IL-23與TGF-β在子宮內(nèi)膜癌患者癌組織及外周血中的表達(dá)及其意義

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，山東 青島 266003)

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道三大惡性腫瘤之一，是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的上皮性惡性腫瘤，以腺癌為主，近年來(lái)其發(fā)病率及死亡率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，且發(fā)病人群逐漸趨于年輕化[1]。研究表明在腫瘤的形成及進(jìn)展的過(guò)程中除了相關(guān)原癌基因的活化和抑癌基因的失活外，炎癥刺激與逃避免疫監(jiān)視等也是重要致病因素[2-3]，因此免疫細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子在腫瘤形成中的作用以及是否可作為腫瘤免疫治療靶點(diǎn)的研究越來(lái)越受重視[4-5]，其中CD4+T淋巴細(xì)胞中的兩個(gè)重要的細(xì)胞亞群Th-17細(xì)胞與Treg細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-23(IL-23)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中越來(lái)越受到關(guān)注，是目前惡性腫瘤發(fā)生機(jī)制中免疫因素的研究熱點(diǎn)[6]。IL-23有促進(jìn)腫瘤發(fā)生以及發(fā)展的作用[7]，能夠使基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)活性上調(diào)，刺激癌細(xì)胞獲得侵襲性，促進(jìn)腫瘤血管生成，為癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移提供血液及營(yíng)養(yǎng)[8]。TGF-β具有免疫抑制作用，可使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫，抑制免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)[9]。本研究通過(guò)檢測(cè)IL-23與TGF-β在子宮內(nèi)膜癌患者外周血及癌組織中的表達(dá)情況，并分析兩者與子宮內(nèi)膜癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，為子宮內(nèi)膜癌惡性生物學(xué)行為的綜合評(píng)估和患者的臨床免疫治療方案的選擇提供參考及理論依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年10月—2019年3月于青島大學(xué)附屬醫(yī)院婦科住院經(jīng)手術(shù)治療的子宮內(nèi)膜癌患者(內(nèi)膜癌組)60例，同時(shí)選取同期因子宮肌瘤行全子宮切除的患者(對(duì)照組)30例。內(nèi)膜癌組所有患者術(shù)前均未接受放化療及內(nèi)分泌治療，且無(wú)其他腫瘤病史，患者年齡38～87歲，平均年齡為57.5歲，手術(shù)方式為腹腔鏡或開(kāi)腹筋膜外或廣泛全子宮切除+雙附件切除+盆腔淋巴結(jié)清掃和(或)腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)清掃術(shù)，手術(shù)-病理分期參照2009年國(guó)際婦產(chǎn)聯(lián)盟(FIGO)分期標(biāo)準(zhǔn)，其中Ⅰ期33例，Ⅱ期19例，Ⅲ期8例；組織分化情況：高分化(G1)22例，中分化(G2)27例，低分化(G3)11例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者5例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者55例；肌層浸潤(rùn)深度<1/2者47例，肌層浸潤(rùn)深度≥1/2者13例。對(duì)照組所有患者均無(wú)其他疾病史、特殊治療史以及腫瘤疾病史，年齡45～69歲，平均年齡55.9歲。

1.2 儀器和試劑

ELISA試劑盒購(gòu)于江蘇晶美生物科技有限公司，酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)伯樂(lè)公司,兔抗人EBNA-1單克隆抗體購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，二抗PV-6001及DAB顯色試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)患者外周血中IL-23與TGF-β的表達(dá)情況 兩組患者均于手術(shù)前1 d空腹采集外周靜脈血4 mL，離心以后上清液置于EP管內(nèi)-80 ℃冷凍保存?zhèn)溆?。并?yán)格按照ELISA操作說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)兩組患者外周血中的IL-23與TGF-β表達(dá)水平。

1.3.2免疫組織化學(xué)法檢測(cè)患者組織中IL-23與TGF-β的表達(dá)情況 術(shù)中分別留取內(nèi)膜癌組患者的癌組織及對(duì)照組的子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本，所有標(biāo)本均經(jīng)病理組織學(xué)鑒定為癌組織或正常組織，于手術(shù)當(dāng)天術(shù)后半小時(shí)內(nèi)固定于濃度為4%的甲醛溶液中，石蠟包埋切片。免疫組化染色嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，分別檢測(cè)兩組患者組織中IL-23以及TGF-β的表達(dá)情況，結(jié)果均由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師采用雙盲法在光鏡下進(jìn)行觀(guān)察判定。每張切片在200倍高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為細(xì)胞染色陽(yáng)性。對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)以及染色強(qiáng)度綜合判斷，0～4分為陰性，5～12分為陽(yáng)性[10]。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者外周血中IL-23與TGF-β的表達(dá)水平比較

研究結(jié)果顯示，內(nèi)膜癌組及對(duì)照組患者外周血中IL-23的表達(dá)水平分別為(308.704±122.702)、(179.811±47.868)ng/L，同時(shí)TGF-β的表達(dá)水平分別為(2 750.838±721.447)、(1 676.027±678.759)ng/L，兩組比較差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-7.124、-6.792，P<0.05)。

2.2 內(nèi)膜癌患者外周血中IL-23與TGF-β的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

內(nèi)膜癌患者外周血中IL-23與TGF-β的表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌的手術(shù)-病理分期、肌層浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均具有相關(guān)性(F=10.808、29.737，t=-2.554～-2.491，P<0.05)；IL-23的表達(dá)水平與組織分化程度無(wú)關(guān)(P>0.05)，TGF-β表達(dá)水平與組織分化程度有關(guān)(F=4.294，P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 兩組患者組織中IL-23與TGF-β的表達(dá)情況

IL-23與TGF-β主要表達(dá)于細(xì)胞胞漿中，免疫組化染色呈棕黃色或者棕褐色顆粒(圖1)。內(nèi)膜癌組以及對(duì)照組患者組織中IL-23的陽(yáng)性表達(dá)率分別為78.33%和26.67%，TGF-β的陽(yáng)性表達(dá)率分別為81.67%和23.33%，兩組比較差異具有顯著性(χ2=4.444、5.378，P<0.05)。

2.4 內(nèi)膜癌組患者外周血中IL-23與TGF-β表達(dá)的相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌患者外周血中IL-23與TGF-β的表達(dá)水平呈正相關(guān)性(r=0.39，P<0.05)。

3 討 論

研究顯示，惡性腫瘤患者的免疫系統(tǒng)處于免疫耐受或者免疫缺陷狀態(tài)，在惡性腫瘤患者機(jī)體以及腫瘤微環(huán)境中，存在多種免疫細(xì)胞以及細(xì)胞因子的聚集[11-12]，其中CD4+T淋巴細(xì)胞中兩個(gè)重要的細(xì)胞亞群Th-17細(xì)胞與Treg細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子IL-23、TGF-β在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，是目前惡性腫瘤發(fā)生機(jī)制中免疫因素研究的熱點(diǎn)之一[13]。Th-17細(xì)胞/Treg細(xì)胞失衡及其相關(guān)細(xì)胞因子IL-23、TGF-β表達(dá)的增加，參與了惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，其中IL-23與TGF-β在惡性腫瘤的形成與進(jìn)展中扮演十分重要的角色[14-15]。

IL-23是IL-12細(xì)胞因子超家族中的一員，在人體內(nèi)廣泛存在，IL-23在與腫瘤相關(guān)的炎癥中具有重要作用。諸多研究表明，結(jié)腸癌、乳腺癌、胃癌、口腔癌、肺癌等惡性腫瘤患者的機(jī)體內(nèi)存在IL-23的高表達(dá)，IL-23能夠促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞外基質(zhì)降解，增強(qiáng)癌細(xì)胞極性，并通過(guò)特異性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路直接參與腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移[16-17]。劉永浩等[18]針對(duì)小鼠肝癌模型研究發(fā)現(xiàn)，IL-23可以直接促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌的增殖和遷移，同時(shí)其還可以通過(guò)影響卵巢癌干細(xì)胞的自我更新和多向分化的能力，最終促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展[19]。本研究中IL-23在內(nèi)膜癌組患者外周血中的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，同時(shí)在內(nèi)膜癌組患者的癌組織中IL-23的陽(yáng)性表達(dá)率也明顯高于對(duì)照組，提示IL-23在子宮內(nèi)膜癌患者的機(jī)體內(nèi)及腫瘤微環(huán)境中存在高表達(dá)，其可能參與了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病過(guò)程。既往研究也表明，在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中IL-23有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及遷移的作用[20-21]。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)膜癌組患者外周血中IL-23的表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌的手術(shù)-病理分期、肌層浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在正相關(guān)性，表明IL-23可能在子宮內(nèi)膜癌的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移中起促進(jìn)作用，并有望成為子宮內(nèi)膜癌臨床檢測(cè)指標(biāo)。但本研究還發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜癌組患者外周血中IL-23的表達(dá)水平與內(nèi)膜癌的組織分化無(wú)相關(guān)性，可能與本研究的樣本量小有關(guān)。但也有報(bào)道顯示，在總體人群中IL-23及IL-23R的表達(dá)與癌癥風(fēng)險(xiǎn)并無(wú)顯著相關(guān)性[22]，因此IL-23在子宮內(nèi)膜癌中的具體作用機(jī)制及臨床意義仍需要進(jìn)一步的研究及證實(shí)。

表1 內(nèi)膜癌患者外周血中IL-23、TGF-β的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

A、C分別為內(nèi)膜癌組患者IL-23與TGF-β表達(dá)情況；B、D分別為對(duì)照組患者IL-23與TGF-β表達(dá)情況；免疫組織化學(xué)法，40倍

圖1 兩組患者組織中IL-23與TGF-β的表達(dá)情況

TGF-β具有多重生理功能，廣泛存在于人體組織及細(xì)胞內(nèi)，TGF-β是人體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞因子，在控制細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡中扮演重要角色[23]。TGF-β在腫瘤的惡性生物學(xué)行為中的作用十分復(fù)雜，在腫瘤發(fā)展的早期TGF-β主要發(fā)揮抑制性生物學(xué)效應(yīng)，而在腫瘤的進(jìn)展期及晚期主要發(fā)揮促進(jìn)作用，主要表現(xiàn)為促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、突變，抑制機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)，促使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，從而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[24-26]。本研究中TGF-β在內(nèi)膜癌組患者外周血中的表達(dá)水平及癌組織中的陽(yáng)性率均顯著高于對(duì)照組，同時(shí)內(nèi)膜癌組患者外周血中TGF-β的表達(dá)水平與手術(shù)-病理分期、組織分化程度、肌層浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)，與已有的研究結(jié)果一致[27-28]，提示TGF-β有可能參與了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生及發(fā)展，有望成為監(jiān)測(cè)子宮內(nèi)膜癌病情及評(píng)價(jià)惡性程度的重要指標(biāo)之一。

以往研究發(fā)現(xiàn)在胰腺癌的腫瘤微環(huán)境中同時(shí)存在IL-23與TGF-β的高表達(dá)，且胰腺癌的短期生存者中IL-23的表達(dá)與TGF-β的表達(dá)呈線(xiàn)性相關(guān)性，在預(yù)處理掉IL-23或者預(yù)處理掉TGF-β的模型中，腫瘤體積和轉(zhuǎn)移情況的改善并沒(méi)有特別明顯，而在同時(shí)敲除IL-23和TGF-β的模型中，腫瘤體積明顯縮小，肝轉(zhuǎn)移(胰腺癌最易轉(zhuǎn)移部位)得到抑制[29]，表明IL-23與TGF-β在惡性腫瘤的進(jìn)展中存在某種相互協(xié)同的機(jī)制。本研究也顯示內(nèi)膜癌組患者外周血中IL-23與TGF-β的表達(dá)呈正相關(guān)性，因此推測(cè)IL-23與TGF-β可能存在某種相互促進(jìn)的機(jī)制，從而共同參與了子宮內(nèi)膜癌的惡變過(guò)程，但是關(guān)于IL-23與TGF-β在惡性腫瘤中的研究相對(duì)較少，分子機(jī)制仍不清楚，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，子宮內(nèi)膜癌患者機(jī)體及癌組織中存在IL-23與TGF-β的高表達(dá)，兩者可能參與了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的過(guò)程，有望成為評(píng)估子宮內(nèi)膜癌惡性及進(jìn)展程度的指標(biāo)，并有助于為子宮內(nèi)膜癌的臨床免疫治療提供重要的參考價(jià)值。