馬 超 宋 鵬 尚申申 楊夏夏 楊金華 韓群威 李記民 馮雅嵐

(河南科技大學農學院/河南省旱地農業(yè)工程技術研究中心，河南 洛陽 471023)

生長調控因子(growth-regulating factors， GRFs)是植物特有的轉錄因子家族，其在植物生長發(fā)育過程中起著重要的調節(jié)作用[1]，如參與葉片細胞大小[2]和數量的調控[3]、分生組織的生長和維持[4]、花的發(fā)育[5]和花期調控[6]、種子[7]和根的發(fā)育[8]、植物壽命[4]以及對逆境脅迫的響應[9-10]等。 隨著基因組測序技術的發(fā)展，多種植物的GRFs基因家族已被鑒定，包括玉米、油菜、梨等[11]。 研究表明，GRFs基因家族含有2個保守的結構域:復雜芳香疏水性氨基酸QLQ(谷氨酸、亮氨酸、谷氨酸)結構域和WRC(色氨酸、精氨酸、半胱氨酸)結構域[11]。 前者是重要的蛋白互作區(qū)域，如擬南芥該保守區(qū)域可與GIF(GRF-interacting factor)蛋白發(fā)生互作從而行使轉錄激活作用[12]；后者含有的C3H 鋅指結構，能夠引導GRF 蛋白入核并結合其靶基因[13]。 QLQ 和WRC 結構域都位于GRF 蛋白序列的N 端，前者在所有真核生物中都有存在，而后者是植物特有的，一些物種個別GRF 蛋白成員可能缺少QLQ或WRC 結構域[13]。

二穗短柄草(Brachypodium distachyon)是原產于非洲北部、歐洲南部和亞洲中部的一種適應冷涼氣候的一年生禾本科植物[14]。 二穗短柄草與普通小麥、大麥、燕麥等麥類作物同屬于早熟禾亞科，其形態(tài)、生理特征及基因組等特點都十分相似；另外，由于二穗短柄草具有株型較小，可實現在溫室內大量的種植，生命周期較短，嚴格的自花授粉，易于遺傳轉化等特點，使其具有與擬南芥相似的模式植物特點[15-16]。 二穗短柄草自交系Bd-21 的基因組測序已于2010 年完成，二穗短柄草基因組小、染色體少，且DNA 重復序列少，也佐證了其具有作為模式植物的基本特性[17]。 水稻作為單子葉植物的典型模式植物，其相關研究取得了迅猛發(fā)展，但是水稻的原始生境處于熱帶、亞熱帶。 對于像小麥、大麥等生活在冷涼氣候、需要春化過程的麥類作物來說，水稻并不是理想的模式植物，而二穗短柄草在親緣關系上與小麥、大麥、燕麥等糧食作物更近；同時，水稻植株較大且生育期較長[18-19]。 基于以上特點，Draper 等[20]首次建議將二穗短柄草作為禾本科植物功能基因組學研究的模式植物。

本研究利用NCBI 數據庫首次對二穗短柄草12個GRFs基因家族成員的系統(tǒng)進化關系和基因結構進行分析，通過RT-qPCR 的方法對GRFs基因家族成員的表達模式進行研究，旨在為進一步了解二穗短柄草中GRFs家族成員基因功能提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以二穗短柄草Bd-21 為試驗材料，在濕潤的濾紙上催芽1 d 后轉入4℃冰箱春化8 d，然后種植于營養(yǎng)缽內。 在灌漿期分別取根、莖、老葉、新葉、幼穗、籽粒6 個不同組織用于基因表達定量分析。 于五葉期進行外源激素處理，分別施用生長素(auxin，IAA) 10 μmol·L-1， 脫落酸(abscisic acid，ABA)50 μmol·L-1、赤霉素(gibberellin，GA3) 50 μmol·L-1、細 胞 分裂素( cytokinin， 6-BA) 10 μmol·L-1、 油菜素內酯(brassinolide，BR)10 μmol·L-1，噴施12 h 后取葉片為樣品，液氮速凍后-80℃超低溫冰箱保存待測。

1.2 GRFs 基因家族鑒定及染色體分布分析

利用 Plant Transcription Factor Database v4.0(http:/ /planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)對二穗短柄草和擬南芥中GRFs基因家族進行篩選；利用Pfam 31.0 數據庫(http:/ /pfam.xfam.org/)對篩選到的GRFs基因家族進行結構域確定并去除冗余基因[21]；利用Phytozome v12.1(http:/ /www.phytozome.net/)和TAIR(http:/ /www.arabidopsis. org/)數據庫確定二穗短柄草與擬南芥GRFs基因家族在染色體上的位置信息；利用Circos 0.6 軟建構建GRFs基因家族的染色體分布圖譜[22]；利用在線軟件ProtParam(https:/ /web. expasy. org/protparam/)和Sopma(http:/ /npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa＿automat.pl? page ＝/NPSA/npsa＿hnn.html)預測蛋白質基本理化性質；利用蛋白質保守基序在線搜索軟件MEME(http:/ /meme.nbcr.net/)分析GRFs基因家族保守結構域的特征；利用DNAMAN version 6.0 對序列保守性進行分析。

1.3 GRFs 家族成員氨基酸序列比對與系統(tǒng)發(fā)育樹構建

將篩選完成的二穗短柄草、擬南芥、水稻、玉米和谷子GRFs 家族成員氨基酸全序列另存為FASTA 格式，利用MEGA5.05(http:/ /www.mega-software.net/)進行序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹構建，bootstrap 值設定為1 000[23]。

1.4 GRFs 基因家族表達模式分析

根據二穗短柄草GRFs基因家族序列信息設計特異引物，由北京華大基因公司合成。 Total RNA 的提取采用Trizon 法，cDNA 第一鏈的合成使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒，Real-time PCR 使用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒，均購自寶生物工程有限公司。 反應總體積20 μL，包含10 μL SYBR premix Ex Taq (2×)、1 μL cDNA(稀釋5 倍)、上下游引物各0.4 μL(10 μmol·L-1)，8.2 μL ddH2O。 反應程序為二步法:95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，40個循環(huán)；在復性時采集熒光信號，重復3 次。 以UBC18為內參基因，采用2-ΔΔCT法[24]計算相對表達量。

2 結果與分析

2.1 二穗短柄草GRFs 基因家族的鑒定與染色體定位

通過Plant Transcription Factor Database (http:/ /planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)獲取二穗短柄草與擬南芥GRFs候選基因，對這些候選基因結構域進行比對，最終確定到12 個二穗短柄草GRFs基因、9 個擬南芥GRFs基因。 為了確定GRFs基因在染色體上的分布特點，構建了二穗短柄草、擬南芥GRFs基因在染色體上的分布圖(圖1)。 其中12 個二穗短柄草GRFs基因(圖1 灰色部分)分布在二穗短柄草5 條染色體上；9個擬南芥GRFs基因(圖1 黑色部分)分布在擬南芥4條染色體上(擬南芥at01 染色體上無GRFs基因分布)。 在二穗短柄草中，bd01 號染色體上分布最多，有5 個GRFs基因，bd02 和bd04 號染色體上分布最少，都只有1 個GRFs基因；而在擬南芥中，在at02 號染色體上分布最多，有4 個GRFs基因，在at05 號染色體上分布最少，只有1 個GRFs基因。 上述結果表明，GRFs基因在2 種植物不同染色體上的分布是不均勻的，在同一染色體上的位置分布也是不均勻的。

2.2 二穗短柄草GRFs 基因家族基本理化特性分析

由表1 可知，二穗短柄草GRFs家族成員編碼序列(coding sequence， CDS)長度為645～1 734 bp，編碼蛋白長度為238～577 aa，分子量為25.44～61.64 kDa，等電點(pI)為4.81～10.57；GRF3、GRF6 和GRF9 由4個外顯子組成，GRF4、GRF5 和GRF8 由5 個外顯子組成，其他家族成員均由3 個外顯子組成；亞細胞定位預測結果表明，二穗短柄草GRFs 家族蛋白均定位于細胞核，具有轉錄因子的一般特性。

圖1 二穗短柄草和擬南芥GRFs 直系同源基因關系分布圖Fig.1 The distribution diagram of GRFs orthologous genes between Brachypodium distachyon and Arabidopsis thaliana

表1 二穗短柄草GRFs 基因家族成員理化性質Table 1 The physic-chemical characters of bdGRFs gene family in Brachypodium distachyon

2.3 二穗短柄草GRFs 蛋白家族的多重序列比對分析

GRFs 家族是一類植物特有的轉錄因子家族，其典型特征是含有保守的DNA 結合域。 GRFs 家族成員包含2 個保守的結構域，QLQ 結構域位于GRFs 蛋白的N 端，含有18～26 個α 螺旋，1 ～4 個β 轉角，6 ～15 個無規(guī)則卷曲和2 ～7 個延伸鏈；另一個WRC 結構域也位于GRFs 蛋白的N 端，含有4～15 個α 螺旋，0 ～6 個β 轉角，29 ～40 個無規(guī)則卷曲和0 ～11 個延伸鏈(表2)，而WRC 結構域能夠與C3H 基序結合，該區(qū)域是DNA 結合域并能引導該蛋白入核行使轉錄因子的功能。 由圖2 可知，12 個二穗短柄草GRFs 蛋白都具有保守的QLQ 和WRC 結構域，2 個結構域氨基酸殘基分別為34 ～36 個(最少的是BdGRF2 ～5，最多的是BdGRF1、BdGRF6 ～9、BdGRF11-1 和BdGRF11-2)和49～66 個(最少的是BdGRF4，最多的是BdGRF2)。

表2 二穗短柄草QLQ 結構域和WRC 結構域二級結構預測Table 2 The Secondary structure prediction of QLQ and WRC domains in Brachypodium distachyon

圖2 二穗短柄草GRFs 蛋白序列的多重序列比對Fig.2 The multiple sequence alignment of GRFs proteins in Brachypodium distachyon and Arabidopsis thaliana

2.4 二穗短柄草GRFs 蛋白家族系統(tǒng)發(fā)育樹的構建及分析

為了比較二穗短柄草等主要單子葉植物和擬南芥(雙子葉植物)GRFs 蛋白家族的進化關系，以二穗短柄草、水稻、玉米、谷子和擬南芥GRFs 氨基酸序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹。 由圖3 可知，5 個物種中GRFs 蛋白家族成員可以聚類為8 個主要的進化分支。 以最小分支樹中的基因為直系同源基因[25]，進一步分析了5 個物種中系統(tǒng)發(fā)育樹的8 個進化分支的關系。 具有直系同源關系的基因共有23 組，含有二穗短柄草的共有9組，其中與水稻直系同源的家族成員數量有4 個，與谷子和擬南芥直系同源的家族數量均是2 個。

2.5 二穗短柄草GRFs 蛋白家族的保守基序分布及序列分析

圖3 二穗短柄草、擬南芥、水稻、玉米和谷子GRFs 蛋白家族系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic tree of GRFs protein family among Brachypodium distachyon，Arabidopsis thaliana， Oryza sativa， Zea mays and Setaria italica

二穗短柄草GRFs 蛋白家族系統(tǒng)進化分析表明，GRFs 蛋白家族分為5 類:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ，并且存在4 對直系同源基因。 通過MEME 在線軟件對二穗短柄草12 個GRF 蛋白的保守基序進行分析(圖4)，結果表明，12 個GRF 蛋白具有9 個保守基序。 進一步分析了9 個保守基序在二穗短柄草GRFs 蛋白中的分布情況，GRF9 包含全部9 個保守基序；其他8 個GRF 蛋白中都存在不同保守基序的缺失，每個蛋白包含保守基序的數量在2 ～6 個之間，其中GRF11-1、GRF11-2、GRF10 和GRF12 保守基序缺失最多，只包含2 個保守基序；另外，有2個保守基序(Motif 3 和Motif 4)在所有二穗短柄草GRFs 蛋白中都是完全保守的。

通過SMART 網站提取了二穗短柄草與擬南芥GRFs 蛋白家族中所包含的QLQ 和WRC 保守結構域。在二穗短柄草中得到12 個QLQ 和WRC 保守結構域，而在擬南芥中得到9 個。 對QLQ 和WRC 結構域進行了保守區(qū)域的分析，二穗短柄草中12 個QLQ 結構域

相似度為20.5%，一致序列為T(x)Q(x)EL(x)Q(x)Y(x)P(x)L，擬南芥中9 個QLQ 結構域相似度為20.6%，一致序列為Q(x)E(x)Q(x)Y(x)VP(x)L(圖5-A)；二穗短柄草中12 個WRC 結構域相似度為40.0%，一致序列為P(x)RCRRTDGKKWRC(x)KYC(x)H(x)R(x)R(x)Ⅴ，擬南芥中9 個WRC 結構域相似度為37.5%，一致序列為EP(x)RC(x)RTDGKK WRC(x)KYC(x)H(x)R(圖5-B)。 通過比較二穗短柄草和擬南芥中QLQ 和WRC 結構域發(fā)現，在2 個物種之間WRC 結構域在氨基酸長度和序列上均有較好的一致性，而QLQ 結構域存在較大的差異。

2.6 二穗短柄草GRFs 基因家族的組織表達模式分析

圖4 二穗短柄草GRFs 蛋白家族的保守基序分布Fig.4 Distribution of conserved motifs of GRFs protein family in Brachypodium distachyon

圖5 二穗短柄草GRFs 蛋白家族保守結構域分析Fig.5 Analysis of conserved domains of GRFs protein family in Brachypodium distachyon

為了分析二穗短柄草GRFs基因家族在不同組織器官中的表達特征，利用RT-qPCR 技術分析了12 個GRFs家族成員在根、莖、老葉、新葉、幼穗和籽粒的表達模式。 結果發(fā)現，所有GRFs家族成員在幼穗中表達量最高，而在根中表達量最低，其中差別最大的是GRF2(23.3 倍)，差別最小的是GRF6(3.89 倍)，新葉的表達量普遍高于老葉(1.2 ～3.0 倍)，在籽粒中表達量也較高。GRFs家族成員在幼嫩組織(特別是在幼穗中)表達豐度較高，說明GRFs家族成員在不同器官的生長和發(fā)育中的作用是不同的。

圖6 二穗短柄草GRFs 基因家族的組織表達模式分析Fig.6 Expression analysis of GRFs family members of Brachypodium distachyon in different tissues

2.7 二穗短柄草GRFs 基因家族對外源激素響應的表達模式分析

由圖7 可知，幾乎所有的GRFs家族成員均對外源激素產生了響應。 依次有2、3、6、6 和2 個GRFs家族成員分別對外源IAA、ABA、GA3、6-BA 和BR 發(fā)生2倍以上的上調響應。 外源IAA 顯著促進了7 個GRFs家族成員的上調表達，5 個GRFs家族成員顯著下調表達，其中，上調表達差異倍數最大的是BdGRF1(2.4倍)，其次為BdGRF3(2.3 倍)，而下調倍數最高的是BdGRF10(0.2 倍)。 外源ABA 僅對BdGRF11-1 產生了顯著的下調表達效果(0.4 倍)，BdGRF5 與CK 相比差異不顯著，其余家族成員均呈現顯著上調表達的效果，上調表達差異倍數最大的是BdGRF4(2.4 倍)。外源GA3顯著促進了8 個GRFs家族成員的上調表達，3 個GRFs家族成員略微上調但差異不顯著，BdGRF9 下調表達差異也不顯著；其中，上調表達差異倍數最大的是BdGRF2(24.0 倍)，其次為BdGRF12(8.7 倍)和BdGRF1(6.6 倍)。 外源6-BA 對全部GRFs家族成員都呈現上調表達效果，其中，上調表達差異倍數最大的是BdGRF1(7.6 倍)，其次為BdGRF3(5.3 倍)。 外源BR 對BdGRF10(0.7 倍)和BdGRF11-1(0.8 倍)產生下調表達效果，其余家族成員均表現為上調表達效果。

3 討論

作為植物特有的轉錄因子，在基因組水平上，GRFs已經在許多物種中得到鑒定；截至目前，在苔蘚中只鑒定到2 個GRFs成員；單子葉植物中鑒定到GRFs成員數量最少的是大麥，僅有8 個成員，最多的是香蕉，有19 個成員；雙子葉植物中鑒定到GRFs成員數量最少的是百脈根，僅有2 個成員，最多的是大豆，有26 個成員；多數高等植物都能鑒定到8 個以上成員，而且表現為雙子葉植物大于單子葉植物，多倍體大于單倍體[25]。 本研究在全基因組范圍內鑒定到12個二穗短柄草GRFs基因家族成員。 二穗短柄草與擬南芥GRF 蛋白保守結構域的分析結果表明，2 個物種QLQ 結構域保守性約為20%，該結構域的差異主要表現在氨基酸偏好性的不同，這可能會導致不同家族成員在特定組織、發(fā)育階段或特殊生理狀態(tài)下發(fā)生特異性表達，而QLQ 結構域是蛋白質互作區(qū)域，這種多態(tài)性很可能是執(zhí)行不同生物學功能的重要原因；WRC 結構域保守性約為40%，保守氨基酸存在較大差異，而保守氨基酸一般出現在結構域的N 端，這表明GRFs蛋白家族結構在單子葉植物和雙子葉植物之間的保守性并不高。 這種由缺失和插入所造成的結構域氨基酸殘基數量的變異，也是二穗短柄草GRFs呈現遺傳多樣性的重要原因。

圖7 二穗短柄草GRFs 基因家族對外源激素響應的表達模式分析Fig.7 Expression analysis of GRFs family members in response to various hormones of Brachypodium distachyon

GRFs基因家族在植物不同生命進程中發(fā)揮著不同的功能，GRF1～5 在細胞大小和數量的調控中起著重要作用，進而影響根系生長、葉片大小和植株高度等，特別是GRF2 對穗子發(fā)育、種子大小和含油量具有重要影響[2-3，25-28]；此外，GRF1、GRF3 和GRF7 通過解除對DREB2A的抑制作用來響應環(huán)境的脅迫[9]；而大部分GRFs家族成員都能參與植物花器官的發(fā)育及花期的調控[5-7，29]。 本研究系統(tǒng)發(fā)育樹結果表明，二穗短柄草、擬南芥、水稻、玉米和谷子分為Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅷ6 組，分別包含1、2、2、2、2 和3 個二穗短柄草GRFs 蛋白，表明二穗短柄草GRFs 蛋白家族成員之間存在著廣泛的多樣性，這可能是由QLQ 結構域保守性較低決定的，不同的DNA 結合位點可能是GRFs 蛋白家族成員功能多樣性的重要原因，同時也可能出現功能冗余的現象[25]。 系統(tǒng)發(fā)育結果還表明，二穗短柄草GRFs 蛋白家族成員可能來自同一祖先。 此外，二穗短柄草GRFs 蛋白家族親緣關系與水稻最近，這可能與二者都是C3 植物有關，與C4 植物的谷子親緣關系次之，而與C4 植物的玉米較遠，與雙子葉植物擬南芥親緣關系最遠。 基因家族成員的分布和結構的多樣性決定了功能的多樣性，為研究二穗短柄草GRFs基因功能奠定了基礎。 本研究還發(fā)現，二穗短柄草和擬南芥GRFs基因家族中存在8 對直系同源基因，在二穗短柄草中，未發(fā)現與擬南芥GRF7 直系同源的基因，這表明二穗短柄草在進化的過程中可能發(fā)生了基因丟失事件，同時也按照物種特異性的方式進行了擴展，該現象在植物其他基因家族的研究中也得到了廣泛的驗證[30-31]，說明不同類型的GRFs基因家族成員存在不同的進化途徑和進化速度。 此外，二穗短柄草的12 個GRFs家族基因廣泛而非均勻地分布于其5 條染色體上，表明GRFs基因家族在二穗短柄草基因組中具有共同的祖先。 GRFs 蛋白家族結構域和基序的保守性及多樣性都表明，GRFs 蛋白家族在二穗短柄草進化過程中具有重要且多重的作用。 然而，染色體分布和序列比對分析結果表明，二穗短柄草GRFs家族成員的擴張并未出現串聯重復的現象，這與前人研究結果是一致的[32-33]。

表達模式分析可以在一定程度上預測基因的分子功能和涉及的生命過程。 本研究通過RT-qPCR 分析了GRFs基因家族在二穗短柄草不同組織器官中的表達模式，發(fā)現幾乎所有GRFs家族成員表達量在幼穗和新葉等幼嫩器官中表達量較高，而在根系和老葉等器官中表達量較低。 Kim 等[34]和Choi 等[35]分別對擬南芥和水稻GRFs基因家族在全基因組范圍內進行了鑒定和表達分析，結果表明，擬南芥和水稻全部GRFs家族成員在地上部分生組織中大量表達，而在9 個擬南芥GRFs基因家族成員中有7 個成員在根系分生區(qū)域有表達，在12 個水稻中GRFs基因家族成員中有2個表現出低豐度的表達模式，這與本研究結果基本一致，暗示GRFs 蛋白在植物生長發(fā)育中可能具有不同的生物學功能。GRFs基因通過正向調節(jié)細胞的伸展與分裂來促進植物葉片的生長，且GRFs基因的表達量隨著植物的衰老而下降，說明GRFs基因家族廣泛參與了二穗短柄草旺盛生長器官的生命過程，推斷GRFs基因家族成員在分生組織功能和器官形成中具有重要作用[36-37]。 植物的第一個GRFs轉錄因子(OsGRF1)是在研究GA3促進水稻節(jié)間伸長中被發(fā)現的[38]。 前人研究表明，外源GA3能誘導水稻、大白菜和煙草GRFs基因的上調表達，而擬南芥GRFs家族成員對外源GA3沒有響應，這可能是不同物種間進化關系不同導致的[12]。 本研究結果表明，外源GA3能夠使8 個GRFs基因家族成員顯著上調，其他4 個成員差異不顯著，由此推斷并不是所有的GRFs家族成員都參與了二穗短柄草對外源GA3的響應，這與水稻中的研究結果相似。KNOX是重要的調節(jié)因子，通過抑制GA的生物合成進而抑制細胞分化，因而能夠負向調控分生組織的發(fā)育及其功能；而GRFs是KNOX的上游抑制基因，由此推測，外源GA3誘導了KNOX的表達，并導致GRFs基因的上調表達，說明二穗短柄草的GA 信號可能存在負向反饋調節(jié)機制。 本研究還發(fā)現，大部分GRFs基因家族成員對外源IAA、ABA、6-BA 和BR均產生了響應，這是因為與激素相關的順式作用元件存在于GRFs基因家族成員的啟動子區(qū)域，如ABRE、GARE、TATC-box 和P-box 元件[12]。 然而，GRFs基因家族的轉錄調節(jié)機制包括其啟動子特異作用元件的相關研究仍需要進一步深入探索。

4 結論

本研究利用生物信息學的方法，在全基因組范圍內鑒定了二穗短柄草的12 個基因家族成員；多序列比對發(fā)現它們均含有2 個保守的結構域:QLQ 和WRC結構域。 染色體定位、基因結構特征、系統(tǒng)發(fā)育關系分析表明，與擬南芥同源基因比對發(fā)現，二穗短柄草GRFs基因家族可能經歷了不同的進化過程。 RTqPCR 分析表明，這些GRFs家族基因在二穗短柄草不同器官中表達模式類似，在幼嫩組織中表達量較高，且多數成員對外源激素特別是GA3有響應，表明GRFs家族基因廣泛參與了分生組織功能和器官形成。 該結果為進一步研究GRFs家族基因在二穗短柄草生長發(fā)育和器官形成等過程中的作用奠定了基礎。