CD47相關信號通路及其與相關疾病關系的研究進展

葛闖, 胡加亮, 徐寒梅

（中國藥科大學 江蘇省合成多肽藥物發(fā)現(xiàn)與評價工程研究中心，江蘇 南京 211198）

整合素相關蛋白CD47最初發(fā)現(xiàn)于無Rh抗原性溶血性貧血患者體內，其血紅細胞缺乏CD47[1]。前期研究發(fā)現(xiàn)，CD47 與整合素 αvβ3，αⅡbβ3和 α2β1相互作用，調節(jié)整合素功能和調節(jié)細胞對含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的胞外基質蛋白的應答，因而被稱作整合素相關蛋白[2]。CD47在多種腫瘤中表達升高，如卵巢癌、白血病、乳腺癌、結腸癌、膀胱癌、膠質母細胞瘤、肝細胞癌和前列腺腫瘤等[3-5]。研究表明，抗CD47抗體能夠刺激巨噬細胞清除腫瘤細胞[5]，因而CD47成為近年來研究的熱點。

CD47通過與胞外、胞內以及其他的跨膜蛋白的橫向相互作用發(fā)揮不同的功能，介導了不同的信號轉導通路，這些信號通路在腫瘤、血管類疾病、自體免疫性疾病等多種疾病中發(fā)揮著不同作用。

1 CD47結構、表達與相互作用

1.1 結構

CD47屬于免疫球蛋白超家族，有2種異構體，一種含有N糖基化修飾，另一種在其64位和79位絲氨酸含有糖胺聚糖修飾[7]。CD47結構包含3個部分，N末端胞外免疫球蛋白多變（IgV）結構域、高度疏水的5次跨膜片段和1個短的多變C末端胞內段[6]，如圖1所示。

CD47通過胞外段IgV結構域與其配體凝血栓蛋白1（thrombospondin 1，TSP1）和信號調節(jié)蛋白α（signal regulatory protein alpha，SIRPα）相互作用，IgV結構域被N糖基化和O-連接型糖胺聚糖修飾，糖胺聚糖修飾是CD47與TSP相互作用所必需的[7]。IgV結構域上的氨基酸殘基Cys33與跨膜區(qū)最后一個胞外環(huán)上的氨基酸殘基Cys263之間存在長二硫鍵，這一二硫鍵對于CD47配體的結合、信號轉導以及定位到脂筏都是必要的[8]。胞內段存在4種可變剪接體形式，根據(jù)基因結構、多肽序列不同，分為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型，氨基酸數(shù)量從3 ～ 36個不等。Ⅱ型是目前最主要的、表達最多的異構體，其次是Ⅳ型，Ⅳ型主要在腦部和外周神經(jīng)系統(tǒng)表達，而I型只在角質細胞中顯著表達，Ⅲ型主要與記憶鞏固相關[9-10]。

1.2 表達

CD47在幾乎所有的細胞表面都有表達，包括紅細胞和血小板，其表達水平因機體的免疫狀態(tài)或病理狀態(tài)不同而改變。CD47在多種腫瘤中表達較高，并且通過阻斷CD47能夠增強腫瘤的吞噬作用[3-5]。Xu等[11]發(fā)現(xiàn)抗CD47治療可增加巨噬細胞的吞噬功能，降低腫瘤重量，并抑制骨肉瘤異種移植模型中的自發(fā)轉移。Zhang等[5]發(fā)現(xiàn)阻斷CD47可增強巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬作用，減輕腫瘤負荷，提高膠質母細胞瘤患者的存活率。同樣地，Yoshida等[12]也發(fā)現(xiàn)通過阻斷CD47能增強巨噬細胞對胃癌細胞的吞噬作用。以上均表明CD47可能是腫瘤細胞的一個重要生存信號分子，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關[3]。在免疫應答過程中，CD47在CD4效應T細胞表面表達升高，防止記憶性T細胞被巨噬細胞清除，延長生存周期[13]。同樣，造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSCs）表面CD47高表達也使其免受巨噬細胞吞噬，而當CD47在CD34+CD38-HSCs表面表達選擇性下調時，就有可能發(fā)生噬血細胞綜合征（hemophagocytic lymphohistiocytosis，HLH）[14]。

1.3 相互作用

CD47通過胞外IgV結構域主要與3種胞外配體相互作用，分別為CD47-TSP1、CD47-SIRPα及CD47-CD47。由于CD47胞內結構域較小，只有有限的幾種胞內信號蛋白與CD47相互作用，主要是促凋亡調節(jié)蛋白（BCL2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3，BNIP3）以及連接整合素相關蛋白和細胞骨架蛋白（protein-linking integrinassociated protein and cytoskeleton，PLIC）。而CD47與其他跨膜蛋白的橫向相互作用可能在CD47的信號轉導通路中發(fā)揮著重要作用，如整合素αvβ3、血管內皮細胞生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）、Rh血型抗原肽復合物、CD47、自殺相關因子（factor associated suicide，F(xiàn)as）、CD14 等。

1.3.1 胞外相互作用 首先被發(fā)現(xiàn)的CD47內源性配體就是TSP1[15]。TSP1屬于TSP家族成員之一，這一家族除了TSP1之外，還包括TSP2 ～ TSP5。TSP1是一種瞬時表達的細胞基質蛋白，在不同環(huán)境中，通過與細胞表面受體或其他的胞外基質成分相結合調節(jié)細胞功能[16]。TSP1結構很大，包含多種結構域，使其能與多種細胞表面受體和胞外基質相互作用，包括整合素（主要是β1和β3）、CD47、CD36、硫酸乙酰肝素蛋白多糖、低密度脂蛋白相關蛋白1和極低密度脂蛋白受體等[16]。TSP1通過其碳末端結合結構域（C-terminal binding domain）上的VVM序列與CD47相結合，進而影響多種細胞功能，如細胞遷移和黏附、細胞增殖和凋亡、調節(jié)血管生成和炎癥反應等[17]。

第2個被發(fā)現(xiàn)的內源性配體是SIRPα[18]。SIRPα屬于免疫球蛋白超家族，是一種跨膜蛋白，表達在骨髓細胞表面，如單核細胞、巨噬細胞、粒細胞和CD4陽性樹突狀細胞，以及在中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元細胞中以不同水平表達。SIRPα在吞噬細胞表面表達水平似乎非常穩(wěn)定，不會受到炎癥水平的影響，而CD47的表達卻隨不同的免疫狀態(tài)或疾病的改變而改變[19]。SIRPα胞外N末端包含3個Ig樣結構域，1個單一的跨膜結構域，胞漿C末端含有4個酪氨酸殘基，帶有2個免疫受體酪氨酸抑制基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM），ITIM是酪氨酸磷酸酶SHP（src-homology domain 2-containing protein tyrosine phosphatase）-1和SHP-2的結合位點，ITIM介導SHP-1和SHP-2的募集和激活，使得磷酸化蛋白底物去磷酸化，從而影響胞內信號通路轉導，如抑制生長因子受體和其他的一些促酪氨酸激酶活性受體的信號轉導[19]。SIRPα通過其N末端IgV結構域與CD47的IgV結構域結合，SIRPα與CD47之間的相互作用在控制細胞吞噬中發(fā)揮作用，能夠產生一種“不要吃我”的信號[20]。

除了與TSP1和SIRPα結合，也有研究表明，細胞間發(fā)生黏附需要CD47的存在而并不需要其配體，表明2個細胞上CD47的IgV結構域也存在著同型結合[21]。不過這種CD47與CD47相互作用能否產生信號轉導還缺乏足夠的證據(jù)。

1.3.2 膜表面相互作用 CD47首先被發(fā)現(xiàn)與整合素αvβ3存在相互作用[2]，后續(xù)又發(fā)現(xiàn)其與多種整合素亞型相互作用，如 αⅡbβ3、α2β1、αLβ2、和 α4β1[22-23]。CD47通過其IgV結構域與整合素αvβ3發(fā)生相互作用，激活整合素，從而引發(fā)后續(xù)的胞內信號轉導，而并不依賴其跨膜結構域[24]。CD47與這些整合素發(fā)生結合，相互作用，能夠改變整合素信號靶點，如黏著斑激酶和樁蛋白[25]，并且CD47-整合素復合體還與三聚體G蛋白相關，參與調控cAMP信號轉導[26]。

CD47能夠與血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）以及 VEGFR2發(fā)生相互作用。而TSP1能夠通過CD47抑制VEGF下游信號級聯(lián)通路[27]。此外，免疫共沉淀和熒光共振能量轉移表明，CD47能夠與VEGFR2直接發(fā)生相互作用，不過這種相互作用會因TSP1和CD47結合以及VEGF與VEGFR2結合而被破壞，從而抑制VEGFR2信號轉導過程[28]。

在紅細胞中，CD47與Rh抗原復合體相互作用，形成復合體，這一復合體通過錨定蛋白與細胞骨架上的血影蛋白連接，有助于維持紅細胞形態(tài)和氨的運輸[29]，不過CD47在其中的功能尚不清楚。

在T細胞中，F(xiàn)as被發(fā)現(xiàn)與CD47發(fā)生橫向相互作用。只有在表達CD47的細胞中，通過激活Fas才能夠引起細胞凋亡。CD47與Fas的相互作用對于Fas下游的信號通路包括caspase-7和聚腺苷酸二磷酸核糖轉移酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）裂解都是必要的[30]。

1.3.3 胞內相互作用 將CD47跨膜結構域和C末端尾巴作為酵母雙雜交系統(tǒng)誘餌，從人類淋巴細胞cDNA文庫中篩選，發(fā)現(xiàn)BNIP3是其胞漿結合配體[31]。反向抑制BNIP3能夠抑制CD47介導的細胞凋亡，而用TSP1激活CD47能夠誘導BNIP3轉移到線粒體，導致細胞死亡，而SIRPα與CD47結合并不能引起B(yǎng)NIP3 轉移[32]。

利用CD47胞漿尾巴的整合素相關蛋白-2（integrin associated protein-2，IAP2） 和 IAP4剪切異構體作為酵母雙雜交系統(tǒng)誘餌鑒別出了另外2種泛素相關蛋白作為CD47胞漿結合配體，分別是連接整合素相關蛋白和細胞骨架蛋白PLIC1和PLIC2，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)PLIC1結合G蛋白βγ亞基（Gβγ），從而使CD47與三聚體G蛋白相結合，調節(jié)其下游信號通路[33]。

2 CD47相關信號通路

在胞外與CD47相互作用的配體分別是TSP1、SIRPα和CD47自身。其中，目前對CD47自身的同型相互作用參與的信號轉導知之甚少。因此，目前CD47主要參與的信號通路可以按胞外與之相互作用的配體大致分為2個方面，即TSP1和SIRPα分別與CD47相互作用參與調控的信號通路，如圖2所示。

2.1 CD47/TSP-1相關通路

2.1.1 調控G蛋白通路 CD47與整合素形成的復合體可通過其胞內配體PLIC1與三聚體G蛋白相互作用，形成CD47-整合素-G蛋白復合體[33]。CD47的5個跨膜結構域與其配體整合素的2個TM片段形成一個臨時的7次跨膜復合體（7TMS），7TMS能夠激活G蛋白。不同的整合素配體以及具有不同胞漿尾巴的CD47異構體都能夠使7TMS復合體具有激活特異性三聚體G蛋白的功能[34]。G蛋白可以介導CD47多種細胞效應，如CD47相關的血小板激活需要G蛋白激活Syk激酶，從而誘導Lyn和FAK磷酸化[34]。CD47-整合素-G蛋白復合體的另一成分是膽固醇。去除膽固醇不會影響整合素親和性，但會降低CD47刺激細胞黏附到玻連蛋白的能力。因此，雖然細胞基本的擴散機制與膽固醇無關，但是膽固醇似乎對保持功能性的CD47-整合素-G蛋白復合體起著必要的作用[35]。

2.1.2 調控NO/cGMP信號通路 在血管細胞中，內皮一氧化氮合酶（endothelial NO synthase，eNOs）是主要的一氧化氮（NO）合酶異構體，它能將L-精氨酸轉變成L-瓜氨酸并釋放NO。eNOs活性受到機械刺激和循環(huán)因子如VEGF和乙酰膽堿的調控。VEGF通過內皮細胞上的VEGFR2激活PI3K，后者激活蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱為Akt），Akt磷酸化eNOs上的第1177位絲氨酸，使其激活[36]。同時活化的VEGFR2募集Src并誘導Ca2+信號通路，進一步激活eNOs[36]。產生的NO結合靶細胞中可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（soluble guanylate cyclase，sGC）的血紅素結構，增加其酶催化活性，導致胞內cGMP積聚，cGMP激活cGMP依賴性激酶 1（cGMP-dependent protein kinase，cGK1），后者磷酸化肌球蛋白輕鏈激酶并抑制其活性，使得肌球蛋白輕鏈脫磷酸化而引起平滑肌松弛[36]。TSP1能夠與CD47結合，破壞CD47與VEGFR2復合體，抑制VEGFR2激活[28]，進而影響下游信號通路。

2.1.3 調控細胞生存 TSP1與CD47結合能夠誘導BNIP3轉移到線粒體，BNIP3跨膜結構域插入到線粒體膜，引起線粒體通透性轉換孔打開，釋放細胞色素C，導致細胞死亡[32]。缺乏CD47有助于細胞通過激活保護性的自噬通路促進其生存[37]。自噬是一種維持內環(huán)境穩(wěn)定的分解代謝機制，是胞質溶膠和細胞器被隔離到雙層膜的小泡中，由此運送到溶酶體/空泡中降解，并因此形成的大分子進行再循環(huán)的一個過程。輕度的自噬可以防止細胞被不利因素損害，有助于其生存。缺乏CD47的細胞受到輻射時，beclin-1、ATG5、 ATG7表達升高，p62表達降低，LC3表達升高，自噬小體形成增多，激活保護性自噬。其中Beclin-1也能夠與Bcl-2/Bcl-xL結合構成復合體，從而自噬的激活過程將會受到抑制，因此，Beclin-1與Bcl-2相互作用可直接控制自噬與凋亡[37]。

2.2 CD47/SIRPα相關通路

2.2.1 調控吞噬作用 CD47作為一種自體的識別分子，或者是作為一種“不要吃我”的信號分子，能夠與巨噬細胞表面的SIRPα相互作用，防止腫瘤細胞和紅細胞被清除[5,38]。這種防止巨噬細胞吞噬的機制涉及到SIRPα的抑制性信號通路，其中部分是通過SHP-1來抑制巨噬細胞吞噬作用[19]。

此外，有研究發(fā)現(xiàn)，CD47-SIRPα相互作用在紅細胞清除方面的功能可能要更為復雜。人體紅細胞的衰老似乎與CD47的構象改變有關，可能是依賴于氧化修飾，其能夠將分子從“不要吃我”轉變?yōu)椤俺晕摇钡慕Y構[38]。因此，CD47不僅是一種“不要吃我”的信號，也可能是作為一種調節(jié)紅細胞清除的開關。因此，CD47或者SIRPα表達異常或相互作用受到干擾都會改變巨噬細胞的吞噬作用，破壞紅細胞的體內穩(wěn)態(tài)。

2.2.2 調節(jié)樹突狀細胞和T細胞體內穩(wěn)態(tài) 有研究發(fā)現(xiàn)，SIRPα變異小鼠的脾臟CD4+DC細胞數(shù)量減少，半衰期降低[39]，脾臟中CD4+T細胞數(shù)量減少，T細胞聚集區(qū)域變小[40]。表明CD47與SIRPα相互作用對于調節(jié)樹突狀（DC）細胞和T細胞體內穩(wěn)態(tài)具有重要的作用。此外有研究發(fā)現(xiàn)，DC細胞和T細胞應答在多種水平上受到CD47與SIRPα相互作用的影響，CD47與SIRPα相互作用受到干擾會使得DC細胞功能受損，尤其是在誘導輔助性T細胞Th1、Th2、Th17和自然殺傷性T細胞（natural killer T cell，NKT）應答方面[41-42]。

3 CD47相關信號通路與疾病的關系

3.1 癌癥

CD47在多種腫瘤細胞表面高表達，其作為一種“不要吃我”的信號分子，與巨噬細胞表面SIRPα相互作用，從而使腫瘤細胞避免被吞噬清除，增強腫瘤生存能力[3-5]。因此，靶向CD47-SIRPα相互作用可能成為腫瘤治療的一種新策略。

目前抗腫瘤治療主要靶向CD47-SIRPα軸，多種治療藥物已處于臨床研究階段，包括常規(guī)抗體，融合蛋白和雙特異性分子，分別阻斷CD47或SIRPα（見表1）。

表1 靶向CD47-SIRPα的抗腫瘤藥物Table 1 CD47-SIRPα targeting therapeutics for tumor

3.2 心血管疾病

心血管疾病主要的臨床表現(xiàn)包括卒中、黃斑變性、外周血管病、高血壓、心臟和其他關鍵器官衰竭、心臟病、傷口愈合不良等。其病因主要是急性或亞急性血流量下降并伴隨組織低灌注，而血管細胞內NO信號通路受損是導致心血管疾病的關鍵因素[50]。在衰老過程中，內源性NO合成減少而TSP1表達升高。如前所述，TSP1和CD47相互作用能夠抑制NO/cGMP信號通路，因此抑制TSP1-CD47相互作用能夠改善NO信號通路，減輕心血管疾病的發(fā)生[28]。

Kojima等[51]采用CD47阻斷抗體MIAP410，發(fā)現(xiàn)體外可誘導病變的、死亡的與即將死亡的平滑肌細胞和巨噬細胞被清除，并在幾種不同的動脈粥樣硬化小鼠中，利用抗CD47抗體阻斷CD47，從而顯著地阻止動脈斑塊堆積，使病變血管組織的清除恢復正常。

3.3 自身免疫性疾病

有研究表明，SIRPα和CD47與Th1細胞或Th17細胞相關的自身免疫性疾病的形成有關，如實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）、細菌或膠原誘導的關節(jié)炎、接觸性超敏反應、結腸炎、克羅恩病等[52-53]。如前所述，CD47-SIRPα相互作用對DC細胞的功能具有調節(jié)作用，尤其是遷移和抗原呈遞，其對于激活自身反應性Th1細胞和Th17細胞是必須的。在關節(jié)炎、結腸炎和克羅恩病中，干擾CD47-SIRPα相互作用能夠抑制病情，然而在EAE中卻會加重自身免疫和相關疾病[53]。研究表明，SIRPα缺失小鼠或者給予抗SIRPα抗體（P84）能夠顯著減輕Ⅱ型膠原型關節(jié)炎小鼠的炎癥水平、骨侵蝕和關節(jié)炎癥狀[42,53]。

3.4 噬血細胞綜合征

HLH典型特征之一就是噬血細胞作用增強，主要是由于細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）和NK細胞清除病原功能受損，導致巨噬細胞過度增殖，噬血細胞增多。CD47在HLH的CD34+CD38-HSCs中表達下調，巨噬細胞對其吞噬作用增強，從而發(fā)生噬血細胞綜合征[54]。

4 結語與展望

CD47與其2個配體TSP1和SIRPα相互作用，參與多種信號通路，參與機體多種生理功能及病理過程的發(fā)生發(fā)展，因此靶向CD47為疾病的治療提供了一種新的方法。目前，靶向CD47的治療主要還是集中在抗腫瘤領域，治療策略主要有阻斷抗體、重組融合蛋白、反義RNA、小分子抑制劑，其中阻斷抗體和重組融合蛋白研究較多，主要是分別靶向CD47及其2個配體SIRPα和TSP1[55]。目前國際上處于I期臨床的靶向CD47的抗腫瘤藥物包括Hu5F9-G4、CC-90002、TTI-621、ALX148等， 其中TTI-621是可溶性重組SIRPα-Fc融合蛋白，其穿透能力和組織分布性較好，與紅細胞的親和力也更低，安全性更高[19]。國內走在前列的是宜明昂科生物的IMM01，目前已獲得臨床試驗受理。小分子抑制劑，如多肽，體內半衰期較短，且容易酶解，難以發(fā)揮治療作用，但其可用于設計有效穩(wěn)定的模擬肽，如TSP-1的模擬肽，可用于識別其受體CD36[32]。反義RNA能夠阻斷CD47 mRNA翻譯，從而抑制CD47蛋白表達，也有望成為靶向CD47的有效手段[56]?？傊?，CD47不僅是目前腫瘤領域研究的熱點，在其他多種疾病中也扮演著重要作用，開發(fā)靶向CD47藥物有望為疾病的治療提供新的策略。