姚曉媛，宋曉環(huán)，王忠超，鐘志偉

(長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，長(zhǎng)春 130031)

二十二碳六烯酸(DHA)為一種ω-3多不飽和脂肪酸(ω-3PUFAs)。有研究發(fā)現(xiàn)，與普通人群相比，長(zhǎng)期攝入水平較高的ω-3PUFAs人群，發(fā)生惡性腫瘤如結(jié)腸癌、乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)較低。越來(lái)越多的文獻(xiàn)表明，ω-3PUFAs不僅可以對(duì)體外腫瘤細(xì)胞的增殖進(jìn)行抑制，還能使小動(dòng)物體內(nèi)的腫瘤體積縮小，誘導(dǎo)其凋亡，但尚不明確其作用機(jī)制，因此對(duì)凋亡誘導(dǎo)過程中凋亡蛋白caspase-3和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK1/3)的作用進(jìn)行了探討，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

選擇人低分化胃腺癌細(xì)胞系SGC-7901，由吉林省科學(xué)醫(yī)學(xué)院提供，在鏈霉素100 U/mL+青霉素100 U/mL+10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，并研究處于生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

1.2 儀器和試劑

選擇美國(guó)Beckman Coulter公司生產(chǎn)的Epics-XL型流式細(xì)胞儀。試劑包括辣根酶標(biāo)志的山羊抗鼠二抗、Phospho-ERK、蛋白提取試劑盒、Annexin V/碘化丙啶(PI)試劑盒、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、RPMI1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清、DNA。

1.3 方法

1.3.1 MTT法對(duì)細(xì)胞增殖抑制率進(jìn)行檢測(cè)

在96孔培養(yǎng)板上接種細(xì)胞懸液，100 μL/孔，經(jīng)24 h培養(yǎng)，然后將不同DHA作用濃度作為基本依據(jù)，設(shè)置3組，6孔/組，加入濃度為10、30以及50 μg/mL的DHA，控制好每個(gè)孔的體積，一般為200 μl。同時(shí)，再設(shè)置一個(gè)對(duì)照組，將培養(yǎng)基加入，經(jīng)過24 h、48 h以及72 h的平行培養(yǎng)后，將5 mg/mLMTT 20 μL加入，繼續(xù)進(jìn)行4 h孵育，棄上清，將150 μL DMSO加入，然后在570 mm波長(zhǎng)處，運(yùn)用酶標(biāo)儀對(duì)每孔吸光度(OD)值進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)細(xì)胞增殖抑制率進(jìn)行計(jì)算。

1.3.2 細(xì)胞凋亡率分析

運(yùn)用DHA 10 μg/mL、30 μg/mL以及50 μg/mL對(duì)SCG-7901細(xì)胞進(jìn)行24 h作用后，對(duì)1×106個(gè)細(xì)胞進(jìn)行收集，經(jīng)過1次鈣緩沖液洗滌后，將10 μL AnnexinV-FITC加入后，在4℃條件下進(jìn)行20 min靜置，采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。

1.3.3 運(yùn)用Western blot對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測(cè)

在100 mL培養(yǎng)瓶中加入SCG-7901細(xì)胞后，在10 μg/mL、30 μg/mL以及50 μg/mL DHA培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，將含藥培養(yǎng)基棄去，運(yùn)用預(yù)冷的PBS對(duì)細(xì)胞進(jìn)行沖洗后，倒盡PBS后吸盡，在冰上放置，然后將含1%PMSF的蛋白裂解液加入，裂解一段時(shí)間，一般為30 min，然后刮下細(xì)胞，在4℃條件下對(duì)上清液進(jìn)行提取，并且運(yùn)用BCA法對(duì)蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行測(cè)定，對(duì)上樣量進(jìn)行計(jì)算。同時(shí)，運(yùn)用TBST進(jìn)行洗滌后，將ECL化學(xué)發(fā)光劑加入，其中參比蛋白為β-actin，并且在對(duì)caspase蛋白和ERKI/2蛋白表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定時(shí)，采用LAS-4000圖像軟件。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本數(shù)據(jù)由SPSS 20.0軟件分析，個(gè)組間對(duì)比經(jīng)單因素方差分析，采用T檢驗(yàn)組間計(jì)量資料對(duì)比，以P<0.05表示有差異。

2 結(jié)果

2.1 DHA抑制SCG07901細(xì)胞增殖

DHA可以有效抑制胃癌細(xì)胞增殖，并且具有濃度和時(shí)間依賴性的特點(diǎn)(P<0.05)，見圖1。

圖1 DHA可以抑制SCG-7901胃癌細(xì)胞增殖

2.2 DHA影響SCG-7901細(xì)胞凋亡

對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率為(1.42±0.19)%，而DHA 50 μg/mL、30 μg/mL以及10 μg/mL作用于SCG-7901的細(xì)胞凋亡率分別為(14.34±3.11)%、(8.14±2.53)%、(5.29±1.11)%，組間比較有差異(P<0.05)。

2.3 分析P-ERK1/2活性

在DHA實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中，ERK1/2的表達(dá)相對(duì)恒定，但是與10 μg/mL組和對(duì)照組相比，DHA 50 μg/mL和30 μg/mL組的ERK1/2活性下降明顯，組間對(duì)比差異顯著(P<0.05)，見圖2。

注：1—對(duì)照組；2-10μg/ml DHA組；3—30μg/ml DHA組；4—50μg/ml DHA組

2.4 分析caspase-3活性

隨著DHA濃度的增加，caspase-3的表達(dá)明顯升高(P<0.05)，見圖3。

圖3 caspase-3蛋白表達(dá)

3 討論

近年來(lái)，隨著人們生活方式和飲食習(xí)慣的改變，我國(guó)胃癌患者人數(shù)明顯增加。因?yàn)槠鸩‰[匿，再加上早期癥狀不典型，患者不容易察覺，大多數(shù)患者在晚期或中期確診，其預(yù)后差，5年生存率低，嚴(yán)重危害患者身心健康。MAPKs作為細(xì)胞內(nèi)的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在多種細(xì)胞的外刺激下可以將其激活，其對(duì)細(xì)胞的凋亡、增殖、分化以及生長(zhǎng)控制主要靠信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)[1]。有文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)胞的增殖和凋亡與MAPKs信號(hào)系統(tǒng)中的ERK1/2信號(hào)通路蛋白有關(guān)，其中活化的ERK1/2細(xì)胞通路蛋白能夠?qū)⒑藘?nèi)的c-Fos、c-Jun等轉(zhuǎn)錄因子激活，并且在細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化調(diào)控中發(fā)揮著極其重要的作用[2]。通常情況下，如果長(zhǎng)時(shí)間使ERK1/2處于活化狀態(tài)，可對(duì)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和增殖起到一定的促進(jìn)作用[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，DHA不僅能對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖進(jìn)行抑制，還可以對(duì)ERK1/2信號(hào)通路的磷酸化過程進(jìn)行抑制，說明ERK途徑與DHA對(duì)SCG細(xì)胞增殖的抑制有關(guān)[4]。在本研究中，DHA在對(duì)SCG-7901細(xì)胞凋亡進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)，ERK1/2通路往往處于抑制狀態(tài)，而DHA與CSG-7901細(xì)胞中的P-ERK1/2表達(dá)具有濃度依賴性的特點(diǎn)，說明抑制ERK1/2活性，可能是DHA對(duì)SCG-細(xì)胞增殖進(jìn)行抑制的一個(gè)分子機(jī)制[5]。caspase作為白細(xì)胞介素-1β的一種轉(zhuǎn)化酶，不僅是凋亡的執(zhí)行者，也是接受者，并且可以改變細(xì)胞形態(tài)學(xué)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[6]。同時(shí)，本次研究還發(fā)現(xiàn)，caspase-3的表達(dá)與DHA濃度的升高呈正比關(guān)系，說明DHA在對(duì)SCG-7901胃癌細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)，caspase-3的激活是比較重要的一個(gè)環(huán)節(jié)[7]。

綜上所述，DHA能夠?qū)PK1/2的磷酸化過程進(jìn)行下調(diào)，將凋亡蛋白caspase-3的表達(dá)激活，從而對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡發(fā)揮誘導(dǎo)作用。