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      膿毒癥大鼠來源的外泌體對WJ-MSC的免疫調控能力的影響

      2020-07-02 02:45:32方均燕宋阿會佟琰丁峰劉英莉
      組織工程與重建外科雜志 2020年3期
      關鍵詞:外泌體空白對照膿毒癥

      方均燕 宋阿會 佟琰 丁峰 劉英莉

      間充質干細胞(MSC)具有多向分化及自我更新能力,可通過自分泌和旁分泌等作用調控免疫性疾病[1-2]。研究發(fā)現,不同來源MSC的免疫調控功能有差異,其中人臍帶華通膠來源的間充質干細胞(WJ-MSC)具備更好的免疫調控作用,其表面HLA-ABC分子較少,免疫原性更低,且來源于丟棄的臍帶,不受倫理限制,更適合應用于臨床治療[3]。MSC分泌的外泌體在其旁分泌機制中發(fā)揮重要作用[4]。外泌體(Exosome)是一種由雙層磷脂分子層包裹的細胞外囊泡,直徑在30~150 nm。外泌體不僅是細胞排泄的代謝廢物,其中還包含多種蛋白質、核酸、磷脂等物質,也能夠發(fā)揮細胞間通訊、細胞遷移、血管新生、腫瘤生長等多種功能[5-6]。外泌體存在于血液、尿液、唾液等體液中,性質穩(wěn)定,不易被破壞,可通過超速離心、蔗糖差速離心、PEG沉淀等方法分離獲得。外泌體常見的表面標志物包括CD9、CD63、CD81等,在透射電鏡(TEM)下可觀察到外泌體具有杯盞狀結構[7]。研究發(fā)現,通過炎癥刺激(如IL-1β、LPS)處理MSC,能夠增強其外泌體的免疫調控能力[8-9]。因此,通過改變WJ-MSC的培養(yǎng)條件,有可能進一步增加其免疫調節(jié)能力。

      膿毒癥是一種由于宿主對感染的免疫反應失調引起的臨床綜合征,由于缺乏早期的診斷和治療,易發(fā)展至多器官功能障礙而危及生命。針對嚴重的膿毒癥,目前尚缺乏特效的治療手段[10]。研究發(fā)現,膿毒癥的發(fā)生以細菌內毒素引起的免疫失調為主,內毒素激活巨噬細胞后,促使其分泌多種促炎性細胞因子(如IL-6、TNF-α、IL-1β等),促進巨噬細胞轉化為促炎型巨噬細胞(M1),進一步加重組織器官的損傷[11-12]。體外研究表明,用LPS刺激THP-1巨噬細胞能夠模擬體內炎癥反應發(fā)生的啟動過程,有助于探究預處理后的WJ-MSC在這一炎癥反應中發(fā)揮的作用。膿毒癥患者外周血中的外泌體在膿毒癥的發(fā)展中發(fā)揮細胞間通訊作用,參與調節(jié)多種免疫細胞的功能,因而有助于膿毒癥的早期診斷和監(jiān)測[13-14]。研究發(fā)現,膿毒癥患者外周血中的外泌體攜帶的hsa-miR-7-5p能夠直接作用于抗凋亡基因,改善T細胞的凋亡,降低膿毒癥大鼠死亡率[15]。結合既往研究,提示膿毒癥大鼠外周血中的外泌體可能具備免疫特性,有望改善WJ-MSC的免疫調控能力。

      本研究探索經膿毒癥大鼠外周血來源的外泌體預處理后的WJ-MSC的細胞活性、凋亡、細胞因子的變化,并與LPS刺激下的THP-1細胞共培養(yǎng),檢測巨噬細胞的炎癥因子變化,以明確膿毒癥大鼠外周血外泌體對WJ-MSC的細胞增殖、凋亡及免疫調節(jié)特性的影響。

      1 材料和方法

      1.1 實驗動物、試劑及儀器

      6~8周雄性SD大鼠,體質量約220 g(上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院中心實驗室)。

      外泌體提取試劑盒(QIAGEN,美國),αMEM培養(yǎng)基、1640完全培養(yǎng)基、10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素(Hyclone,美國),PKH67(Sigma,美國),SYRB試劑盒(Takara,美國)。

      細胞超凈工作臺(Thermo,美國),超速離心機、流式細胞儀(Beckman,美國),倒置熒光顯微鏡(Nikon,日本),酶標儀(BioTek,美國),實時熒光定量PCR儀(ABI,美國)。

      1.2 膿毒癥大鼠模型的建立

      實驗組(n=6):SD大鼠麻醉后打開腹腔,暴露腸道,用棉簽勾出盲腸,將糞便擠壓至盲腸末端,在盲腸末端1/2至2/3間用1號縫線進行結扎,然后用4號針頭在結扎盲端處刺穿盲腸,并擠出少許糞便,然后將盲腸回納至腹腔,逐層縫合腹部皮膚。

      對照組(n=6):僅進行腹腔打開、盲腸勾出等步驟,不結扎穿刺盲腸。

      1.3 大鼠外周血外泌體的提取及鑒定

      造模36 h后,麻醉兩組大鼠,每只大鼠心臟采血5 mL(每組總30 mL),2 000 r/min、4 ℃離心15 min,吸取上層血清,采用外泌體提取試劑盒提取外泌體,電鏡檢查外泌體的形狀,Western-blot檢測外泌體表面標志物CD81和CD63的表達。

      1.4 細胞培養(yǎng)和預處理

      人臍帶華通膠間充質干細胞(WJ-MSC)由上海市第一婦嬰保健院王凱教授課題組捐贈,已完成該原代細胞株的鑒定[16]。WJ-MSC的培養(yǎng)采用αMEM培養(yǎng)基,添加10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素。取第3~7代WJ-MSC細胞以104個/孔接種至96孔板或106個/孔接種于六孔板,待其長至80%融合時分別加入對照組及實驗組大鼠外周血外泌體(20 μg/mL),孵育24 h后,取上清或細胞用作后續(xù)CCK8、Annexin-V-FITC/PI流式細胞檢測。

      兩組外泌體分別用PKH67標記4 h,PBS洗去多余的染料。將WJ-MSC細胞與標記的外泌體共孵育24 h,然后用DAPI染WJ-MSC細胞核,鬼筆環(huán)肽染細胞骨架,使細胞核及骨架可視化。熒光顯微鏡觀察染色的WJ-MSC外泌體(綠色)、細胞核(藍色)及細胞骨架(紅色)的位置。

      人單核巨噬細胞(THP-1細胞)來源于中國細胞庫,采用1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清,1%青霉素和鏈霉素)進行培養(yǎng),先用佛潑酯(PMA,160 ng/mL)誘導成貼壁狀態(tài),再用LPS(100 ng/mL)進行培養(yǎng),或將各組外泌體預處理后的WJ-MSC聯合LPS與其共培養(yǎng)。實驗分為4組:未處理的THP-1細胞(空白組)、THP-1細胞+LPS(LPS組)、THP-1細胞+LPS+對照組外泌體(LPS+Ne組)、THP-1細胞+LPS+實驗組外泌體(LPS+Ce組)。

      1.5 CCK8檢測細胞活性

      取經過各組外周血外泌體預處理的WJ-MSC(1×106個),未處理的WJ-MSC作為空白對照組。實驗分為3組:未處理的WJ-MSC(空白對照組)、對照組外泌體預處理的WJ-MSC(Ne組,即對照組)、實驗組外泌體預處理的WJ-MSC(Ce組,即實驗組)。各孔加入10 μL CCK8,37 ℃孵育4 h后,用微孔酶標儀檢測各孔在450 nm處的吸光值,Graphpad 5分析各組差異。

      1.6 Annexin-V-FITC/PI檢測細胞凋亡

      取經過各組外周血外泌體預處理的WJ-MSC(1×106個),未處理的WJ-MSC作為空白對照組。實驗分為3組:未處理的WJ-MSC(空白對照組)、對照組外泌體預處理的WJ-MSC(Ne組,即對照組)、實驗組外泌體預處理的WJ-MSC(Ce組,即實驗組)。用0.25%胰蛋白酶消化各孔細胞,其余各孔細胞消化后1 000 r/min離心5 min,舍棄上清,用100 μL Annexin Buffer重懸后加入4 μL Annexin V,避光孵育10 min,加入4 μL PI,立即上機檢測,結果用CytExpert軟件進行分析。

      1.7 qPCR檢測細胞因子的表達

      分別取3組WJ-MSC細胞與4組THP-1細胞,用TRIzol法提取各組細胞總mRNA,逆轉錄為cDNA,接著用SYRB試劑盒進行實時定量PCR檢測,以GAPDH為內參基因,檢測細胞因子(IL-6、IL-10、TNF-α、IL-1β)的表達。計算各組各細胞因子的RQ值(表1)。

      1.8 數據處理及統計學分析

      所有實驗均用GraphPad軟件統計分析三次獨立實驗結果,計算各組間均值和標準差,多組間差異比較用ANOVA one-way檢驗,P<0.05表示差異有統計學意義。

      2 結果

      2.1 鑒定各組大鼠外周血來源的外泌體

      為了確定分離提取大鼠外周血來源外泌體的方法可靠,本實驗使用電鏡拍攝各組外泌體的形狀,Western-blot檢測其表面標志物,外泌體吞噬實驗檢測兩組外泌體被WJ-MSC吞噬的能力。電鏡結果顯示,對照組和實驗組外泌體形狀一致,似杯盞狀,直徑相似。Western-blot結果顯示對照組和實驗組的外泌體均能表達外泌體表面標志物CD63和CD81(圖1 A、B)。

      兩組外泌體經PKH67標記(綠色)后,與WJ-MSC細胞共孵育。結果顯示,標記了PKH67的外泌體(綠色)圍繞著DAPI染色的細胞核(藍色),這表明兩種外泌體類型都能被WJ-MSC細胞攝取,且吞噬能力無明顯差異(圖1C)。

      2.2 各組大鼠外周血外泌體對WJ-MSC增殖、凋亡的影響

      流式細胞儀檢測發(fā)現,與空白對照組相比,Ne組和Ce組中WJ-MSC的凋亡細胞比例均明顯下降(P<0.01),但Ne組和Ce組之間無明顯差異(P>0.05)。CCK8結果顯示,與空白對照組相比,Ne組和Ce組中WJ-MSC的細胞增殖無明顯差異(P>0.05)(圖2)。

      2.3 各組大鼠外周血外泌體對WJ-MSC分泌的細胞因子的影響

      qPCR結果表明,與空白對照組相比,Ne組IL-10的mRNA表達降低,Ce組IL-10的mRNA表達則增加,差異均具有統計學意義(P<0.01);且與Ne組相比,Ce組IL-10的mRNA表達也明顯增加(P<0.01);與空白對照組相比,Ne組WJ-MSC細胞中TNF-α的mRNA表達明顯增加(P<0.01);與Ne組相比,Ce組中TNF-α的mRNA表達降低,兩組之間具有統計學差異(P<0.05)(圖3)。

      A:電鏡下外泌體的形狀;B:Western-blot檢測外泌體上CD81和CD63的表達;C:熒光顯微鏡下觀察外泌體被WJ-MSC細胞的攝取a: The shape of exosomes observed under electron microscope; B: Expressions of CD81 and CD63 on exosomes detected by Western-blot; C: The uptake of exosomes by WJ-MSC observed under fluorescence microscope圖1 各組外泌體的鑒定Fig. 1 Identification of exosomes of each group

      A、B:流式細胞儀檢測外泌體處理WJ-MSC后的凋亡細胞比例;C:CCK8檢測外泌體對WJ-MSC細胞活性的影響 A, B: The proportion of apoptotic cells after exosome treated with WJ-MSC detected by flow cytometry; C: The effects of exosomes on the activity of WJ-MSC detected by CCK8圖2 各組外泌體對WJ-MSC細胞增殖及凋亡的影響(**: 與空白對照組相比,P<0.01)Fig. 2 Effects of exosomes on proliferation and apoptosis of WJ-MSC in each group (**: compared with blank control group, P<0.01)

      A:IL-10;B:TNF-α(**: 與空白對照組相比,P<0.01; &: 與Ne相比,P<0.05; &&: 與Ne相比,P<0.01)a: IL-10; B: TNF-α(**: compared with blank control group, P<0.01; &: compared with Ne group, P<0.05; &&: compared with Ne group, P<0.01)圖3 qPCR檢測各組外泌體對WJ-MSC中細胞因子mRNA水平的影響Fig. 3 Effects of exosomes on mRNA levels of cytokines in WJ-MSC detected by qPCR of each group

      2.4 各組大鼠外周血外泌體對WJ-MSC免疫調控能力的影響

      qPCR的結果顯示,與空白對照組相比,LPS組、LPS+Ne組和LPS+Ce組IL-10的mRNA水平均顯著升高(P<0.01);與LPS組相比,LPS+Ne組和LPS+Ce組中IL-10的mRNA水平略有升高,但無統計學差異(P>0.05);LPS+Ne組和LPS+Ce組之間IL-10的mRNA水平無明顯差異(P>0.05)。

      與空白對照組相比,LPS組、LPS+Ne組和LPS+Ce組IL-6的mRNA水平均明顯升高(P<0.05);LPS+Ne組和LPS+Ce組較LPS組該指標均有所增加,但差異無統計學意義(P>0.05);LPS+Ne組和LPS+Ce組之間IL-6的mRNA水平無明顯差異(P>0.05)。

      與空白對照組相比,LPS組、LPS+Ne組和LPS+Ce組IL-1β的mRNA水平均顯著升高(P<0.01);與LPS組相比,LPS+Ne組和LPS+Ce組中IL-1β的mRNA水平均顯著下降(P<0.01);但是,LPS+Ne組和LPS+Ce組之間的IL-1β的mRNA水平無明顯變化(P>0.05)。

      與空白對照組相比,LPS組TNF-α的mRNA水平明顯升高(P<0.01);與LPS組相比,LPS+Ne組和LPS+Ce組TNF-α的mRNA水平均明顯下降(P<0.01);但LPS+Ne組和LPS+Ce組之間TNF-α水平無明顯差異(P>0.05)(圖4)。

      A:IL-10;B:IL-6;C:IL-1β;D:TNF-α(**: 與空白對照組相比,P<0.01; &&: 與LPS組相比,P<0.01)a: IL-10; B: IL-6; C: IL-1β; D: TNF-α(**: compared with blank control group, P<0.01; &&: compared with LPS group, P<0.01)圖4 qPCR檢測不同預處理后WJ-MSC對LPS誘導下THP-1細胞中細胞因子mRNA水平的影響Fig. 4 qPCR was used to detect the effects of different pretreatment of WJ-MSC on the mRNA levels of cytokines in THP-1 cells induced by LPS

      3 討論

      外泌體作為一種細胞外囊泡,由供體細胞通過胞吐方式分泌,再以胞吞形式被受體細胞攝取,釋放攜帶的多種物質,調節(jié)受體細胞的多項功能[17]。本研究提取了兩組大鼠外周血來源的外泌體,并通過Western-blot驗證了外泌體標志物的表達,電鏡下觀察到類似杯盞狀結構,證明了提取方法的可靠性及穩(wěn)定性。通過外泌體吞噬實驗,驗證了兩種外泌體均能夠被WJ-MSC細胞攝取。目前研究認為,膿毒癥外周血來源的外泌體作為一個混合物,包含來自免疫細胞、血細胞等多種類型細胞的信息,能夠發(fā)揮促血栓形成、促炎癥、介導內皮功能障礙或抗炎等作用,由病原微生物種類、宿主免疫狀態(tài)等決定其發(fā)揮保護或損傷作用[18-20]。Exline等[21]認為,膿毒癥外周血來源的外泌體能夠釋放caspase-1,誘導淋巴細胞凋亡。本研究發(fā)現,膿毒癥外周血來源的外泌體也能夠抑制WJ-MSC的細胞凋亡,但不影響其細胞增殖活性,具體作用機制仍需進一步研究。

      既往研究提示,MSC經缺氧、炎性因子、細菌及藥物等預處理后,所得外泌體具有更強的免疫調控能力,如LPS預處理后的MSC-EV,具有更加優(yōu)化的免疫調控能力,可以促使巨噬細胞向M2型極化增加,降低促炎性細胞因子水平(IL-1β,IL-6和TNF-α),降低膿毒癥死亡率[9]。另外還發(fā)現,經過膿毒癥外周血來源的外泌體預處理后的單核細胞,在LPS刺激下,分泌的TNF-α含量顯著降低,提示其能夠增強單核細胞的免疫耐受能力[22]。以上結果提示膿毒癥外周血外泌體有望成為增強WJ-MSC的免疫能力的刺激物。與在淋巴細胞中的研究發(fā)現類似,本研究發(fā)現,膿毒癥大鼠外周血來源的外泌體能夠促進WJ-MSC細胞中抗炎因子(IL-10)的mRNA水平表達,下調促炎性因子(TNF-α)的mRNA水平表達,可能增強了WJ-MSC的免疫調控能力。

      MSC通過自分泌或者旁分泌的方式,分泌細胞因子、趨化因子以及外泌體等,參與多種免疫性疾病的調節(jié)。為了進一步驗證兩種外泌體對WJ-MSC免疫調控能力的影響,我們利用細胞共培養(yǎng)體系,將經過兩種外泌體預處理的WJ-MSC與LPS誘導下THP-1細胞共培養(yǎng),檢測THP-1細胞中細胞因子的mRNA水平表達變化。結果表明,經過兩種外泌體預處理后的WJ-MSC均能夠降低THP-1細胞中促炎性因子(TNF-α、IL-1β)的mRNA水平,但兩組之間無明顯差異,表明膿毒癥大鼠外周血外泌體并不能更好地逆轉LPS刺激的THP-1細胞的急性炎癥反應。

      本研究首次驗證了膿毒癥外周血外泌體能夠抑制WJ-MSC的細胞凋亡,上調IL-10的表達,抑制TNF-α的表達,但并不能增強其對LPS刺激下THP-1細胞中炎性因子的抑制作用。但是,膿毒癥外周血外泌體發(fā)揮抑制WJ-MSC細胞凋亡及細胞因子水平的具體機制仍需進一步探究。此外,仍需探究經兩種外泌體預處理的WJ-MSC對LPS誘導下THP-1細胞的吞噬等功能的影響。

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