外源草酸對(duì)綠竹筍抗氧化酶和木質(zhì)化的影響

俞 暾，鄭 劍，余學(xué)軍

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 311300；3.浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311300）

綠竹Bambusa oldhami是禾本科Gramineae竹亞科Bambusoideae綠竹屬Bambusa的優(yōu)質(zhì)筍用竹植物，分布于華南叢生竹林亞區(qū)和華中亞熱帶混生竹林亞區(qū)南部，5-10月為產(chǎn)筍期[1-3]。綠竹筍形似馬蹄，俗稱“馬蹄筍”，筍肉細(xì)嫩，味道鮮美，深受人們喜愛(ài)。由于出筍時(shí)期溫度較高，加之出筍集中，綠竹筍采后容易發(fā)生變質(zhì)、腐敗、木質(zhì)化，儲(chǔ)藏難度較大，限制了產(chǎn)品的流通和銷售[4-5]。草酸廣泛存在于動(dòng)植物和真菌體內(nèi)，具有很強(qiáng)的抗氧化性[6]。適當(dāng)濃度的草酸溶液可以作為抗氧化劑應(yīng)用于果蔬的保鮮、儲(chǔ)藏與運(yùn)輸?shù)取Ｓ醒芯堪l(fā)現(xiàn)：草酸處理能夠有效延緩鮮切香蕉Musa nana[7]、荔枝Litchi chinensis[8]、去皮荸薺Heleocharis dulcis[9]的變質(zhì)腐敗，延長(zhǎng)保鮮期。關(guān)于外源草酸處理對(duì)于采后去殼綠竹筍的抗氧化和木質(zhì)化的影響尚未被報(bào)道。因此，本研究以綠竹筍為對(duì)象，研究外源草酸對(duì)去殼綠竹筍抗氧化酶和木質(zhì)化的影響，為竹筍的采后儲(chǔ)藏保鮮提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料的選擇與處理

供試材料綠竹筍于2017年7月下旬采自浙江省瑞安市，瑞安市地理坐標(biāo)27°40′～28°00′N，120°10′～120°15′E，全年無(wú)嚴(yán)寒酷暑，冬短夏長(zhǎng)，四季分明，雨水充沛。全年平均氣溫17.9 ℃，年平均降水量1 110～2 200 mm，歷史年平均降水量1 527.2 mm。挑選外觀完好且直徑和長(zhǎng)度相近的綠竹筍，放置于泡沫箱中6 h內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。綠竹筍樣品切除基部2～3 cm不可食用部分，小心剝除筍殼，用自來(lái)水清洗干凈瀝干，處理組浸入5 mmol·L-1草酸溶液中10 min(該草酸濃度和處理時(shí)間為前期預(yù)實(shí)驗(yàn)獲得的最佳處理參數(shù))，對(duì)照組浸入自來(lái)水保持同等時(shí)間，取出瀝干后于陰涼通風(fēng)處晾干，然后放于塑料筐中，套0.5 mm厚度的聚乙烯袋，不封口，置于(6±1) ℃的恒溫恒濕箱(Sanyo，MIR-554)中儲(chǔ)藏。處理當(dāng)天取樣為T0，隨后每天隨機(jī)取樣，取樣時(shí)間為Tn，n=1、2、3、4、5、6 d，取筍體基部切口位置往上2～4 cm的一段筍肉用于指標(biāo)測(cè)定。每個(gè)處理每次取5根筍樣，重復(fù)3次。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目及測(cè)定方法

過(guò)氧化氫(H2O2)質(zhì)量摩爾濃度采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司過(guò)氧化氫試劑盒測(cè)定。超氧化物歧化酶(SOD)活性、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性、過(guò)氧化物酶(POD)活性參照曹建康等[10]的方法。木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)參照鞠志國(guó)等[11]的方法。4-香豆酸-輔酶A連接酶(4-CL)活性參照畢詠梅等[12]的方法并加以修改。羥基肉桂醇脫氫酶(CAD)活性參照CAI等[13]的方法并加以修改。基因表達(dá)量采用大連TaKaRa公司SYBR Premix Ex TapTM(TliRNaseH Plus)Kit測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)與分析方法

用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及圖表制作；用SPSS 22進(jìn)行0.05水平差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫下草酸對(duì)采后綠竹筍過(guò)氧化氫質(zhì)量摩爾濃度和抗氧化酶活性的影響

由圖1A可知：草酸處理組與對(duì)照組的綠竹筍H2O2質(zhì)量摩爾濃度在冷藏期間的變化趨勢(shì)基本一致，總體上呈先上升后下降的趨勢(shì)，草酸處理組的H2O2質(zhì)量摩爾濃度在冷藏2～6 d時(shí)顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，比對(duì)照組分別降低了9.2%、8.5%、14.3%、10.2%和12.2%。由圖1B和C可知：草酸處理組與對(duì)照組的綠竹筍SOD和CAT活性在冷藏期間的變化趨勢(shì)基本一致，總體上呈先上升后下降的趨勢(shì)；草酸處理組的SOD活性在冷藏2～6 d時(shí)顯著高于對(duì)照組的SOD活性(P＜0.05)，比對(duì)照組分別提高了23.4%、41.5%、18.1%、14.6%和16.4%；草酸處理組的CAT活性在冷藏2～6 d時(shí)顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，比對(duì)照組分別提高了20.2%、7.1%、78.4%、29.7%和25.6%。由此表明：外源草酸處理可以提高綠竹筍體內(nèi)抗氧化酶SOD、CAT的活性，并延緩H2O2的積累。

2.2 低溫下草酸對(duì)采后綠竹筍木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與硬度的影響

如圖2可知：草酸處理組與對(duì)照組的綠竹筍木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和硬度在冷藏期間的變化趨勢(shì)基本一致，總體上呈上升趨勢(shì)。由圖2A可知：草酸處理組的木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)在冷藏的2、3和5 d時(shí)顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，比對(duì)照組分別降低了25.3%、17.3%、12.7%。由圖2B可知：草酸處理組的硬度在冷藏的3～5 d時(shí)顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，比對(duì)照組分別降低了30.5%、33.8%、16.5%。由此說(shuō)明：外源草酸處理可以延緩綠竹筍木質(zhì)素的積累和硬度的上升。

2.3 低溫下草酸對(duì)采后綠竹筍木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶活性的影響

如圖3可知：草酸處理組與對(duì)照組的綠竹筍PAL、4-CL、CAD、POD活性在冷藏期間的變化趨勢(shì)基本一致。如圖3A可知：PAL活性總體上呈上升的趨勢(shì)，草酸處理組的PAL活性在冷藏2～5 d時(shí)顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，比對(duì)照組分別降低了23.3%、25.8%、16.0%、18.2%。如圖3B可知：4-CL活性總體上呈先上升后下降的趨勢(shì)，草酸處理組的4-CL活性在冷藏3 d時(shí)顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，比對(duì)照組降低了26.3%。如圖3C可知：CAD活性總體上呈先上升后下降的趨勢(shì)，草酸處理組的CAD活性在冷藏3～5 d時(shí)顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，比對(duì)照組分別降低了17.7%、17.0%、19.7%。如圖3D可知：POD活性總體上呈先上升后下降的趨勢(shì)，草酸處理組的POD活性在冷藏2～3 d時(shí)顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，比對(duì)照組分別降低了19.9%、21.1%。由此表明：外源草酸處理可以抑制綠竹筍木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶PAL、4-CL、CAD、POD活性的上升。

2.4 低溫下草酸對(duì)采后綠竹筍木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)量影響

如圖4可知：草酸處理組與對(duì)照組的綠竹筍PAL、4-CL、CAD、POD基因相對(duì)表達(dá)量在冷藏期間的變化趨勢(shì)基本一致。由圖4A可知：PAL基因相對(duì)表達(dá)量總體上呈先下降后上升再下降的趨勢(shì)，草酸處理組的PAL基因相對(duì)表達(dá)量在冷藏3～5 d時(shí)顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，比對(duì)照組分別降低了37.4%、28.1%、45.4%。由圖4B可知：4-CL基因相對(duì)表達(dá)量總體上呈上升的趨勢(shì)，草酸處理組的4-CL基因相對(duì)表達(dá)量在冷藏3～5 d時(shí)顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，比對(duì)照組分別降低了45.0%、17.5%、28.1%。由圖4C可知：CAD基因相對(duì)表達(dá)量總體上呈先上升后下降的趨勢(shì)，草酸處理組的CAD基因相對(duì)表達(dá)量在冷藏2～3 d時(shí)顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，比對(duì)照組分別降低了34.7%、48.2%。由圖4D可知：POD基因相對(duì)表達(dá)量總體上呈下降的趨勢(shì)，草酸處理組的POD基因相對(duì)表達(dá)量略低于對(duì)照組，差異不顯著(P＞0.05)。由此說(shuō)明：外源草酸處理可以抑制PAL、4-CL、CAD和POD基因的表達(dá)。

圖3 低溫下草酸對(duì)綠竹筍PAL、4-CL、CAD和POD活性的影響Figure 3 Effects of oxalic acid treatment on PAL, 4-CL, CAD and POD activities of bamboo shoots at low temperature

圖4 低溫下草酸對(duì)綠竹筍PAL、4-CL、CAD和POD基因相對(duì)表達(dá)量的影響Figure 4 Effects of oxalic acid treatment on PAL, 4-CL, CAD and POD relative expression of bamboo shoots at low temperature

3 討論與結(jié)論

本研究表明：外源草酸處理可以提高綠竹筍體內(nèi)抗氧化酶SOD、CAT的活性并延緩H2O2質(zhì)量摩爾濃度的積累；可以延緩木質(zhì)素的積累和硬度的上升；既可以抑制綠竹筍木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶PAL、4-CL、CAD、POD活性的上升，又可以抑制PAL、4-CL、CAD和POD基因的表達(dá)；可以減緩綠竹筍的木質(zhì)化進(jìn)程，延緩綠竹筍品質(zhì)的下降，延長(zhǎng)綠竹筍的保鮮期。

植物在受到外界逆境脅迫時(shí)會(huì)產(chǎn)生活性氧(ROS)，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂過(guò)氧化，破壞生物膜的結(jié)構(gòu)和功能，嚴(yán)重則會(huì)致使細(xì)胞程序性死亡。為了抵御ROS的傷害，植物體會(huì)激活體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)，提高抗氧化酶的活性，以消除ROS[14-17]。本研究結(jié)果顯示：在低溫儲(chǔ)藏下，草酸處理組的去殼綠竹筍筍肉組織中的H2O2質(zhì)量摩爾濃度顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，較低的H2O2質(zhì)量摩爾濃度有助于減輕ROS對(duì)筍肉細(xì)胞的毒害。草酸處理組的去殼綠竹筍筍肉組織中的SOD和CAT活性顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。梁春強(qiáng)等[18]研究認(rèn)為：適合濃度的草酸處理不但可以顯著提高氧化酶SOD和CAT的活性，還可以有效降低O2-的生成速率和H2O2的含量。

木質(zhì)素為植物次生代謝的產(chǎn)物，屬酚類化合物，是構(gòu)成細(xì)胞壁次生結(jié)構(gòu)的主要成分。竹筍在采后非常容易老化變質(zhì)，失去食用價(jià)值，其中一個(gè)重要的因素就是木質(zhì)化。木質(zhì)化主要表現(xiàn)為筍體組織硬度上升，木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，筍體發(fā)生褐變等[19-21]。除了竹筍，茭白Zizania latifolia、蘆筍Asparagus officinalis等蔬菜在采后儲(chǔ)藏過(guò)程中均有木質(zhì)化的發(fā)生[22-25]。本研究發(fā)現(xiàn)：低溫條件下儲(chǔ)藏，草酸處理不但可以抑制綠竹筍硬度的上升，還能夠減緩木質(zhì)素的生物合成，抑制采后去殼竹筍的木質(zhì)化，維持較好的口感品質(zhì)，延長(zhǎng)竹筍可食用期限。與王琪等[26]研究的采用外源草酸抑制帶殼雷竹Phyllostachys praecox筍木質(zhì)素的合成累積以及硬度的上升的結(jié)論相似。

PAL、4-CL、CAD和POD等4種酶與木質(zhì)素的合成有密切的關(guān)系，其活性的升高都能促進(jìn)木質(zhì)素的合成，提高組織的木質(zhì)化程度。本研究結(jié)果表明：低溫條件下，經(jīng)草酸處理的綠竹筍的PAL、4-CL、CAD和POD的活性均低于對(duì)照組，草酸處理在總體上明顯抑制了去殼綠竹筍的木質(zhì)素生物合成關(guān)鍵酶的活性。這與沈玫等[27]研究的利用外源草酸抑制帶殼綠竹筍PAL和POD活性的結(jié)論類似。

果蔬的木質(zhì)化進(jìn)程受編碼木質(zhì)素代謝的關(guān)鍵酶基因的表達(dá)調(diào)控。LU等[28]研究發(fā)現(xiàn)：PpCAD1和PpCAD2這2個(gè)基因主要調(diào)控梨Pyrus pyrifolia的木質(zhì)素代謝生物合成。不同種類的果蔬，調(diào)控木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶的基因也不同，SHAN等[29]研究表明，調(diào)控枇杷Eriobotrya japonica的木質(zhì)素代謝基因主要是EjCAD1、EjPOD、EjPAL2這3個(gè)基因。此外，大多數(shù)研究人員認(rèn)為是PAL、4-CL、CAD和POD的活性與其對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)在協(xié)同調(diào)控木質(zhì)素的合成[30-31]。本研究結(jié)果表明：草酸處理在冷藏的中后期能夠顯著抑制去殼綠竹筍的木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶PAL、CAD和4-CL的基因表達(dá)水平，可以抑制POD的基因表達(dá)水平。結(jié)合硬度、木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及對(duì)應(yīng)酶的活性的變化趨勢(shì)分析可見(jiàn)，PAL、4-CL、CAD基因表達(dá)與硬度、木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及酶活性的變化趨勢(shì)相一致，POD基因表達(dá)與硬度、木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及酶活性的變化趨勢(shì)相反，說(shuō)明綠竹筍木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶的基因表達(dá)和活性變化同步調(diào)控木質(zhì)素的生物合成。LU等[28]研究發(fā)現(xiàn)：利用氯化鈣可以抑制梨果肉中PpCAD1和PpCAD2基因表達(dá)，從而調(diào)控木質(zhì)素的生物合成途徑，最終達(dá)到抑制梨的硬化的效果，這與本研究結(jié)果類似。另外，SEWALT等[32]研究發(fā)現(xiàn)，煙草Nicotiana tabacum的PAL基因在受到抑制之后，不但木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯下降，PAL的活性也明顯降低。本研究中草酸處理既抑制了木質(zhì)素代謝關(guān)鍵酶活性，又抑制了對(duì)應(yīng)基因表達(dá)水平，從2個(gè)方面抑制了去殼綠竹筍筍肉硬度的上升和木質(zhì)素的累積，延緩了冷藏過(guò)程中竹筍食用品質(zhì)的下降。