馬 亮，張運峰，董建悅，胡 芬

生命科學與技術

hsa-miR-216a-5p的靶基因及調(diào)控網(wǎng)絡的生物信息學分析

馬 亮1，張運峰2，董建悅2，胡 芬1

（1. 華北理工大學 生命科學學院，河北 唐山 063210；2. 唐山師范學院 生命科學系，河北 唐山 063000）

利用miRBase、生物信息工具bioinfo和TargetScan7.2、miRDB、miRDIP和miTarBase四個數(shù)據(jù)庫獲取了八個物種的miR-216a-5p成熟序列、表達譜數(shù)據(jù)和129個靶基因。對靶基因集合進行GO、KEGG分析，結果顯示hsa-miR-216a-5p主要富集在轉(zhuǎn)錄DNA模板、轉(zhuǎn)錄生長因子beta受體信號通路、蛋白穩(wěn)定化等10個生物過程（P<0.01），泛素蛋白連接酶活性、SMAD蛋白結合、蛋白泛素化等4個分子功能（P<0.01）以及糖尿病、內(nèi)吞作用、TRF通道的炎性介質(zhì)調(diào)節(jié)等5個KEGG通路中（P<0.05）。借助構建PPI蛋白互作網(wǎng)絡，從129個靶基因中篩選出了PTEN、SIRT1、TGFBR2等10個關鍵基因。

hsa-miR-216a-5p；靶基因；生物信息

miRNA（microRNA）是一類廣泛存在于動植物和某些病毒體內(nèi)長度為22nt左右的單鏈非編碼RNA分子，通過結合靶mRNA的3’UTR區(qū)阻止其翻譯或促進其降解而發(fā)揮功能[1]。miRNA具有高度的序列保守性，從而能夠廣泛調(diào)節(jié)多種生命活動。miR-216a-5p在多種癌癥的發(fā)生發(fā)展中具有調(diào)控作用。在肝細胞癌（HCC）的發(fā)生過程中，mR-216a-5p可通過JAK2靶向抑制癌細胞的增殖和侵襲[2]，通過下調(diào)MMP16抑制肺癌細胞的侵襲[3]，也能以PAK2為靶基因?qū)崿F(xiàn)對膀胱癌細胞增殖和凋亡的調(diào)控[4]，另外還可抑制HMGB1的表達從而抑制胃癌細胞的增殖和遷移[5]。

到目前為止，hsa-miR-216a-5p眾多靶基因尚不十分清楚。本研究擬采用生物信息學的方法利用公共數(shù)據(jù)庫對hsa-miR-216a-5p進行靶基因預測，并采用DAVID網(wǎng)站對獲得靶基因集合進行GO功能注釋和KEGG通路富集分析，利用STRING數(shù)據(jù)庫和Cystocape 3.7.1軟件構建蛋白互作網(wǎng)絡并篩選出關鍵基因，為進一步深入分析hsa-miR-216a-5p的功能提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 miR-216a-5p序列信息獲取

通過在線公共數(shù)據(jù)庫miRBase（http://www. mirbase.org）下載人、獼猴等八個物種的miR-216a-5p的成熟序列，利用MEGA-X軟件分析其序列保守性。

1.2 hsa-miR-216a-5p表達譜分析

采用癌癥基因組圖譜計劃（TCGA）數(shù)據(jù)庫信息，利用生物信息學在線分析工具（http:// bioinfo.life.hust.edu.cn/miR_path/index）獲得hsa-miR-216a-5p在人類各個癌組織和癌旁組織的表達譜。

1.3 靶基因預測

分別采用數(shù)據(jù)庫TargetScan7.2、miRDB、miRDIP進行hsa-miR-216a-5p的靶基因預測，使用venny2.1進行韋恩圖繪制。利用miTarBase數(shù)據(jù)庫獲取經(jīng)過實驗驗證的靶基因，綜合四個數(shù)據(jù)庫整合靶基因集合，用于后續(xù)分析。

1.4 GO和KEGG分析

利用在線網(wǎng)站DAVID（https://david.ncifcrf. gov）對得到的hsa-miR-216a-5p靶基因集合，分別進行生物過程、細胞組分、分子功能GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。

1.5 靶基因PPI網(wǎng)絡構建及關鍵基因篩選

將上述獲得的靶基因集合輸入STRING（https://string-db.org/cgi/input.pl）數(shù)據(jù)庫，構建PPI蛋白互作網(wǎng)絡，并結合Cystocape 3.7.1軟件進行數(shù)據(jù)可視化，通過使用CytoHubba插件進行關鍵基因的篩選。

2 結果

2.1 hsa-miR-216a-5p基因序列保守性分析

如圖1，在人、獼猴、小鼠、大鼠、安大略鮭中miR-216a-5p的成熟序列為22個堿基，在兔、犰狳、豚鼠中為23個堿基，八個物種miR- 216a-5p成熟序列基本一致。

圖1 miR-216a-5p 在8個物種中成熟microRNA序列比對結果

2.2 hsa-miR-216a-5p表達譜分析

如圖2，相較于正常組織，在膀胱尿路上皮癌（BLCA）、宮頸癌（CESC）、食管癌（ESCA）等中呈現(xiàn)高表達，miR-216a-5p在這些癌癥中可能充當癌基因。另外在腎嫌色細胞癌（KICH）、腎乳頭狀細胞癌（KIRP）中呈現(xiàn)低表達，推測其可能作為抑癌基因存在。

圖2 TCGA分析hsa-miR-216a-5p的表達譜。

2.3 hsa-miR-216a-5p靶基因預測

采用數(shù)據(jù)庫TargetScan、miRDB、miRDIP預測hsa-miR-216a-5p的靶基因，分別獲得372個、577個、845個靶基因，對數(shù)據(jù)取交集共獲得122個靶基因，詳見圖3a。結合miTarBase數(shù)據(jù)庫經(jīng)過雙熒光素酶報告實驗、western blot和qPCR驗證的靶基因10個（PTEN, SIRT1, CDC42, CD44, SMAD7, BECN1, HNF4A, JAK2, CEMIP, CBL），共獲得129個靶基因，詳見圖3b。

2.4 hsa-miR-216a-5p靶基因的GO功能注釋和KEGG通路富集

采用DAVID對hsa-miR-216a-5p靶基因進行GO分析，結果表明靶基因主要富集在轉(zhuǎn)錄DNA模板、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)化生長因子beta受體信號通路、表皮生長因子激活受體的隱性調(diào)節(jié)等10個生物過程（P<0.01），泛素蛋白連接酶活性、SMAD蛋白結合、蛋白泛素化和蛋白結合4個分子功能（P<0.01），詳見圖4。

圖4 hsa-miR-216a-5p靶基因GO功能顯著性富集分析結果

使用在線網(wǎng)站DAVID進行了靶基因KEGG通路富集分析，結果發(fā)現(xiàn)共有47個靶基因富集到KEGG通路上，其中主要富集在年輕的成年發(fā)病型糖尿病、內(nèi)吞作用、TRF通道的炎性介質(zhì)調(diào)節(jié)、細胞黏著和癌癥microRNA等5個通路（P<0.05）。結果見表1。

表1 hsa-miR-216a-5p靶基因KEGG通路富集分析結果

2.5 構建靶基因PPI網(wǎng)絡并篩選關鍵基因

通過上述實驗獲得的hsa-miR-216a-5p靶基因集結合STRING數(shù)據(jù)庫構建其蛋白互作網(wǎng)絡圖（PPI），得到一個有76個node，123個edge的蛋白互作網(wǎng)絡圖。下載節(jié)點數(shù)據(jù)文件導入Cytoscape 3.7.1，使其數(shù)據(jù)可視化，利用CytoHubba插件計算PPI中各個基因的節(jié)點度（degree），篩選核心蛋白質(zhì)的編碼基因。進而得到10個關鍵基因：PTEN、SIRT1、TGFBR2、CDC42、XIAP、CD44、SMAD7、CBL、ZEB1和HNF4A，詳見圖5。

圖5 has-miR-216a-5p關鍵靶基因篩選

3 討論

miRNA與眾多生理過程有密切關系，如分化、增殖、凋亡與發(fā)育等[6]。目前，miR-216a-5p的研究主要集中于癌癥的發(fā)生發(fā)展中。CHEN等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在腎細胞癌中miR-216a-5p顯著上調(diào)表達，并促進癌細胞增殖抑制其凋亡，可作為腎細胞癌的標志物，但尚未給出其靶向調(diào)控基因。然而在肺細胞癌中miR-216a-5p卻通過靶向調(diào)控Bcl-2、Bax、Bad蛋白（family proteins），從而抑制細胞增殖和轉(zhuǎn)移并影響細胞周期活動[8]；Zhang Y等人[9]研究證實，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中，miR-216a-5p通過靶向調(diào)控PAK2蛋白的表達進而抑制癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移。通過這些研究可知，miR-216a-5p是調(diào)控癌癥細胞增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡的關鍵因子，由此可推測，其可作為癌癥早期診斷的生物標志物。

miRNA作為一種小型單鏈RNA分子越來越多地受到關注。研究表明，其主要通過和靶mRNA的3’UTR區(qū)結合抑制其翻譯或促進其降解而發(fā)揮功能，所以往往伴隨著眾多靶基因的異常表達。如何快速準確地預測其靶基因顯得尤為重要。生物信息學方法預測mRNA靶基因的工具很多，目前為止使用較多的有TargetScan7.2、miRDB、miRDIP這三種[10,11]。其中miRDB為第一代預測軟件，其不受物種限制，支持在線和本地，支持各種平臺，產(chǎn)出多但精度低。TargetScan7.2為第二代預測軟件，預測精度大為提高，假陽性較低；miRDIP為最新預測軟件，搜索功能強大，整合了多達30個數(shù)據(jù)庫的資源但精度低。這三者所使用的算法各有優(yōu)勢，能互為補充，還可降低假陽性率和擴大搜索范圍。本研究整合經(jīng)過實驗驗證數(shù)據(jù)庫miTarBase結果，共獲得了129個靶基，為進一步實驗工作指明了方向。

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Bioinformatics Analysis of Target Gene and Regulatory Network of hsa-miR-216a-5p

MA Liang1, ZHANG Yun-feng2, DONG Jian-yue2, HU Fen1

(1. College of Life Sciences, North China University of Science and Technology, Tangshan 063210, China; 2. Department of Life Science, Tangshan Normal University, Tangshan063000, China)

The mature sequences of miR-216a-5p were obtained by miRBase, and its conservation was analyzed by MEGA-X. The expression profile of has-miR-216a-5p was get from bio info web. A total of 129 target genes were obtained integrating four database target genes of TargetScan7.2、miRDB、miRDIP and miTarBase. The GO function annotation, KEGG pathway analysis and PPI were performed on the target genes. The results show that they are mainly enriched in 10 biological processes such as transcription and DNA-templated (p<0.01), 4 molecular functions such as ubiquitin protein ligase activity (p<0.01), and 5 KEGG pathways such as maturity onset diabetes of the young (p<0.05). Ten key genes such as PTEN, SIRT1, TGFBR2 were screened out from 129 target genes by constructing PPI protein interaction network.

hsa-miR-216a-5p; target genes; bioinformatics

Q279

A

1009-9115(2020)03-0067-04

10.3969/j.issn.1009-9115.2020.03.016

河北省自然科學基金項目（H2018209140，C2019105055）

2019-12-16

2020-04-06

馬亮（1994-），男，河北邯鄲人，碩士研究生，研究方向為腫瘤遺傳學。

胡芬（1983-），女，河北唐山人，博士，副教授，研究方向為生物化學與分子生物學。

（責任編輯、校對：李春香）