熊南燕，劉曉霞*，陳劍華，李衛(wèi)霞，郭旭麗，王雪玲，霍忠超

(1.河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河北 邯鄲 056038;2.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院)

抗生素自問(wèn)世以來(lái)在感染性疾病的治療方面發(fā)揮了很重要的作用，但隨著抗生素的使用，耐藥菌株逐漸增多，抗生素的療效逐漸降低。為了改善此現(xiàn)狀，臨床上常將一些具有清熱解毒作用的中藥制劑與抗生素聯(lián)合應(yīng)用治療感染性疾病，喜炎平即為常用中藥制劑之一。臨床上已將喜炎平注射液與阿奇霉素[1]、左氧氟沙星[2]、克林霉素[3]、頭孢哌酮[4]、頭孢曲松[5]等抗生素聯(lián)合治療呼吸道感染、扁桃體炎、化膿性中耳炎等感染性疾病，發(fā)現(xiàn)其效果顯著，能提高臨床有效率。本研究將喜炎平注射液與頭孢唑林鈉聯(lián)合應(yīng)用于金葡球菌感染小鼠，探討其對(duì)中性粒細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制，為中藥制劑與抗生素聯(lián)合應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料與方法

1.1 菌株金葡菌敏感菌株(26001-25)、金葡菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC25923)購(gòu)自北京藥品生物制品檢定所。

1.2 藥品與試劑頭孢唑林鈉(中諾藥業(yè)，國(guó)藥準(zhǔn)字H13020765，1 g/支)，喜炎平注射液(江西青峰，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20026249，規(guī)格2 mL∶50 mg)；小鼠中性粒細(xì)胞分離液(天津?yàn)?、紅細(xì)胞裂解液(天津?yàn)?；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海碧云天)； 小鼠IL-6、IL-10檢測(cè)試劑盒(南京森貝伽)；小鼠sFas 檢測(cè)試劑盒(泉州睿信生物)。

1.3 動(dòng)物造模及分組昆明小鼠70只，體重17-23 g，雌雄各半。于造模前1天，間隔1 h，經(jīng)小鼠直腸測(cè)體溫2次，選擇體溫(36.5±0.2)℃，兩次體溫相差不超過(guò)0.2℃的小鼠65只。于造模當(dāng)天每只入選小鼠腹腔注射金葡菌(9×108/mL)0.2 ml， 1 h后，經(jīng)直腸測(cè)量體溫，選擇體溫高于37.2℃的小鼠60只，根據(jù)體溫編號(hào)，并隨機(jī)分為模型組、頭孢唑林鈉組、喜炎平組及頭孢唑林鈉+喜炎平組，每組15只；另選15只體溫正常小鼠，腹腔注射PBS，作為對(duì)照組。于造模當(dāng)日，各組小鼠均經(jīng)腹腔按體重給藥，每日2次，對(duì)照組和模型組給予生理鹽水(70 mg/kg)；頭孢唑林鈉組給予頭孢唑林鈉(70 mg/kg)；喜炎平組給予喜炎平注射液(13 mg/kg)；頭孢唑林鈉+喜炎平組給予頭孢唑林鈉(70 mg/kg)和喜炎平注射液(13 mg/kg)；共給藥7天。

1.4 小鼠中性粒細(xì)胞和血漿分離分別于給藥第1、4、7天，經(jīng)心臟采血約1.5 ml，抗凝，每次5只小鼠。0.5 ml抗凝血用于分離中性粒細(xì)胞，操作步驟嚴(yán)格按說(shuō)明書進(jìn)行，取中性粒細(xì)胞層，裂解紅細(xì)胞，洗滌，臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞活力(>95%)。余抗凝血離心分離血漿備用。

1.5 中性粒細(xì)胞凋亡檢測(cè)取2×105/mL中性粒細(xì)胞用冰PBS洗滌2次，棄上清，加入Annexin V-FITC結(jié)合液195 μl，重懸細(xì)胞，加入Annexin V-FITC 5 μl，混勻，加入PI 10 μl，混勻，室溫避光孵育15 min，孵育過(guò)程中重懸細(xì)胞2次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6 血漿IL-6、IL-10和sFas檢測(cè)取1.4中制備的血漿，采用ELISA法檢測(cè)血漿IL-6、IL-10和sFas含量，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 各組中性粒細(xì)胞凋亡率比較由流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果可知，用藥第1天，各組間中性粒細(xì)胞凋亡率無(wú)顯著性差異(P>0.05)；用藥第4天和第7天，與對(duì)照組相比，模型組凋亡率顯著降低(P<0.05)，頭孢唑林鈉組無(wú)顯著變化(P>0.05)，喜炎平組和頭孢唑林鈉+喜炎平組顯著升高(P均<0.05)；與模型組相比，頭孢唑林鈉組、喜炎平組和頭孢唑林鈉+喜炎平組凋亡率顯著升高(P均<0.05)，且喜炎平組凋亡率顯著高于頭孢唑林鈉組(P<0.05)，二者聯(lián)合用藥組的凋亡率顯著高于各自單用藥組(P均<0.05，表1、圖1)。

2.2 各組血漿IL-6水平比較ELISA結(jié)果顯示，用藥第1天，與對(duì)照組相比，其他4組血漿IL-6水平顯著升高(P均<0.05)，而該4組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。用藥第4天，與對(duì)照組相比，其他4組IL-6水平均顯著升高(P均<0.05)，與模型組相比，其他3組IL-6水平顯著降低(P均<0.05)，且喜炎平組顯著低于頭孢唑林鈉組(P<0.05)，二者聯(lián)合用藥組顯著低于各自單用藥組(P均<0.05)。用藥第7天，模型組、頭孢唑林鈉組和喜炎平組IL-6水平與對(duì)照組相比均顯著升高(P均<0.05)，但頭孢唑林鈉+喜炎平組與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)；與模型組相比，其他3組IL-6水平顯著降低(P均<0.05)，且喜炎平組顯著低于頭孢唑林鈉組(P<0.05)，二者聯(lián)合用藥組顯著低于各自單用藥組(P均<0.05)。模型組隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，第4天和第7天IL-6水平均顯著降低(P均<0.05)；其他3個(gè)用藥組，也隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)，第4天和第7天IL-6水平顯著降低(P均<0.05，表2)。

表1 各組中性粒細(xì)胞凋亡率比較(%)

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與頭孢唑林鈉組相比，&P<0.05；與喜炎平組相比，△P<0.05

注：A：對(duì)照組；B：模型組；C：頭孢唑林鈉組；D：喜炎平組；E：頭孢唑林鈉+喜炎平組

表2 各組血清IL-6水平比較(ng/L)

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與頭孢唑林鈉組相比，&P<0.05；與喜炎平組相比，△P<0.05。與第1天相比，aP<0.05；與第4天相比，bP<0.05

2.3 各組血漿IL-10水平比較用藥第1天，與對(duì)照組相比，其他4組血漿IL-10水平顯著升高(P均<0.05)，但該4組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。用藥第4天和第7天，與對(duì)照組相比，其他4組IL-10水平均顯著升高(P均<0.05)，與模型組相比，其他3組IL-10水平顯著升高(P均<0.05)，且喜炎平組顯著高于頭孢唑林鈉組(P<0.05)，二者聯(lián)合用藥組顯著高于各自單用藥組(P均<0.05)。模型組隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，第4天和第7天IL-10水平均顯著降低(P均<0.05)；而頭孢唑林鈉組、喜炎平組和頭孢唑林鈉+喜炎平組，用藥第4天和第7天IL-10水平顯著高于第1天，但各組在該兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間無(wú)顯著性差異(P>0.05，表3)。

表3 各組血清IL-10水平比較(ng/L)

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與頭孢唑林鈉組相比，&P<0.05；與喜炎平組相比，△P<0.05。與第1天相比，aP<0.05

2.4 各組血漿sFas水平比較用藥第1天、第4天和第7天，模型組、頭孢唑林鈉組、喜炎平組和頭孢唑林鈉+喜炎平組血漿sFas水平顯著高于對(duì)照組；但該4組在同一時(shí)間點(diǎn)，彼此之間無(wú)顯著性差異(P均>0.05)，且該4組中，各組不同時(shí)間點(diǎn)之間亦無(wú)顯著性差異(P均>0.05，表4)。

表4 各組血漿sFas水平比較(μg/L)

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05

3 討論

中性粒細(xì)胞(neutrophils)是機(jī)體非特異性抗感染免疫的第一道防線[6]，其主要存在于血液中，不僅能吞噬清除血液中的細(xì)菌，還可在趨化因子的作用下，通過(guò)趨化運(yùn)動(dòng)從血液進(jìn)入到組織對(duì)細(xì)菌進(jìn)行吞噬，并通過(guò)胞內(nèi)殺菌機(jī)制和脫顆粒達(dá)到清除細(xì)菌的目的。此為非特異性過(guò)程，中性粒細(xì)胞在消滅細(xì)菌的同時(shí)，也會(huì)對(duì)自身組織造成損傷[6]，及時(shí)清除中性粒細(xì)胞是炎癥減弱的關(guān)鍵。凋亡是中性粒細(xì)胞安全清除的有效方式，其凋亡后可被巨噬細(xì)胞完整吞噬[7]，不再釋放酶性物質(zhì)，減少對(duì)機(jī)體的損傷，故其凋亡在炎癥的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮關(guān)鍵作用。鑒于目前臨床上常將中藥制劑與抗生素聯(lián)合用于感染性疾病的治療，為了尋找聯(lián)合用藥的機(jī)制，本研究觀察了喜炎平與頭孢唑林鈉聯(lián)合應(yīng)用對(duì)中性粒細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，感染后小鼠中性粒細(xì)胞凋亡率降低，提示出現(xiàn)凋亡延遲現(xiàn)象。楊帆[8]進(jìn)行體外研究認(rèn)為金葡菌可促進(jìn)奶牛中性粒細(xì)胞凋亡，與本研究結(jié)果不相符，可能與本研究為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，受復(fù)雜內(nèi)環(huán)境的影響有關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，頭孢唑林鈉單用可促進(jìn)中性粒細(xì)胞凋亡，但仍低于正常水平，而喜炎平單用、喜炎平與頭孢唑林鈉聯(lián)合應(yīng)用可使其凋亡率大大提高，甚至高于正常水平，聯(lián)合用藥提高更顯著。李洪濤等[9]發(fā)現(xiàn)北五味子多糖可促進(jìn)健康人中性粒細(xì)胞凋亡，賴曉敏[10]發(fā)現(xiàn)加味四君子湯可促進(jìn)嚴(yán)重燙傷大鼠中性粒細(xì)胞凋亡；與本研究結(jié)果一致，提示中藥相關(guān)藥物能夠促進(jìn)中性粒細(xì)胞凋亡。

中性粒細(xì)胞凋亡過(guò)程受多種因素調(diào)節(jié)[11]，其中細(xì)胞因子就是影響因素之一，因其種類繁多，對(duì)中性粒細(xì)胞凋亡既可抑制，也可促進(jìn)。IL-6和IL-10分別是體內(nèi)有效的內(nèi)源性促炎因子和抗炎因子，韓露等[12]發(fā)現(xiàn)IL-6可延遲中性粒細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑制作用；Hofman[13]認(rèn)為IL-10能加速LPS激活的中性粒細(xì)胞凋亡。本研究將IL-6和IL-10作為觀察對(duì)象，發(fā)現(xiàn)小鼠感染后，血漿IL-6和IL-10水平均升高，但隨感染時(shí)間延長(zhǎng)，其水平逐漸降低，楊明等[14]認(rèn)為金葡菌經(jīng)血流感染小鼠，血清IL-6和IL-10水平分別在感染后12 h和3 h達(dá)高峰，之后逐漸降低，這一變化趨勢(shì)與本研究一致。頭孢唑林鈉、喜炎平及二者聯(lián)合用藥均可顯著降低IL-6水平，且在給藥期限內(nèi)，用藥時(shí)間越長(zhǎng)，降低程度越大；頭孢唑林鈉與喜炎平聯(lián)合用藥降低效果更顯著，用藥結(jié)束基本達(dá)到正常水平。而對(duì)于IL-10，各用藥組均能顯著提高其水平，但單用頭孢唑林鈉提高IL-10水平能力較單用喜炎平組和二者聯(lián)用效果略差，二者聯(lián)合用藥提高IL-10的能力最顯著；各用藥組在用藥第4天血漿IL-10水平高于用藥第1天，用藥第7天與第4天無(wú)差異，提示各種用藥方式對(duì)血漿IL-10水平的提高作用受用藥時(shí)間影響不明顯。提示喜炎平與頭孢唑林鈉聯(lián)合應(yīng)用可能通過(guò)降低IL-6水平、提高IL-10水平來(lái)促進(jìn)中性粒細(xì)胞凋亡。李洪濤[9]認(rèn)為北五味子多糖可以通過(guò)降低IL-6表達(dá)促進(jìn)中性粒細(xì)胞凋亡，Yang[15]研究發(fā)現(xiàn)特定抑制劑對(duì)SHP-2抑制后可通過(guò)提高IL-10水平促進(jìn)中性粒細(xì)胞凋亡，與本研究結(jié)果相符。

此外，中性粒細(xì)胞還可通過(guò)Fas/FasL信號(hào)途徑介導(dǎo)凋亡，血漿中分泌型Fas(sFas)對(duì)該途徑有競(jìng)爭(zhēng)抑制作用，從而也抑制中性粒細(xì)胞凋亡[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，金葡菌感染后小鼠血漿sFas水平顯著升高，隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)，其水平有增高趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異，提示sFas可能參與了中性粒細(xì)胞凋亡延遲。Huttunend等[16]也發(fā)現(xiàn)菌血癥時(shí)，血清sFas水平升高；酈珊珊[17]的研究結(jié)果顯示血漿sFas水平越高，中性粒細(xì)胞凋亡率越低。但關(guān)于治療措施對(duì)sFas的影響還未見(jiàn)報(bào)道。本研究顯示頭孢唑林鈉、喜炎平及喜炎平與頭孢唑林鈉聯(lián)合應(yīng)用對(duì)血漿sFas水平無(wú)顯著影響。

綜上所述，喜炎平與頭孢唑林鈉聯(lián)合應(yīng)用能促進(jìn)金葡菌感染小鼠的血漿中性粒細(xì)胞凋亡，能降低血漿IL-6水平、提高IL-10水平，對(duì)血漿sFas水平無(wú)顯著影響。故認(rèn)為喜炎平與頭孢唑林鈉聯(lián)合應(yīng)用可能通過(guò)調(diào)節(jié)IL-6和IL-10水平，來(lái)促進(jìn)中性粒細(xì)胞凋亡，從而減輕炎癥反應(yīng)，改善患者癥狀，這可能是二者聯(lián)合用藥治愈疾病的機(jī)制之一。