干擾FOS表達對KSHV感染的神經(jīng)元細胞增殖的影響

徐慧玲，曹冬冬，李英，張曉艷，吳淑媛，王曉露，潘澤民，李冬妹*

(1石河子大學醫(yī)學院生物化學教研室/新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，新疆 石河子 832002；2新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第八師石河子市婦幼保健院，新疆 石河子 832000)

卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒(Kaposi′s sarcoma associated herpesvirus，KSHV)，又稱人類皰疹病毒8(Human Herpesvirus-8，HHV-8)。該病毒于1994年被發(fā)現(xiàn)，由Chang等人從艾滋病(AIDS)患者的卡波氏肉瘤(KS)病變中分離出來，KSHV是除Epstein-Barr virus 之外唯一可導致癌癥的γ2-型皰疹病毒[1]。自鑒定出KSHV以來,有三種疾病被認為與KSHV感染有關(guān):卡波氏肉瘤(KS)、多中心Castleman病(MCD)和原發(fā)性積液性淋巴瘤(PEL)，且迄今為止KSHV被確認為KS的病原體[2]。早前的研究報道KSHV主要感染的細胞類型為內(nèi)皮細胞、上皮細胞、B細胞、角質(zhì)形成細胞和單核細胞[3-4]。

由HIV感染引起的細胞介導的免疫功能的逐漸消耗和隨后的免疫功能喪失，使患者容易患上一系列異常惡性腫瘤，而AIDS患者易感染KSHV，由KSHV感染導致的腫瘤是AIDS患者最常見的死亡原因，且部分患者出現(xiàn)記憶喪失、智力減退和行為改變等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[5-6]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)HIV/AIDS陽性個體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中可以檢測到KSHV 的病毒DNA[7]，本課題組前期也驗證了KSHV可以直接感染神經(jīng)元細胞[8]，KSHV感染對中樞神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)細胞宿主基因的表達和活性的改變以及KSHV病毒本身是否有影響還有待進一步研究。

對原癌基因中即刻早期應(yīng)答基因(IEG)的研究提示，F(xiàn)OS蛋白是神經(jīng)元被刺激激活的一種標志，在細胞的增殖和分化扮演著至關(guān)重要的作用[9]，有研究報道感染KSHV的B細胞中FOS與KSHV病毒的多個啟動子直接結(jié)合，激活病毒多種基因的轉(zhuǎn)錄[10-11]，但其在KSHV感染的神經(jīng)元細胞中的作用尚不清楚。本研究采用重組病毒rKSHV.219感染SH-SY5Y細胞建立感染細胞模型，通過干擾FOS基因的表達來探究FOS對KSHV感染的神經(jīng)元細胞的增殖以及KSHV病毒的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、嘌呤霉素、G418購于美國GIBCO公司，強力霉素、丁酸鈉購于德國Sigma Aldrich公司，潮霉素、Lip2000試劑購于美國Invitrogen 公司，PEG-it病毒濃縮液購于上海SBI公司，MTT購于中國Solarbio公司，鼠抗人FOS購于中國博奧森公司，山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG購于北京中杉金橋公司，載體pGPU6/GFP/Neo購于上海吉瑪制藥，大腸桿菌E.coliDH5α，Cell Cycle Staining kit購于中國聯(lián)科生物。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

SH-SY5Y(神經(jīng)母細胞瘤細胞)細胞采用10%FBS和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，islk.219細胞(KSHV感染的內(nèi)皮來源的細胞)采用含 10% 的胎牛血清、6 μg/mL 嘌呤霉素、100 μg/mL G418 和100 μg/mL潮霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，SK-RG細胞(KSHV感染的SH-SY5Y細胞)采用于含 10% 的胎牛血清、6μg/mL 嘌呤霉素的高糖 DMEM 培養(yǎng)基中，于含5% CO2的37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 誘導和提取rKSHV.219病毒液

用1 μg/mL強力霉素和1.25 mmol/L丁酸鈉處理islk.219細胞72 h誘導KSHV裂解復(fù)制，然后收集所有細胞上清液，800 r/min，10 min離心去除殘留的細胞，并用0.45 μm濾器無菌過濾含病毒的上清液，將上清液轉(zhuǎn)移至無菌容器中，并在4 ℃下向含KSHV病毒的上清液中加入1/4體積預(yù)冷的PEG-It病毒濃縮液，4 ℃冷藏過夜(至少12 h)。在4 ℃下以1 500 r/min離心上清液/PEG-it混合物30 min。吸出上清液，將慢病毒沉淀重懸在無菌的磷酸鹽緩沖液中。病毒原液保存在-80 ℃。

1.2.3 KSHV感染SH-SY5Y細胞

采用從islk.219細胞中誘導的rKSHV病毒液感染SH-SY5Y細胞。將感染的SH-SY5Y細胞在37 ℃，5%CO2下培養(yǎng)3 d。用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白(GFP)，將成功感染的細胞命名為SK-RG。

1.2.4 FOS基因干擾質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)shRNA設(shè)計原則合成針對人FOS基因的干擾序sh-FOS:GGGATAGCCTCTCTTACTACC和陰性對照靶序列sh-NC：GTTCTCCGAACGTGTCACGT。將序列分別連接入載體pGPU6/GFP/Neo，通過real time PCR擴增FOS 基因，確定干擾質(zhì)粒sh-FOS有效，并將其用于后續(xù)實驗。

1.2.5 細胞轉(zhuǎn)染

使用脂質(zhì)體Lip2000試劑轉(zhuǎn)染細胞。實驗分為陰性對照組(轉(zhuǎn)染NC-sh-RNA)和實驗組(轉(zhuǎn)染FOS-sh-RNA)。在1.5 mL EP管中加入250 μL DMEM無血清培養(yǎng)基，再加入2 μgDNA，另取1 mL EP管加入250 μL DMEM無血清培養(yǎng)基，再加入5 μL轉(zhuǎn)染試劑Lip2000，混勻，室溫靜置5 min后將DNA與轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫放置20 min。吸去6孔板中的培養(yǎng)基，每孔加入1.5 mL的10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，然后再加入500 μL DNA混合液。轉(zhuǎn)染48 h后進行下一步實驗。

1.2.6 Real time-PCR檢測干擾與未干擾組FOS、RTA、LANA和K8.1的基因表達水平

采用Trizol法提取干擾與未干擾細胞的總RNA。按照日本TaKaRa公司的Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA,采用Real-time PCR擴增目的片段,包括LANA、RTA、K8.1、FOS以及β-actin;序列為:LANA-F:5′-AGCCACCGGTAAAGTAGGAC-3′,LANA-R:3′-GATGTGACCTTGGCGATGAC-5′;RTA-F:5′-GAGTCCGGCACACTGTACC-3′,RTA-R:3′-AAACTGCCTGGGAAGTTAACG-5′;K8.1-F:5′-AAAGCGTCCAGGCCACCACAGA-3′,K8.1-R:3′-GGCAGAAAATGGCACACGGTTAC-5′;FOS-F:5′-AATCCGAAGGGAAAGGAATAAGA-3′FOS-R:3′-GTCTCCGCTTGGAGTGTATCAGT-5′;β-actin-F:5′-CGGAACCGCTCATTGCC-3′,β-actin-R:3′-ACCCACATCGTGCCCATCTA-5′。RT-PCR反應(yīng)條件為95 ℃，5min;95 ℃,10 s,55 ℃,30 s,72 ℃,40 s,共計40個循環(huán)。

1.2.7 Western Blot檢測干擾與未干擾組FOS蛋白表達水平

吸出細胞培養(yǎng)液，用1×PBS清洗2 次并棄去液體，加入以1∶100的比例加入PMSF的RIPA裂解液，置于冰上裂解約30 min，然后高速冷凍離心機4 ℃，12 000 r/min，15 min，收集上清液且加入上清液體積1/4的5× loading buffer 100 ℃，10 min煮沸，冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)，電泳80 V，30 min后轉(zhuǎn)110 V，100 min后轉(zhuǎn)膜(電轉(zhuǎn)120 V，60 min)。膜用含5%脫脂奶粉的1×TBST常溫封閉2 h，加入一抗(FOS 1∶500，β-actin 1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，用1×TBST洗膜10 min/次，洗3次。二抗(1∶10 000)室溫靜置孵育2 h，用1×TBST洗膜10 min/次，洗3次，發(fā)光試劑顯色1 min左右進行壓片顯影。

1.2.8 MTT檢測干擾與未干擾組的細胞增殖

胰酶消化瞬時轉(zhuǎn)染48 h后的細胞，制備為單細胞懸液，96孔板每孔接種2000個細胞，每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔 MTT比色法檢測轉(zhuǎn)染后24、48、72 h(37 ℃，5% CO2的條件下)。每孔加入10 μL 5 mg/mL的MTT溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入100 μL二甲基亞砜，置于搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標儀490 nm處測吸光度來檢測細胞增殖活性和生存能力，重復(fù)3次實驗。

1.2.9 流式細胞術(shù)法分析干擾與未干擾組的細胞周期

轉(zhuǎn)染48 h后，收集干擾與未干擾細胞，PBS緩沖液洗滌，胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，去上清，用剩余液體重懸沉淀，加入室溫的PBS 1 mL，將所有的細胞緩慢加入3 mL預(yù)冷的無水乙醇中并置于-20 ℃過夜。第二天將固定好的細胞1 000 r/min離心5 min，棄去乙醇，輕敲試管使沉淀松散，加入室溫PBS 2～5 mL，靜置15 min使細胞再水合。離心棄上清。加入1 mL的DNA staining solution，渦旋混勻5～10 s。室溫避光孵育30 min。然后在流式細胞儀上檢測。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用Prism8.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，兩個樣本之間的比較采用配對樣本t檢驗。檢驗水準α=0.05，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 KSHV病毒體外能夠成功感染神經(jīng)元細胞SH-SY5Y

rKSHV.219是重組病毒，自身帶有綠熒光蛋白(GFP)，使得病毒感染成功后即表達GFP顯綠色熒光。感染72 h后，于熒光顯微鏡下檢測拍照，檢測到GFP表達，說明病毒感染成功(圖1)。

圖1 KSHV感染與未感染SH-SY5Y細胞GFP檢測

2.2 KSHV感染的SH-SY5Y細胞FOS的mRNA表達上調(diào)

提取SK-RG細胞(KSHV感染的SH-SY5Y細胞) RNA作為實驗組，未感染的SH-SY5Y細胞作為對照組，檢測FOS mRNA的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SK-RG細胞中FOS mRNA表達水平高于SH-SY5Y細胞(P=0.0306,N=3)，存在統(tǒng)計學差異(圖2)。

圖2 Real-time PCR檢測FOS的mRNA表達水平

2.3 干擾FOS表達的效率檢測

FOS干擾載體及空載體轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，提取RNA，采用real time-PCR檢測FOS的mRNA表達水平，與空載體轉(zhuǎn)染組相比，干擾載體轉(zhuǎn)染組有效抑制了FOS mRNA的表達(P=0.0365,N=3)，差異有統(tǒng)計學意義(圖3)。

圖3 Real time PCR檢測FOS的干擾效率

2.4 SK-RG細胞中干擾FOS后其蛋白水平下調(diào)

FOS干擾載體及空載體轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，提取蛋白，采用Western blot檢測FOS蛋白的表達水平，與空載體組相比干擾載體能夠有效抑制FOS蛋白的表達(P<0.0231,N=3)，差異有統(tǒng)計學意義(圖4)。

A—sh-NC和sh-FOS的蛋白表達情況 B—sh-NC和sh-FOS的蛋白表達的量化結(jié)果圖4 Western blot法檢測轉(zhuǎn)染后FOS的表達

2.5 干擾FOS后SK-RG細胞中病毒基因LANA、RTA和K8.1表達下調(diào)

采用sh-FOS 干擾表達48 h后，收集細胞，提取RNA，采用real time PCR檢測病毒基因的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與未干擾組相比，干擾FOS基因的表達組KSHV病毒基因LANA、RTA以及K8.1的mRNA的表達水平下調(diào)(圖5)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,N=3)。

圖5 Real time PCR檢測干擾FOS后LANA、RTA和K8.1的表達水平

2.6 干擾FOS表達后SK-RG細胞增殖能力下降

取干擾載體FOS-shRNA轉(zhuǎn)染SK-RG細胞研究其增殖特性，同時以轉(zhuǎn)染空載體的SK-RG細胞作為對照。采用MTT法檢測不同組細胞的增殖能力，由增殖曲線可見干擾FOS后KSHV感染的SH-SY5Y細胞的增殖水平降低(P<0.01,N=3)，表明干擾FOS表達可抑制該細胞的增殖(圖6)。

圖6 MTT法檢測sh-FOS轉(zhuǎn)染SK-RG細胞的增殖能力

2.7 干擾FOS表達后SK-RG細胞出現(xiàn)G0/G1期阻滯

采用流式細胞技術(shù)檢測干擾與未干擾FOS表達(48 h)的細胞周期情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾FOS組的細胞出現(xiàn)了細胞周期G0/G1期阻滯(圖7)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,N=3)。

圖7 干擾FOS表達后細胞周期檢測結(jié)果

3 討論

KSHV是一種雙鏈DNA病毒[12]，其對HIV陽性患者非常敏感。在感染KSHV的個體中，HIV感染者的KS風險要比其他類型的免疫抑制者高。有40%的艾滋病患者合并KS，KS是艾滋病患者最常見的早期臨床表現(xiàn)之一，同時也是引起艾滋病病人死亡的常見病因。隨著AIDS發(fā)病率逐年呈增長趨勢，KS患病率也呈逐年增長趨勢[13]。在HIV陽性合并KSHV的感染者中，有24%的患者出現(xiàn)了散發(fā)性腦膜炎的癥狀[14]。KSHV的感染與患者的神經(jīng)系統(tǒng)的癥狀是否有內(nèi)在的聯(lián)系還需要進一步驗證。

KSHV 感染細胞后可以出現(xiàn)兩種狀態(tài)，即潛伏態(tài)和裂解態(tài)。KSHV DNA在潛伏態(tài)僅表達有限的蛋白質(zhì)，以促進免疫逃逸并保持病毒存活，例如ORF73編碼的潛伏相關(guān)核抗原(latency-associated nuclear antigen，LANA)等，潛伏態(tài)在被環(huán)境等因素刺激下遭到破壞，可能激活靜止的基因組；在裂解狀態(tài)，KSHV基因組變成線性DNA，導致病毒產(chǎn)生，從而使病毒傳播，裂解態(tài)的病毒也表達該時期相應(yīng)的蛋白，例如ORF26，K8.1等，其中ORF50編碼的立早蛋白RTA(Replication and Transcription Activator，RTA)是KSHV由潛伏態(tài)向裂解態(tài)轉(zhuǎn)變的分子開關(guān)[15]，RTA通過誘導裂解基因的表達，控制病毒基因DNA復(fù)制和編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白重組[16]，調(diào)節(jié)和表達宿主基因。而HIV Tat可誘導RTA表達，促進KSHV進入裂解性周期復(fù)制的擴散，并感染更多的細胞[17-18]。

KSHV的致病機制離不開和宿主基因的相互作用，我們通過轉(zhuǎn)錄組測序比較及RT-PCR的驗證發(fā)現(xiàn)FOS基因在KSHV感染的神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y細胞模型中表達上調(diào)。FOS，也稱為c-fos，屬于“直接早期基因”家族，是轉(zhuǎn)錄水平上不同信號傳遞的“中轉(zhuǎn)站”，與目的基因結(jié)合，激活目的基因的轉(zhuǎn)錄活性，完成細胞信號的傳導，被稱為核內(nèi)“第三信使”。研究提示FOS蛋白可能是神經(jīng)元被刺激激活的一種標志，在神經(jīng)元活化、突觸可塑性及神經(jīng)細胞凋亡中發(fā)揮重要作用[17]。通過建立的感染細胞模型，干擾FOS基因的表達，我們進一步分析了FOS對KSHV感染的神經(jīng)元細胞的增殖以及病毒基因表達的影響。我們發(fā)現(xiàn)干擾FOS后能夠抑制此細胞的增殖，干擾后的細胞周期G0/G1期出現(xiàn)了阻滯，并且KSHV病毒基因RTA、LANA、K8.1的表達出現(xiàn)了下調(diào)。這說明FOS基因可能是通過影響細胞周期而對KSHV感染的神經(jīng)元細胞的增殖造成影響的，而影響的具體機制可能與其調(diào)控KSHV致病蛋白的表達相關(guān)。也有研究表明FOS能夠調(diào)控KSHV基因的表達。在KSHV感染的上皮細胞中，F(xiàn)OS通過與多個KSHV啟動子的直接結(jié)合而促進了病毒基因的轉(zhuǎn)錄，這能夠誘導ERK-MAPK的持續(xù)激活，ERK-MAPK信號通路是與細胞增殖密切相關(guān)的信號通路[18]。因此FOS對KSHV感染SH-SY5Y細胞增殖的影響可能與調(diào)控病毒基因的表達相關(guān)，具體為哪些致病蛋白，還需要做進一步的研究。

綜上所述，我們的研究進一步揭示FOS在KSHV感染的神經(jīng)元細胞的增殖中發(fā)揮重要作用，這為尋找此類疾病的藥物靶點奠定理論基礎(chǔ)。