tài)變化的結(jié)構(gòu)解析過程;2）觀察有機(jī)物在線粒體內(nèi)膜上的呼吸作用，同時(shí)有多種呼吸鏈蛋白復(fù)合體共同參與，冷凍電鏡技術(shù)可以高效對(duì)這類大分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)解析?？傊鋬鐾干潆娮语@微鏡主要用于高效率地觀察與線粒體活性相關(guān)的蛋白復(fù)合體的結(jié)構(gòu)解析[101]。

7 結(jié)論與展望

總之，線粒體作為細(xì)胞內(nèi)重要細(xì)胞器，藥物誘導(dǎo)線粒體功能異常通常與機(jī)體臟器損傷密切相關(guān)。高效監(jiān)控線粒體功能與結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化對(duì)于藥物安全性評(píng)價(jià)及相應(yīng)機(jī)體損傷機(jī)制研究意義重大。中藥材成分極其復(fù)雜，毒性機(jī)制涉及多因素，且作用涉及多靶點(diǎn)多途徑，各種成分相互影響、相互作用，使得中藥毒性研究具有極大的挑戰(zhàn)性。未來需要在傳統(tǒng)的離體線粒體及完整細(xì)胞評(píng)價(jià)模型基礎(chǔ)上，開發(fā)更具仿生性人源性器官評(píng)價(jià)模型，同時(shí)選擇更加靈敏的線粒體毒性靶標(biāo)，應(yīng)用高通量高內(nèi)涵篩選技術(shù)，進(jìn)行規(guī)模化的中西藥線粒體毒性評(píng)價(jià)。此外，線粒體過去被認(rèn)為是在細(xì)胞內(nèi)相互孤立的細(xì)胞能量供應(yīng)中心，而實(shí)際上，其在細(xì)胞中相互連接形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并通過不斷的融合與分裂處于一定的動(dòng)態(tài)平衡之中。對(duì)于研究藥物致使的器官損傷，在評(píng)估線粒體功能時(shí)也應(yīng)該考慮其他細(xì)胞器的功能，將細(xì)胞內(nèi)部細(xì)胞器作為一個(gè)整體網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，將有助于理解藥物引起各種損傷機(jī)制及病變過程。

參考文獻(xiàn)

[1]Hargreaves IP，Al Shahrani M，Wainwright L，Heales SJ.Drug-Induced Mitochondrial Toxicity[J].Drug Saf，2016，39（7）：661-674.

[2]Kühlbrandt W.Structure and function of mitochondrial membrane protein complexes[J].BMC Biol，2015，13：89.

[3]Pereira CV，Moreira AC，Pereira SP，et al.Investigating drug-induced mitochondrial toxicity：a biosensor to increase drug safety？[J].Curr Drug Saf，2009，4（1）：34-54.

[4]Nadanaciva S，Will Y.New insights in drug-induced mitochondrial toxicity[J].Curr Pharm Des，2011，17（20）：2100-2112.

[5]Tsiper MV，Sturgis J，Avramova LV，et al.Differential mitochondrial toxicity screening and multi-parametric data analysis[J].PLoS One，2012，7（10）：e45226.

[6]陳宇征，呂文良.中藥導(dǎo)致藥物性肝損傷的機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2015，21（11）：1476-1478.

[7]Gourlain K，Amellal B，Ait Arkoub Z，et al.Quantitative analysis of human mitochondrial DNA using a real-time PCR assay[J].HIV Med，2003，4（3）：287-292.

[8]Swiss R，Will Y.Assessment of mitochondrial toxicity in HepG2 cells cultured in high-glucose-or galactose-containing media[J].Curr Protoc Toxicol，2011，2（20）：tx0220s49.

[9]Swiss R，Niles A，Cali JJ，et al.Validation of a HTS-amenable assay to detect drug-induced mitochondrial toxicity in the absence and presence of cell death[J].Toxicol In Vitro，2013，27（6）：1789-1797.

[10]Sakamuru S，Attene-Ramos MS，Xia M.Mitochondrial Membrane Potential Assay[J].Methods Mol Biol，2016，1473：17-22.

[11]Rodrigues RM，Macko P，Palosaari T，et al.Autofluorescence microscopy：a non-destructive tool to monitor mitochondrial toxicity[J].Toxicol Lett，2011，206（3）：281-288.

[12]Vuda M，Kamath A.Drug induced mitochondrial dysfunction：Mechanisms and adverse clinical consequences[J].Mitochondrion，2016，31：63-74.

[13]楊婷婷，江振洲，張陸勇.經(jīng)由線粒體損傷誘發(fā)的藥源性肝損傷研究進(jìn)展[J].藥學(xué)進(jìn)展，2014，38（11）：809-818.

[14]Knobeloch LM，Blondin GA，Read HW，et al.Assessment of chemical toxicity using mammalian mitochondrial electron transport particles[J].Arch Environ Contam Toxicol，1990，19（6）：828-835.

[15]Turrens JF.Mitochondrial formation of reactive oxygen species[J].J Physiol，2003，552（2）：335-344.

[16]Yakes FM，Van Houten B.Mitochondrial DNA damage is more extensive and persists longer than nuclear DNA damage in human cells following oxidative stress[J].Proc Natl Acad Sci USA，1997，94（2）：514-519.

[17]Serviddio G，Bellanti F，Giudetti AM，et al.Mitochondrial oxidative stress and respiratory chain dysfunction account for liver toxicity during amiodarone but not dronedarone administration[J].Free Radic Biol Med，2011，51（12）：2234-2242.

[18]Deavall DG，Martin EA，Horner JM，et al.Drug-induced oxidative stress and toxicity[J].J Toxicol，2012，2012：645460.

[19]Westphal D，Dewson G，Czabotar PE，et al.Molecular biology of Bax and Bak activation and action[J].Biochim Biophys Acta，2011，1813（4）：521-531.

[20]Garrido C，Galluzzi L，Brunet M，et al.Mechanisms of cytochrome c release from mitochondria[J].Cell Death Differ，2006，13（9）：1423-1433.

[21]Berson A，Schmets L，F(xiàn)isch C，et al.Inhibition by nilutamide of the mitochondrial respiratory chain and ATP formation.Possible contribution to the adverse effects of this antiandrogen[J].J Pharmacol Exp Ther，1994，270（1）：167-176.

[22]Moreno-Sánchez R，Bravo C，Vásquez C，et al.Inhibition and uncoupling of oxidative phosphorylation by nonsteroidal anti-inflammatory drugs：study in mitochondria，submitochondrial particles，cells，and whole heart[J].Biochem Pharmacol，1999，57（7）：743-752.

[23]Miró O，López S，Pedrol E，et al.Mitochondrial DNA depletion and respiratory chain enzyme deficiencies are present in peripheral blood mononuclear cells of HIV-infected patients with HAART-related lipodystrophy[J].Antivir Ther，2003，8（4）：333-338.

[24]Masubuchi Y，Yamada S，Horie T.Possible mechanism of hepatocyte injury induced by diphenylamine and its structurally related nonsteroidal anti-inflammatory drugs[J].J Pharmacol Exp Ther，2000，292（3）：982-7.

[25]Masubuchi Y，Yamada S，Horie T.Diphenylamine as an important structure of nonsteroidal anti-inflammatory drugs to uncouple mitochondrial oxidative phosphorylation[J].Biochem Pharmacol，1999，58（5）：861-5.

[26]O′Connor N，Dargan PI，Jones AL.Hepatocellular damage from non-steroidal anti-inflammatory drugs[J].QJM，2003，96（11）：787-791.

[27]Berson A，Cazanave S，Descatoire V，et al.The anti-inflammatory drug，nimesulide（4-nitro-2-phenoxymethane-sulfoanilide），uncouples mitochondria and induces mitochondrial permeability transition in human hepatoma cells：protection by albumin[J].J Pharmacol Exp Ther，2006，318（1）：444-454.

[28]Kalghatgi S，Spina CS，Costello JC，et al.Bactericidal antibiotics induce mitochondrial dysfunction and oxidative damage in Mammalian cells[J].Sci Transl Med，2013，5（192）：192ra85.

[29]Pochini L，Galluccio M，Scumaci D，et al.Interaction of beta-lactam antibiotics with the mitochondrial carnitine/acylcarnitine transporter[J].Chem Biol Interact，2008，173（3）：187-194.

[30]Soriano A，Miró O，Mensa J.Mitochondrial toxicity associated with linezolid[J].N Engl J Med，2005，353（21）：2305-2306.

[31]Kakuda TN.Pharmacology of nucleoside and nucleotide reverse transcriptase inhibitor-induced mitochondrial toxicity[J].Clin Ther，2000，22（6）：685-708.

[32]Simnek T，Stérba M，Popelová O，et al.Anthracycline-induced cardiotoxicity：overview of studies examining the roles of oxidative stress and free cellular iron[J].Pharmacol Rep，2009，61（1）：154-171.

[33]Peres LA，da Cunha AD Jr.Acute nephrotoxicity of cisplatin：molecular mechanisms[J].J Bras Nefrol，2013，35（4）：332-340.

[34]Miró O，Barrientos A，Alonso JR，et al.Effects of general anaesthetic procedures on mitochondrial function of human skeletal muscle[J].Eur J Clin Pharmacol，1999，55（1）：35-41.

[35]Vanlander AV，Okun JG，de Jaeger A，et al.Possible pathogenic mechanism of propofol infusion syndrome involves coenzyme q[J].Anesthesiology，2015，122（2）：343-352.

[36]Bosnjak ZJ，Yan Y，Canfield S，et al.Ketamine induces toxicity in human neurons differentiated from embryonic stem cells via mitochondrial apoptosis pathway[J].Curr Drug Saf，2012，7（2）：106-119.

[37]Liu F，Patterson TA，Sadovova N，et al.Ketamine-induced neuronal damage and altered N-methyl-D-aspartate receptor function in rat primary forebrain culture[J].Toxicol Sci，2013，131（2）：548-557.

[38]Sun X，Garlid KD.On the mechanism by which bupivacaine conducts protons across the membranes of mitochondria and liposomes[J].J Biol Chem，1992，267（27）：19147-19154.

[39]Sztark F，Malgat M，Dabadie P，et al.Comparison of the effects of bupivacaine and ropivacaine on heart cell mitochondrial bioenergetics[J].Anesthesiology，1998，88（5）：1340-1349.

[40]Irwin W，F(xiàn)ontaine E，Agnolucci L，et al.Bupivacaine myotoxicity is mediated by mitochondria[J].J Biol Chem，2002，277（14）：12221-12227.

[41]Tolosa L，Carmona A，Castell JV，et al.High-content screening of drug-induced mitochondrial impairment in hepatic cells：effects of statins[J].Arch Toxicol，2015，89（10）：1847-1860.

[42]Stringer HA，Sohi GK，Maguire JA，et al.Decreased skeletal muscle mitochondrial DNA in patients with statin-induced myopathy[J].J Neurol Sci，2013，325（1-2）：142-147.

[43]Brunmair B，Lest A，Staniek K，et al.Fenofibrate impairs rat mitochondrial function by inhibition of respiratory complex I[J].J Pharmacol Exp Ther，2004，311（1）：109-114.

[44]Piel S，Ehinger JK，Elmér E，et al.Metformin induces lactate production in peripheral blood mononuclear cells and platelets through specific mitochondrial complex I inhibition[J].Acta Physiol（Oxf），2015，213（1）：171-180.

[45]Hu D，Wu CQ，Li ZJ，et al.Characterizing the mechanism of thiazolidinedione-induced hepatotoxicity：An in vitro model in mitochondria[J].Toxicol Appl Pharmacol，2015，284（2）：134-141.

[46]Lheureux PE，Penaloza A，Zahir S，et al.Science review：carnitine in the treatment of valproic acid-induced toxicity-what is the evidence？[J].Crit Care，2005，9（5）：431-440.

[47]Komulainen T，Lodge T，Hinttala R，et al.Sodium valproate induces mitochondrial respiration dysfunction in HepG2 in vitro cell model[J].Toxicology，2015，331：47-56.

[48]Santos NA，Medina WS，Martins NM，et al.Aromatic antiepileptic drugs and mitochondrial toxicity：effects on mitochondria isolated from rat liver[J].Toxicol In Vitro，2008，22（5）：1143-1152.

[49]Cruz TS，F(xiàn)aria PA，Santana DP，et al.On the mechanisms of phenothiazine-induced mitochondrial permeability transition：Thiol oxidation，strict Ca2+ dependence，and cyt c release[J].Biochem Pharmacol，2010，80（8）：1284-1295.

[50]Contreras-Shannon V，Heart DL，Paredes RM，et al.Clozapine-induced mitochondria alterations and inflammation in brain and insulin-responsive cells[J].PLoS One，2013，8（3）：e59012.

[51]Lee MY，Hong S，Kim N，et al.Tricyclic Antidepressants Amitriptyline and Desipramine Induced Neurotoxicity Associated with Parkinson′s Disease[J].Mol Cells，2015，38（8）：734-740.

[52]Hroudová J，F(xiàn)iar Z.In vitro inhibition of mitochondrial respiratory rate by antidepressants[J].Toxicol Lett，2012，213（3）：345-352.

[53]Li Y，Couch L，Higuchi M，et al.Mitochondrial dysfunction induced by sertraline，an antidepressant agent[J].Toxicol Sci，2012，127（2）：582-591.

[54]Dykens JA，Jamieson JD，Marroquin LD，et al.In vitro assessment of mitochondrial dysfunction and cytotoxicity of nefazodone，trazodone，and buspirone[J].Toxicol Sci，2008，103（2）：335-345.

[55]Heidari R.The footprints of mitochondrial impairment and cellular energy crisis in the pathogenesis of xenobiotics-induced nephrotoxicity，serum electrolytes imbalance，and Fanconi′s syndrome：A comprehensive review[J].Toxicology，2019，423：1-31.

[56]Amacher DE.Drug-associated mitochondrial toxicity and its detection[J].Curr Med Chem，2005，12（16）：1829-1839.

[57]Yao J，Jiang Z，Duan W，et al.Involvement of mitochondrial pathway in triptolide-induced cytotoxicity in human normal liver L-02 cells[J].Biol Pharm Bull，2008，31（4）：592-597.

[58]Wang P，Pradhan K，Zhong XB，et al.Isoniazid metabolism and hepatotoxicity[J].Acta Pharm Sin B，2016，6（5）：384-392.

[59]Walker UA，Bickel M，Lütke Volksbeck SI，et al.Evidence of nucleoside analogue reverse transcriptase inhibitor--associated genetic and structural defects of mitochondria in adipose tissue of HIV-infected patients[J].J Acquir Immune Defic Syndr，2002，29（2）：117-121.

[60]Meyer JN，Leuthner TC，Luz AL.Mitochondrial fusion，fission，and mitochondrial toxicity[J].Toxicology，2017，391：42-53.

[61]Andrienko T，Kuznetsov AV，Kaambre T，et al.Metabolic consequences of functional complexes of mitochondria，myofibrils and sarcoplasmic reticulum in muscle cells[J].J Exp Biol，2003，206（Pt 12）：2059-2072.

[62]Dykens JA，Will Y.The significance of mitochondrial toxicity testing in drug development[J].Drug Discov Today，2007，12（17-18）：777-785.

[63]Hynes J，Will Y.The Evolution of Mitochondrial Toxicity Assessment in Industry[J].Mitochondrial Biology and Experimental Therapeutics，2018，3：319-332.

[64]Schulz S，Lichtmannegger J，Schmitt S，et al.A protocol for the parallel isolation of intact mitochondria from rat liver，kidney，heart，and brain[J].Methods Mol Biol，2015，1295：75-86.

[65]Wieckowski MR，Giorgi C，Lebiedzinska M，et al.Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells[J].Nat Protoc，2009，4（11）：1582-1590.

[66]Frezza C，Cipolat S，Scorrano L.Organelle isolation：functional mitochondria from mouse liver，muscle and cultured fibroblasts[J].Nat Protoc，2007，2（2）：287-295.

[67]Picard M，Taivassalo T，Gouspillou G，et al.Mitochondria：isolation，structure and function[J].J Physiol，2011，589（18）：4413-4421.

[68]Yamada KM，Cukierman E.Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D[J].Cell，2007，130（4）：601-610.

[69]An R，Merrill D，Avramova L，et al.Phenotypic profiling of Raf inhibitors and mitochondrial toxicity in 3D tissue using biodynamic imaging[J].J Biomol Screen，2014，19（4）：526-537.

[70]Rossignol R，Gilkerson R，Aggeler R，et al.Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells[J].Cancer Res，2004，64（3）：985-993.

[71]PIERCE WA Jr.Glucose and galactose metabolism in Streptococcus pyogenes[J].J Bacteriol，1957，74（2）：186-193.

[72]Marroquin LD，Hynes J，Dykens JA，et al.Circumventing the Crabtree effect：replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants[J].Toxicol Sci，2007，97（2）：539-547.

[73]Elkalaf M，Anděl M，Trnka J.Low glucose but not galactose enhances oxidative mitochondrial metabolism in C2C12 myoblasts and myotubes[J].PLoS One，2013，8（8）：e70772.

[74]Rana P，Nadanaciva S，Will Y.Mitochondrial membrane potential measurement of H9c2 cells grown in high-glucose and galactose-containing media does not provide additional predictivity towards mitochondrial assessment[J].Toxicol In Vitro，2011，25（2）：580-587.

[75]Xu Q，Liu L，Vu H，et al.Can Galactose Be Converted to Glucose in HepG2 Cells？ Improving the in Vitro Mitochondrial Toxicity Assay for the Assessment of Drug Induced Liver Injury[J].Chem Res Toxicol，2019，32（8）：1528-1544.

[76]Hamilton BF，Stokes AH，Lyon J，et al.In vivo assessment of mitochondrial toxicity[J].Drug Discov Today，2008，13（17-18）：785-790.

[77]Mandal A，Pinter K，Drerup CM.Analyzing Neuronal Mitochondria in vivo Using Fluorescent Reporters in Zebrafish[J].Front Cell Dev Biol，2018，6：144.

[78]Robinson BL，Dumas M，Ali SF，et al.Mechanistic studies on ketamine-induced mitochondrial toxicity in zebrafish embryos[J].Neurotoxicol Teratol，2018，69：63-72.

[79]de Boer R，Smith RL，De Vos WH，et al.Caenorhabditis elegans as a Model System for Studying Drug Induced Mitochondrial Toxicity[J].PLoS One，2015，10（5）：e0126220.

[80]Raftery TD，Jayasundara N，Di Giulio RT.A bioenergetics assay for studying the effects of environmental stressors on mitochondrial function in vivo in zebrafish larvae[J].Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol，2017，192：23-32.

[81]Aryaman J，Johnston IG，Jones NS.Mitochondrial Heterogeneity[J].Frontiers in Genetics，2019，9：22-45.

[82]Boehning AL，Essien SA，Underwood EL，et al.Cell type-dependent effects of ellagic acid on cellular metabolism[J].Biomed Pharmacother，2018，106：411-418.

[83]Ngai KC，Yeung CY，Leung CS.Difference in susceptibilities of different cell lines to bilirubin damage[J].J Paediatr Child Health，2000，36（1）：51-55.

[84]Aryaman J，Hoitzing H，Burgstaller JP，et al.Mitochondrial heterogeneity，metabolic scaling and cell death[J].Bioessays，2017，39（7）：28594445.

[85]Maclennan RA，Eakins J，Bauch C，et al.A comprehensive comparison of in vitro assays utilised to detect mitochondrial toxicity[J].Toxicology Letters，2018，295：S200.

[86]Hoornstra D，Andersson MA，Mikkola R，et al.A new method for in vitro detection of microbially produced mitochondrial toxins[J].Toxicol In Vitro，2003，17（5-6）：745-751.

[87]Attene-Ramos MS，Huang R，Sakamuru S，et al.Systematic study of mitochondrial toxicity of environmental chemicals using quantitative high throughput screening[J].Chem Res Toxicol，2013，26（9）：1323-1332.

[88]Wills LP.The use of high-throughput screening techniques to evaluate mitochondrial toxicity[J].Toxicology，2017，391：34-41.

[89]Nadanaciva S，Dykens JA，Bernal A，et al.Mitochondrial impairment by PPAR agonists and statins identified via immunocaptured OXPHOS complex activities and respiration[J].Toxicol Appl Pharmacol，2007，223（3）：277-287.

[90]Nagiec EE，Wu L，Swaney SM，et al.Oxazolidinones inhibit cellular proliferation via inhibition of mitochondrial protein synthesis[J].Antimicrob Agents Chemother，2005，49（9）：3896-3902.

[91]Nadanaciva S，Willis JH，Barker ML，et al.Lateral-flow immunoassay for detecting drug-induced inhibition of mitochondrial DNA replication and mtDNA-encoded protein synthesis[J].J Immunol Methods，2009，343（1）：1-12.

[92]Brookes PS，Yoon Y，Robotham JL，et al.Calcium，ATP，and ROS：a mitochondrial love-hate triangle[J].Am J Physiol Cell Physiol，2004，287（4）：C817-833.

[93]Jones AM，Grossmann G，Danielson J，et al.In vivo biochemistry：applications for small molecule biosensors in plant biology[J].Curr Opin Plant Biol，2013，16（3）：389-395.

[94]Prill S，Bavli D，Levy G，et al.Real-time monitoring of oxygen uptake in hepatic bioreactor shows CYP450-independent mitochondrial toxicity of acetaminophen and amiodarone[J].Arch Toxicol，2016，90（5）：1181-1191.

[95]Hynes J，Natoli E Jr，Will Y.Fluorescent pH and oxygen probes of the assessment of mitochondrial toxicity in isolated mitochondria and whole cells[J].Curr Protoc Toxicol，2009，2（16）：tx0216s40.

[96]Hynes J，Nadanaciva S，Swiss R，et al.A high-throughput dual parameter assay for assessing drug-induced mitochondrial dysfunction provides additional predictivity over two established mitochondrial toxicity assays[J].Toxicol In Vitro，2013，27（2）：560-569.

[97]Beeson CC，Beeson GC，Schnellmann RG.A high-throughput respirometric assay for mitochondrial biogenesis and toxicity[J].Anal Biochem，2010，404（1）：75-81.

[98]Nicholson JK，Connelly J，Lindon JC，et al.Metabonomics：a platform for studying drug toxicity and gene function[J].Nat Rev Drug Discov，2002，1（2）：153-161.

[99]Xu EY，Schaefer WH，Xu Q.Metabolomics in pharmaceutical research and development：metabolites，mechanisms and pathways[J].Curr Opin Drug Discov Devel，2009，12（1）：40-52.

[100]Xu Q，Vu H，Liu L，et al.Metabolic profiles show specific mitochondrial toxicities in vitro in myotube cells[J].J Biomol NMR，2011，49（3-4）：207-219.

[101]楊寧宇.冷凍電鏡技術(shù)在線粒體中的應(yīng)用研究[J].中國(guó)高新科技，2019，3（3）：100-102.

（2020-11-19收稿 責(zé)任編輯：王明）