基于線粒體COⅠ的南海北部長棘銀鱸遺傳多樣性分析

裴麗梅，宮亞運，黃柏炎，章 群，徐 示，王業(yè)磷

（暨南大學(xué)生態(tài)學(xué)系，廣州 510632）

長棘銀鱸（Gerres filamentosus）隸屬于鱸形目（Perciformes）銀鱸科（Gerreidae）銀鱸屬，廣泛分布于世界熱帶和亞熱帶海域和部分河口區(qū)［1-2］，一般生活在淺海沿岸50 m以深的沙質(zhì)底部，以生活在沙子和泥漿底部的小型生物為食［3-4］。長棘銀鱸為小型優(yōu)質(zhì)魚類 ，我國見于南海和東海南部水域，歷史上北部灣曾盛產(chǎn)，但近年來由于過度捕撈，野生資源已經(jīng)嚴(yán)重衰竭，資源密度由1961—1962年的 78.4 kg·km-2下降至 1992—1993年以后的 0.1 kg·km-2［5］。隨著長棘銀鱸等魚類資源的衰竭，北部灣海洋生態(tài)系統(tǒng)發(fā)生了明顯變化，如游泳動物和底棲生物食性魚類種類數(shù)日益減少，而浮游生物食性魚類種類數(shù)及其漁獲比例明顯增加［6］。雖然自1999年以來實行的休漁制度對北部灣部分魚類資源恢復(fù)有明顯效果，但是對衰竭型種類效果甚微［5］，長棘銀鱸種質(zhì)資源保護、恢復(fù)迫在眉睫。

了解種群的遺傳變異是評估資源現(xiàn)狀、制定野生群體保護與恢復(fù)策略和實施養(yǎng)殖群體種質(zhì)遺傳改良的重要前提［7］。目前國內(nèi)外對于長棘銀鱸的研究大多集中在形態(tài)比較、物種分類、生長發(fā)育和線粒體全基因測序等方面［7-13］，尚未有長棘銀鱸種群遺傳相關(guān)的研究報道。線粒體DNA（mtDNA）具有進(jìn)化速度快、母系遺傳、幾乎不發(fā)生重組等特點［14-15］，已被用作脊椎動物的系統(tǒng)發(fā)育和群體遺傳分析的有效工具［16-17］。其中細(xì)胞色素氧化酶Ⅰ（cytochrome oxidase subunitⅠ，COⅠ）序列進(jìn)化速率適中，是開展動物DNA條形碼研究首選分子標(biāo)記［18］，用于種群遺傳學(xué)研究時，也可在一定程度上避免因線粒體控制區(qū)易變異飽和、有時不能有效檢測到種群結(jié)構(gòu)以及學(xué)術(shù)上對線粒體控制區(qū)序列插入和缺失狀況處理的共識不足［19-20］。近年來國內(nèi)外有不少使用COⅠ基因研究魚類遺傳變異的報道，如日本鯖（Scomber japonicus）［21］、 銀 鯧 （Pampus argenteus）［22］和烏賊（Sepia officinalis）［23］等。本研究采用線粒體COⅠ基因序列對南海北部7個長棘銀鱸群體進(jìn)行分析，旨在揭示中國長棘銀鱸主要分布區(qū)的遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)，為種質(zhì)資源保護和開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

2014年7月至2019年10月間采自廣東碣石（JS）34尾、廣東陽江（YJ）34尾、海南瓊海（QH）14尾、海南陵水（LS）24尾、海南東方（DF）20尾、海南新盈（XY）26尾、廣西東興（DX）24尾共7個地點的176尾長棘銀鱸（表1），用95%的酒精處理并保存。所有樣品均為從近海作業(yè)的小型漁船上購買的野生魚類。

1.2 基因組DNA的提取與PCR擴增

DNA提取和PCR擴增條件參照樂小亮等［24］方法，PCR擴增引物參見WARD等［25］，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測合格的PCR擴增產(chǎn)物送華大基因公司測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將測序后得到的序列在 Bioedit 7.0.9.0［26］軟件上進(jìn)行人工校對和多重比較。運用MEGA 7.0［27］軟件計算核苷酸組成、堿基變異情況、轉(zhuǎn)換和顛換值。通過 DnaSP 6.12.03［28］軟件計算單倍型數(shù)、單倍型多樣性（haplotype diversity，Hd）、核苷酸多樣性（nucleotide diversity，π）。使用Network 5.0［29］構(gòu) 建 單 倍 型 網(wǎng) 絡(luò) 圖。通 過Arlequin 3.5.2.2［30］軟件計算遺傳分化系數(shù)（Fst）和群體間基因流值（Nm）；進(jìn)行AMOVA分子方差分析遺傳變異的分布情況，并以1 000次置換分析統(tǒng)計學(xué)顯著性；計算Tajima’sD和Fu’sFs值并進(jìn)行中性檢驗，得到SSD值、Rg值、τ值參數(shù)。根據(jù)公式T＝（τ／2μk）×代時［31］計算種群擴張時間。其中，τ是種群擴張時間參數(shù)；μ是序列的變異速率 ［采用 1% ～3%／MY［32］（million year，MY）］；k是序列長度；T是種群擴張時間。

2 結(jié)果與分析

2.1 COⅠ基因片段序列特征及遺傳多樣性

在長棘銀鱸COⅠ基因5′端652 bp序列中，T、C、A和 G含量分別為 29.0%、28.7%、23.3%和19.1%。A+T的含量（52.3%）略高于C+G的含量（47.8%），與大多數(shù)硬骨魚類相似［33］。共發(fā)現(xiàn)單倍型25個，變異位點155個，其中簡約信息位點87個。轉(zhuǎn)換和顛換比為2.41，表明序列未達(dá)到飽和，適合進(jìn)行種群遺傳發(fā)育分析［34］。7個群體整體呈現(xiàn)較高的單倍型多樣性（Hd＝0.767±0.018）與較低的核苷酸多樣性（π＝0.0550±0.003 7）。其中遺傳多樣性指數(shù)最高的是碣石群體（Hd＝0.606±0.092，π＝0.059 2±0.006 6），其次為陽江群體（Hd＝0.323±0.102，π＝0.027 0±0.010 7）；瓊海群體遺傳多樣性指數(shù)最低（Hd＝0.560±0.125，π＝0.001 0±0.000 3），陵水群體次低（Hd＝0.685±0.077，π＝0.0015±0.000 3）。

2.2 長棘銀鱸遺傳分化

176條COⅠ序列中共檢測到25個單倍型，單倍型頻率最高的為 Hap1（60條），其次是Hap15（50條）。共享單倍型4個，其中 Hap1、Hap2和Hap3為所有群體共享；Hap15為碣石、陽江、新盈3個群體共享；其它單倍型為各群體特有。

用 Arlequin 3.5.2.2軟件以 Kimura雙參數(shù)模型構(gòu)建的單倍型網(wǎng)絡(luò)中呈現(xiàn)非典型的星狀結(jié)構(gòu)，沒有較為明顯的地理聚群和譜系結(jié)構(gòu)（圖1）。7個群體間的遺傳分化情況（Fst＝-0.025 5～0.851 4，Nm＝-68.993～56.971）詳見表 2。其中，碣石和陽江群體分別與瓊海、陵水、東方、新盈、東興5個群體間出現(xiàn)極顯著性遺傳分化（Fst＞0.25，P＜0.001）［35］，且碣石和陽江群體分別與瓊海、陵水、東方、新盈、東興5個群體之間基因交流匱乏（0＜Nm＜1）［36-37］。碣石和陽江群體間雖然為隨機交配（Nm＞4），但也出現(xiàn)了低等程度分化（0.05＜Fst＝0.111 1＜0.15，P＜0.05），其余組別之間無明顯分化。

將7個群體通過4種不同方式進(jìn)行AMOVA分析：①7個地理群體；②大陸群組：碣石、陽江、東興；海島群組：瓊海、陵水、東方、新盈；③碣石和陽江為一組；瓊海、陵水、東方、新盈、東興為另一組；④碣石群體；陽江群體；其他群體（瓊海、陵水、東方、新盈）。AMOVA分析（表3）表明4種分組方式的主要變異來源均發(fā)生在群體內(nèi)，變異比例分別為 74.13%、68.87%、61.69% 和64.76%，同時4種分組方法下4種群組間存在顯著性分化（Fst＞0.25，P＜0.001），原因可能與長棘銀鱸只進(jìn)行短距離洄游有關(guān)［5］。

表1 南海長棘銀鱸群體的遺傳多樣性Tab.1 Genetic diversity of G.filamentosus in coastal waters of the South China Sea

圖1 長棘銀鱸單倍型網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Parsimony network of G.filamentosus hap lotypes

2.3 長棘銀鱸種群歷史動態(tài)

中性檢驗結(jié)果見表4。除陵水 Tajima’sD（-1.518 6，0.001＜P＜0.05）和 Fu’sFs（-3.293 6，P＜0.05）、東 方 Tajima’sD（-2.590 6，P＜0.001）、新 盈 Tajima’sD（-2.650 4，P＜0.001）為顯著性負(fù)值外，其余群體Tajima’sD和Fu’sFs均為不顯著性負(fù)值或正值。結(jié)合陵水、東方、新盈群體SSD值及Rg值數(shù)值均較小且不具有統(tǒng)計顯著性，表明上述觀測值符合擴張模型。因Fu’sFs檢驗比Tajima’sD對近期擴張更敏感［38］，再結(jié)合上述3個群體的核苷酸錯配圖（圖2-a～c）為明顯單峰以及單倍型網(wǎng)絡(luò)圖為非典型星型結(jié)構(gòu)，可認(rèn)為陵水群體經(jīng)歷了近期的快速擴張，而東方和新盈群體經(jīng)歷過較為早期的擴張［39-40］。7個群體整體的 Tajima’sD＝-0.765 9（P＞0.1）、Fu’sFs＝6.849 1（P＞0.5），整體上未呈現(xiàn)擴張現(xiàn)象，結(jié)合核苷酸錯配圖（圖2-d）呈現(xiàn)明顯多峰，說明可能是種群經(jīng)歷多次擴張疊加的結(jié)果［40］。陵水、東方、新盈3個群體擴張參數(shù) τ分別為 1.068 4、0.949 2和1.175 8，以線粒體COⅠ基因進(jìn)化速率為（1%～3%）／百萬年［32］，性成熟期 3年，估算出陵水、東方、新盈3個群體擴張大約分別發(fā)生在0.245 8～0.081 9、0.218 4～0.072 8、0.270 5～0.090 2百萬年之前，均處于晚更新世時期。

表2 長棘銀鱸7群體的F st及N m值Tab.2 F st and N m among 7 G.filamentosus populations

表3 長棘銀鱸種群結(jié)構(gòu)分子方差分析Tab.3 AMOVA analysis of G.filamentosus

表4 長棘銀鱸中性檢驗和不對稱分析Tab.4 Neutrality tests and m ismatch analysis of G.filamentosus

圖2 長棘銀鱸核苷酸不對稱分布Fig.2 Nucleotidem ismatch distribution of G.filamentosus

3 討論

3.1 長棘銀鱸的遺傳多樣性與種群歷史動態(tài)

種群遺傳多樣性的高低很大程度上與物種的適應(yīng)能力、分化能力以及對環(huán)境影響的耐受力相關(guān)［41］，而單倍型多樣性（Hd）和核酸多樣性（π）是衡量某一物種遺傳多樣性的2個重要指標(biāo)［42］。長棘銀鱸COⅠ序列的遺傳多樣性（Hd＝0.767±0.018，π＝0.055 0±0.003 7）呈現(xiàn)的高Hd值低π值的特點，與同海域基于COⅠ序列的銀鯧 （Pampus argenteus）［22］和 湖 棲 蝦 虎 魚（Gobiopterus lacustris）［43］等相似。南海北部［碣石（0.059 2±0.006 6）和陽江（0.027 0±0.010 7）］的遺傳多樣性明顯高于南海南部［瓊海（0.001 0±0.000 3）和陵水（0.001 5±0.000 3）］，推測可能與碣石和陽江所處的海域有關(guān)。在冰期大陸架露出時，南海變成邊緣海，陽江和碣石群體瀕臨該邊緣海，種群相對穩(wěn)定，受瓶頸效果影響?。涣硪环矫?，碣石與陽江所處海域會同時受到南海暖流、黑潮及沿岸流的影響，使得碣石與陽江群體具有更強的分化能力和環(huán)境耐受力。而瓊海、陵水、東方、新盈的潮汐汊道港灣特征使內(nèi)灣水域處于比較穩(wěn)定的半封閉海洋環(huán)境［43］；東興則位于半封閉的北部灣，海洋環(huán)境也相對穩(wěn)定，遺傳多樣性偏低。此外，冰期時海南島及北部灣所在的大陸架露出，間冰期時海平面上升［44-45］，海南島和北部灣的長棘銀鱸群體發(fā)生擴張，也致使瓊海、陵水、東方、新盈和東興群體遺傳多樣性偏低。

Fst值顯示陽江和碣石群體分別與瓊海、陵水、東方、新盈、東興5個群體間發(fā)生極顯著性遺傳分化（Fst＞0.25，P＜0.001），且 AMOVA分析結(jié)果顯示長棘銀鱸4種劃分方式的群組間都有顯著性分化。長棘銀鱸在河口生活，繁殖期遷移至沿海地區(qū)達(dá)到成熟的最后階段，然后進(jìn)行產(chǎn)卵，不進(jìn)行遠(yuǎn)距離洄游［3］。瓊州海峽是在全新世中期全球性海侵淹沒峽區(qū)原來的常態(tài)低地而形成，主要形成時段為（10 570±560）～（7 125±96）aBP［46-47］。瓊州海峽形成前，黑潮從巴士海峽進(jìn)入南海，同沿岸流一樣在沿廣東海岸流向西南過程中受阻，導(dǎo)致碣石和陽江群體與海南各群體及東興群體間發(fā)生遺傳分化；瓊州海峽形成后，黑潮從巴士海峽進(jìn)入南海，同沿岸流一樣在沿廣東海岸流向西南過程中受瓊州海峽和南海大陸架特殊地況的影響，也在一定程度上阻礙了碣石和陽江群體的遠(yuǎn)距離傳播，導(dǎo)致碣石和陽江群體與海南各群體及東興群體間有明顯的遺傳分化。

大部分中國近海魚類在近期歷史上因冰期海平面變化而出現(xiàn)種群快速擴張［45］。長棘銀鱸Tajima’sD和Fu’sFs中性檢驗和核苷酸不對稱分析圖呈現(xiàn)單峰，顯示陵水、東方和新盈群體都經(jīng)歷過種群擴張，推算擴張時間均處于晚更新世時期。海南島為南海大陸架島嶼，在晚更新世構(gòu)造運動頻繁，火山活動活躍，使不少海灣底部抬升為階地；全新世氣候變暖，海平面上升，海水侵入河口、海灣、洼地等，使長棘銀鱸群體隨著海侵發(fā)生擴張［44］。

3.2 長棘銀鱸種質(zhì)資源保護

長棘銀鱸生活在淺海沿岸水域，是包括珊瑚礁、紅樹林等生境生態(tài)系統(tǒng)的重要組分［2-3］。近年來捕撈技術(shù)的發(fā)展與革新使得長棘銀鱸資源快速衰退［5-6］，長棘銀鱸野生資源的保護迫在眉睫。碣石和陽江群體分別與瓊海、陵水、東方、新盈群體間有極顯著性分化，可以將碣石和陽江以及其他群體作為2個獨立的管理保護單位。其中碣石群體遺傳多樣性最高（Hd＝0.606±0.092，π＝0.059 2±0.006 6），應(yīng)作為長棘銀鱸種質(zhì)資源保護和開發(fā)利用的核心群體和優(yōu)先對象；瓊海（Hd＝0.560±0.125，π＝0.001 0±0.000 3）和陵水（Hd＝0.685±0.077，π＝0.001 5±0.000 3）群體遺傳多樣性較低，更容易受到環(huán)境變化的影響，建議及時采取措施，避免捕撈過度使其遺傳多樣性難以恢復(fù)，重蹈大黃魚、帶魚等種質(zhì)資源衰退的覆轍。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，特別是高通量測序技術(shù)的進(jìn)步和測序成本的下降，種群遺傳學(xué)研究開始進(jìn)入基因組時代。線粒體DNA有效群體大小不僅為雙親遺傳核基因組的1／4，可提供核基因組不能提供的母系遺傳信息，開展種群遺傳研究的成本遠(yuǎn)低于種群全基因組分析，仍是種群遺傳的首選分子標(biāo)記［48］?；诰€粒體COⅠ的長棘銀鱸種群遺傳研究發(fā)現(xiàn)，南海北部瓊州海峽兩側(cè)的群體間存在極顯著的遺傳分化，可作為2個不同的管理保護單位；廣東沿海群體的遺傳多樣性明顯高于海南和廣西群體，其中碣石群體遺傳多樣性最高，可優(yōu)先保護。研究結(jié)果為長棘銀鱸種群的保護和開發(fā)利用措施的制訂與實施提供了科學(xué)依據(jù)。但受采樣范圍的限制，研究結(jié)果不能排除未采樣地區(qū)存在種群分化的可能，今后需要進(jìn)行物種全分布區(qū)的采樣調(diào)查。另外，相對于其他線粒體基因，COⅠ基因的進(jìn)化速度較慢，較適合發(fā)現(xiàn)歷史相對久遠(yuǎn)的種群擴張，對近期的種群擴張不太敏感，在后續(xù)有關(guān)長棘銀鱸種群遺傳的研究中，可考慮使用高多態(tài)性的微衛(wèi)星指紋圖譜分析技術(shù)以及基于二代測序的簡化基因組乃至全基因組分析技術(shù)，以揭示雙親遺傳的核基因遺傳信息，反映更為近期的全球氣候變化與人類活動的影響，從而制訂更為精準(zhǔn)的保護與開發(fā)利用策略。