郭小衛(wèi) 潘悅

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)病率最高的惡性腫瘤，最常見的病理類型為甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）[1]。當前，我國甲狀腺癌的發(fā)病率和檢出率呈上升趨勢[2]。趨化因子受體3(chemokine receptor 3，CXCR3)、趨化因子配體 10(chemokine ligand 10，CXCL10)的相互作用與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關系逐漸引起臨床重視[3]。CXCR3與CXCL10相互作用，一方面可通過激活免疫活性細胞或抑制相關血管生成來抑制腫瘤的生長；另一方面也可通過促進腫瘤細胞增殖，分泌蛋白水解酶，誘導血管生成來促進腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[3]?；诖?，本研究采用免疫組化法對PTC組織與癌旁正常組織中 CXCR3、CXCL10表達水平進行檢測，并分析CXCR3、CXCL10表達與PTC患者臨床病理特征的關系，探討其臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2018年1至8月在臺州市中心醫(yī)院行手術切除治療的79例PTC患者的腫瘤組織標本及其相應的癌旁正常組織（距離病灶2cm以上）。其中男37例，女42例；年齡20～72歲，中位年齡41歲。術前所有患者均未接受內(nèi)放療或外放療。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 非免疫性牛血清、兔超敏二步法免疫組化檢測試劑、DAB顯色試劑均購自福建邁新生物技術有限公司，CXCR3單克隆抗體和CXCL10單克隆抗體均購于北京博奧森生物技術有限公司。

1.2.2 免疫組化法檢測CXCR3、CXCL10的表達 采用SP法分別檢測PTC組織與癌旁正常組織中CXCR3、CXCL10的表達。組織標本的石蠟玻片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度脫水，在體積分數(shù)為3%的過氧化氫溶液中室溫孵育15min；浸入0.01mmol/L的枸櫞酸中，微波抗原修復；用體積分數(shù)為10%的非免疫性牛血清封閉，分別加入CXCR3單克隆抗體、CXCL10單克隆抗體，在37℃溫箱中孵育1h；加入通用型免疫組化二抗，37℃孵育10min；DAB顯色，蘇木精復染，二甲苯透明，中性樹膠封片。以PBS替代一抗作為陰性對照。

1.2.3 結(jié)果判定 細胞膜及細胞質(zhì)出現(xiàn)淡黃色至棕黃色的顆粒視為CXCR3、CXCL10陽性染色。在高倍顯微鏡下隨機選取5個視野，按照染色細胞數(shù)目的多少及顯色深淺進行評分[4]。（1）根據(jù)陽性細胞著色深淺計分：0分為不顯色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。（2）根據(jù)陽性細胞所占比例評分：0分為陽性細胞比例＜15%，1分為陽性細胞比例15%～25%，2分為26%～75%，3分為≥76%。以兩項得分乘積評定結(jié)果，其中0分為陰性（-）；1～3分為弱陽性（+），4～6分為中陽性（++），7～9分為強陽性（+++）。+、++和+++視為陽性表達。

1.3 觀察指標 （1）觀察并比較PTC組織與癌旁正常組織中 CXCR3、CXCL10陽性表達率；（2）按照 2017年美國癌癥聯(lián)合會（AJCC）關于PTC的TNM分期及患者年齡、性別、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有無等情況分成亞組，分析PTC組織中CXCR3、CXCL10的表達與患者臨床病理特征的關系。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗。相關性分析采用Spearman秩相關。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1PTC組織與癌旁正常組織中CXCR3表達比較 PTC組織中CXCR3陽性表達率為69.6%（55/79），而癌旁正常組織中CXCR3陽性表達率為25.3%（20/79），PTC組織陽性表達率高于癌旁正常組織，兩者比較差異有統(tǒng)計學意見（P＜0.05）。PTC組織與癌旁正常組織中CXCR3表達顯微鏡下所見見圖1（插頁）。

圖1 PTC組織與癌旁正常組織中CXCR3表達顯微鏡下所見（a:CXCR3在PTC組織中陽性表達；b：CXCR3在PTC組織中陰性表達；c：CXCR3在癌旁正常組織中陽性對照；d：CXCR3在癌旁正常組織中陰性對照；免疫組化染色，×400）

2.2 PTC組織與癌旁正常組織中CXCL10表達比較PTC組織中CXCL10陽性表達為60.8%（48/79），癌旁正常組織中CXCL10陽性表達率為20.2%（16/79），PTC組織中陽性表達率高于癌旁正常組織，兩者比較差異有統(tǒng)計學意見（P＜0.05）。PTC組織與癌旁正常組織中CXCL10表達顯微鏡下所見見圖2（插頁）。

圖2 PTC組織與癌旁正常組織中CXCL10表達顯微鏡下所見（a:CXCL10在PTC組織中陽性表達；b：CXCL10在PTC組織中陰性表達；c：CXCL10在癌旁正常組織中陽性對照；d：CXCL10在癌旁正常組織中陰性對照；免疫組化染色，×400）

2.3 PTC組織中CXCR3、CXCL10的表達與患者臨床病理特征的關系 PTC組織中CXCR3、CXCL10的表達與患者TNM分期、腫瘤分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關（均P＜0.05），與患者性別、年齡、腫瘤最大徑均無關（均P ＞0.05）,見表 1。

2.4 PTC組織中CXCR3表達與CXCL10表達的關系PTC組織中CXCR3的表達與CXCL10的表達呈正相關（r＝0.597，P＜0.05），見表 2。

3 討論

趨化因子是一類分泌性小分子蛋白，對不同靶細胞具有趨化和誘導功能，根據(jù)特征性保守半胱氨酸基序的排列不同，可分為C、CC、CXC及CX3C共4個亞家族[5]。CXCR3是CXC趨化因子亞家族的受體之一，屬于Th1細胞趨化因子受體。CXCR3基因定位于染色體Xq13，cDNA全長1104bp，相對分子質(zhì)量約為41 000，屬于G蛋白耦聯(lián)受體超家族，共編碼368個氨基酸[6]。CXCL10是CXCR3其中一個配體，是一種相對分子質(zhì)量小的結(jié)構(gòu)相關性蛋白，它通過與靶細胞膜上相應受體結(jié)合引起靶細胞的定向遷移[7]。多項研究表明CXCR3及其特異性配體與腫瘤免疫和腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移密切相關[8-15]。

林明臻等[8]采用免疫組化SP方法檢測，發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中的CXCR3表達陽性率為 90.0%（72/80），顯著高于乳腺纖維腺瘤組的10.0%（2/20）；王曉雅等[9]利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析CXCR家族蛋白在不同乳腺癌亞型中的表達，發(fā)現(xiàn)CXCR3蛋白在乳腺癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織。Yang等[10]通過蛋白質(zhì)印跡法檢測，發(fā)現(xiàn)在人體胃癌組織及細胞系中，CXCR3 mRNA及其蛋白質(zhì)產(chǎn)物表達水平明顯高于癌旁組織，這說明CXCR3在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)PTC組織中CXCR3高表達，在癌旁正常組織中CXCR3低表達，兩組比較有統(tǒng)計學差異，說明CXCR3可能是個潛在的促癌基因，與PTC的發(fā)生關系密切，或能作為腫瘤治療的潛在靶點。

研究發(fā)現(xiàn)，CXCL10在早孕絨毛、葡萄胎、葡萄胎惡變以及滋養(yǎng)細胞腫瘤組中陽性表達率逐漸升高，差異有統(tǒng)計學意義[11]。Utsumi等[12]采用免疫組化法檢測出腎癌組織中CXCL10的表達水平是正常腎組織的 22倍，CXCR3的表達水平是正常腎組織的6倍，提示CXCR3/CXCL10生物軸在腎癌侵襲、轉(zhuǎn)移中可能起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)PTC組織中CXCL10陽性表達率為60.8%，而癌旁正常組織中陽性表達率為20.2%，兩者比較有統(tǒng)計學差異，提示CXCL10可能也是個潛在促癌基因，它與CXCR3共同促進了PTC發(fā)生、發(fā)展。

表1 PTC組織中CXCR3、CXCL10的表達與患者臨床病理特征的關系分析[例（%）]

表2 PTC組織中CXCR3表達與CXCL10表達的關系分析[例（%）]

Ma等[13]在75例乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，CXCR3的表達水平與腫瘤大小、轉(zhuǎn)移累及的淋巴結(jié)數(shù)呈正相關。Murakami等[14]研究發(fā)現(xiàn)，CXCR3高表達可促進結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，敲除CXCR3后的結(jié)直腸癌腫瘤組織樣本發(fā)生淋巴結(jié)及器官(主要是肝和肺)轉(zhuǎn)移明顯減少。而王昌敏等[15]在胃癌中的研究發(fā)現(xiàn)CXCR3過表達與腫瘤侵襲遷移率呈負相關，與患者總生存率呈正相關。本研究進一步分析了PTC組織中CXCR3、CXCL10蛋白的表達與患者臨床病理特征的關系，發(fā)現(xiàn)PTC患者TNM分期病期偏晚、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的、腫瘤分化程度低的，PTC組織CXCR3、CXCL10表達陽性率均越高。這提示CXCR3、CXCL10在PTC中是促進腫瘤轉(zhuǎn)移的不良指標。

有研究指出乳腺癌細胞高表達CXCR3、CXCL10的原因為乳腺癌細胞能自分泌 CXCL10，且高表達的CXCL10能進一步上調(diào)CXCR3的表達，這兩者相互作用又可促進乳腺癌細胞增殖，從而進一步導致CXCL10表達上調(diào)及CXCR3高表達[16]。本研究中Spearman相關分析顯示，PTC組織中CXCR3的表達與CXCL10的表達呈正相關，提示CXCL10作為CXCR3的配體，共同參與了PTC發(fā)生、發(fā)展的過程。

綜上所述，CXCR3在PTC組織中的異常高表達，可能通過其配體CXCL10來實現(xiàn)，但CXCR3是否還通過其他基因來調(diào)控PTC的細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，仍需進一步研究。本研究結(jié)果提示CXCR3、CXCL10有可能作為PTC治療的新的潛在靶點。