梁華，聞宏妍，朱明雪，李奇瑋，西旺，閆起，王燕，李澤光

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.大連大學(xué)，遼寧 大連 116622；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

《宋·太平惠民和劑局方》卷三方之四君子湯，又名白術(shù)湯，是主治榮衛(wèi)氣虛的經(jīng)典基礎(chǔ)方劑，“補(bǔ)中有瀉，平和中正，不偏不倚”。汪昂《醫(yī)方集解》曰：“以其皆中和之品，故曰君子也?！狈街兴奈端幬锝云胶椭罚黄皇?，不熱不燥，補(bǔ)而不峻，益而無(wú)害，取“君子致中和”之義，故名“四君子湯”[1]。清代醫(yī)家張璐《傷寒緒論》指出:“氣虛者,補(bǔ)之以甘,參、術(shù)、苓、草,甘溫益胃,有健運(yùn)之功,具沖和之德,故為君子?！北痉矫玖x故顯于此[2-3]。后世眾多補(bǔ)脾益氣方劑多從此方衍化而來(lái)[4]。

代謝組學(xué)技術(shù)有著整體化、微觀化等特點(diǎn),將代謝組學(xué)技術(shù)與中醫(yī)藥復(fù)雜理論體系研究的基本思想、特點(diǎn)優(yōu)勢(shì)結(jié)合[5]。利用組學(xué)技術(shù)為挖掘中醫(yī)藥效能提供新的研究途徑[6]。繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后代謝組學(xué)成為了系統(tǒng)生物學(xué)的另一重要的組成部分[7]，作為新發(fā)展起來(lái)的學(xué)科從不同于基因組蛋白組的新角度來(lái)觀察生物體的狀態(tài)[8]。本課題組前期已做大量實(shí)驗(yàn)研究，探究經(jīng)典補(bǔ)益劑作用于小鼠增齡過(guò)程各階段與衰老相關(guān)的代謝物質(zhì)發(fā)展變化的過(guò)程[9-16]。本實(shí)驗(yàn)基于代謝組學(xué)技術(shù)研究四君湯干預(yù)下的16月齡小鼠與衰老相關(guān)的血漿內(nèi)源性小分子代謝物質(zhì)的變化。

1 材料

1.1 動(dòng)物

選取30只3月齡體質(zhì)量(40±2)g的SPF級(jí)ICR雌性小鼠(遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，許可證批號(hào)：SCXK(遼)2010-0001)。飼養(yǎng)于溫度(22±2)℃，濕度 (55±15)%的室內(nèi)，給予固體飼料，自由飲水。

1.2 藥物及湯液制備

茯苓、人參、甘草、白術(shù)中藥飲片采購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》擬定制備方法，四君子湯以質(zhì)量比3∶3∶3∶2將人白茯甘四味中藥混合，浸泡后加水(藥液∶水=1∶8)，煎煮30 min過(guò)濾，提取藥液。把所濾得的藥渣與水1：8混合后重復(fù)以上煎煮過(guò)濾過(guò)程，將2次煎煮的濾液混合。將設(shè)備調(diào)至80 ℃，0.09 MPa，進(jìn)行減壓濃縮并回收，獲得生藥液后配制為0.33 g/mL的質(zhì)量濃度。

1.3 試劑及儀器

見表1。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

本實(shí)驗(yàn)將30只雌性小鼠隨機(jī)分為每組10只的3月齡對(duì)照組、16月齡空白組及16月齡給藥組。將3月齡對(duì)照組小鼠每日早晨8：00-8：30用0.9%濃度的NaCl溶液灌胃，重復(fù)相同操作持續(xù)30 d，取材后冷藏于-80℃冰箱。其余兩組小鼠，正常飼養(yǎng)到16個(gè)月，到16月齡后，16月齡空白組每日早晨8：00—8：30用0.9%濃度的NaCl溶液灌胃。16月齡給藥組用0.33 g/mL藥液灌胃。按照小鼠每6天的體質(zhì)量變化，調(diào)整小鼠給水給藥劑量。

表1 實(shí)驗(yàn)試劑、設(shè)備及生產(chǎn)公司

2.2 樣品的采集、制備

小鼠飼養(yǎng)方法：1～30 d，給藥給水；30 d后，只提供飲水；第31天，采血管中加入肝素鈉，取眼球血靜置于其中6 h，4 ℃下保持3 500 r/min離心5 min，分離出血漿，置于-80 ℃冰箱。取出冷藏后的小鼠血漿，容量比例為每200 μL血漿加入1 mL甲醇，4℃下保持12 000 r/min離心3 min后，靜置15 min抽取上層清液，再一次4 ℃下保持12 000 r/min離心3 min，抽取200 μL上清液進(jìn)行UPLC-MS分析。

2.3 色譜、質(zhì)譜條件

色譜柱Acquity UPICTM BEH C18(1.7μm,2.1 mm×50 mm)(Waters公司，美國(guó))；柱溫40 ℃；樣品倉(cāng)溫保持4℃。見表2，3。

表2 UPLC流動(dòng)相梯度洗脫程序

注：A：0.1%甲酸-乙腈溶液，B：0.1%甲酸-超純水溶液

表3 電噴霧離子源正負(fù)離子模式程序

2.4 多元數(shù)據(jù)分析

結(jié)合Markerlynx V4.1 softwware、ProgenesisQI 2.1 softwware和 EZnifo softwware模塊對(duì)3月齡對(duì)照組、16月齡空白組及16月齡給藥組小鼠血液代謝輪廓數(shù)據(jù)采用主成分分析和正交偏最小二乘-判別分析法，以VIP(variable importance in the project)值作為參照篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選VIP值>1的物質(zhì)。

2.5 標(biāo)志物的確定

運(yùn)用QI2.1軟件處理, 利用超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜，通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)HMDB、KEGG、Metabo Analyst等檢索差異性代謝物及其所參與的代謝通路，探討標(biāo)志物及代謝通路的增齡性變化。

3 結(jié)果

3.1 小鼠血漿代謝輪廓分析

取3月齡對(duì)照組、16月齡空白組及16月齡給藥組血漿樣本，按照血漿樣品制備方法處理，利用己建立的UPLC- HDMS分析模式進(jìn)行對(duì)上述血漿樣品正、負(fù)離子模式全掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血漿代謝輪廓出現(xiàn)明顯差異。小鼠血漿代謝物的PCA分析下， X矩陣解釋率R2X>0.4。本實(shí)驗(yàn)樣品在正離子模式負(fù)離子模式下R2X、R2Y值均符合條件，見圖1。

3.2 小鼠血液標(biāo)記物的鑒定

將3月齡對(duì)照組、16月齡空白組血液樣本進(jìn)行正負(fù)離子模式全掃描，并對(duì)3月齡對(duì)照組、16月齡空白組小鼠血液代謝數(shù)據(jù)進(jìn)行OPIS-DA分析(R2Y>0.5、Q2>0.5)，得到Score Plot 2D、Score Plot3D、VIP-Plot、S-Plot圖(見圖2，3，4)，從而找到對(duì)代謝輪廓變化起關(guān)鍵性作用的內(nèi)源性代謝物。將潛在生物標(biāo)記物篩查條件設(shè)為P<0.05，VIP貢獻(xiàn)值大于1，分析確定內(nèi)源性生物標(biāo)記物。利用UPLC-HDMS檢測(cè)標(biāo)記物，在human metabolome database及Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索后，結(jié)合Progenesis Q1 2.1 software進(jìn)行化合物鑒定。篩選出可能與衰老相關(guān)的37個(gè)潛在標(biāo)記物(見表4)。

注:A.正離子模式；B.負(fù)離子模式圖1 3月齡對(duì)照組、16月齡空白組及16月齡給藥組小鼠血液樣品PCA模式識(shí)別分析Score plot圖

注:A1.正離子模式-2D圖；A2.正離子模式-3D圖；B1.負(fù)離子模式-2D圖；B2.負(fù)離子模式-3D圖圖2 3月齡對(duì)照組、16月齡空白組雌性小鼠血液樣品PCA分析后的Scores plot圖

表4 正負(fù)離子條件下16月雌鼠血液樣品生物標(biāo)志物(VIP>1)

注：*表示該物質(zhì)VIP值大于2

注：A.正離子模式;B.負(fù)離子模式圖3 16月齡空白組、16月齡給藥組小鼠血液樣品OPLS-DA模式識(shí)別分析后VIP散點(diǎn)圖

注:A.正離子模式;B.負(fù)離子模式圖4 16月齡空白組、16月齡給藥組小鼠血液樣品OPLS-DA模式識(shí)別分析后S-Plot圖

4 討論

16月齡相較于3月齡雌性小鼠血漿代謝標(biāo)志物有明顯的增齡性變化。在正負(fù)離子模式下通過(guò)分析3月齡與16月齡空白組小鼠代謝標(biāo)志物在其體內(nèi)變化情況，確定了代謝標(biāo)志物中12個(gè)代謝標(biāo)志物含量在小鼠3月齡時(shí)達(dá)到峰值，但隨著小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育逐漸消耗降低，它們分別參與了氨酰基-tRNA的生物合成，生物素代謝，賴氨酸降解，色氨酸代謝等13條代謝途徑；25個(gè)代謝標(biāo)志物在小鼠體內(nèi)的含量隨生長(zhǎng)發(fā)育積累增加，參與了酪氨酸代謝、嘧啶代謝、甘油磷脂代謝等8條代謝途徑；當(dāng)取VIP值大于1時(shí)，鑒定得到的37個(gè)與衰老相關(guān)的潛在的生物標(biāo)記物內(nèi)，四君子湯干預(yù)下對(duì)16個(gè)代謝標(biāo)志物起到了調(diào)節(jié)作用，其中14個(gè)具有顯著性意義：Palmitaldehyde，Stearaldehyde，Glycerophosphocholine，12-Hydroxy-12-octadecanoylcarnitine，Behenic acid，4-Fumarylacetoacetic acid，L-Tryptophan，Taurodeoxycholic acid，Lactosylceramide (d18:1/12:0)，Taurochenodeoxycholate-3-sulfate，(23S)-23,25-dihdroxy-24-oxovitamine D3 23-(beta-glucuronide)，13S-hydroxyoctadecadienoic acid，(3a,5b)-24-oxo-24-[(2-sulfoethyl)amino]cholan-3-yl-b-D-Glucopyranosiduronic acid，L-Dihydroorotic acid，5-Methoxytryptophol。他們參與了色氨酸代謝，酪氨酸代謝，嘧啶代謝，不飽和脂肪酸的生物合成，甘油磷脂代謝，鞘脂代謝，亞油酸代謝等多項(xiàng)代謝通路。VIP值篩選大于2時(shí)，鑒定得到的15個(gè)與衰老相關(guān)的潛在的生物標(biāo)記物，對(duì)3個(gè)代謝標(biāo)志物起到了調(diào)節(jié)作用(3個(gè)都具有顯著性意義)：5-Methoxytryptophol、4-Fumarylacetoacetic acid、Behenic acid。主要參與了酪氨酸代謝。

以上結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)VIP大于2時(shí)，四君子湯干預(yù)下回調(diào)的主要功能代謝物是4-富馬酰乙酰乙酸(4-Fumarylacetoacetic acid)，該物質(zhì)所參與的是酪氨酸代謝。酪氨酸是一種非必需氨基酸，與情緒，新陳代謝，治療慢性疲勞等疾病有著密切的聯(lián)系。酪氨酸分解產(chǎn)生4-羥基苯基丙酮酸，4-羥苯基丙酮酸與稱為I型酪氨酸血癥的代謝性疾病有關(guān)。4-羥基苯基丙酮酸是一種潛在的有毒化合物，關(guān)于人類的4-羥基苯基丙酮酸被發(fā)現(xiàn)與多種疾病有關(guān)。4-羥基苯基丙酮酸轉(zhuǎn)化成高純酸(檸檬酸)，其是計(jì)時(shí)色素的前體之一。高純酸可以氧化二聚形成河馬豆酸。如果含量足夠高，高純酸可用作骨毒素和腎毒素。骨毒素是導(dǎo)致骨骼或關(guān)節(jié)受損的物質(zhì)，腎臟毒素會(huì)損害腎臟。積累的高純酸會(huì)損壞軟骨(變時(shí)性，導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎)和心臟瓣膜，還會(huì)沉淀成腎結(jié)石和其他器官的結(jié)石。更具體而言，高純酸可以轉(zhuǎn)化為苯醌乙酸(BQA)，并且所得的BQA可以輕松轉(zhuǎn)化為類似于深色皮膚色素黑色素的聚合物。這些聚合物沉積在膠原(一種結(jié)締組織蛋白，特別是諸如軟骨的組織)中。這個(gè)過(guò)程被稱為年老癥。卵巢組織變硬，異常脆弱，損害其正常功能并造成損害。4-富馬酰乙酰乙酸是酪氨酸代謝的中間產(chǎn)物之一。富馬酸乙酰乙酸酯水解酶(FAH)是一種催化4-富馬酸乙酰乙酸酯水解為富馬酸酯和乙酰乙酸酯的酶。FAH是酪氨酸分解代謝途徑中的最后一種酶。FAH缺乏與1型遺傳性酪氨酸血癥有關(guān)。在酪氨酸分解代謝至4-富馬酰乙酰乙酸的途徑中產(chǎn)生的4-羥基苯基丙酮酸、高純酸積累后均會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生毒性積累而致病。本實(shí)驗(yàn)觀察到四君子湯干預(yù)調(diào)節(jié)的小鼠體內(nèi)4-富馬酰乙酰乙酸含量較16月齡空白組降低，表明四君子湯產(chǎn)生了有利于機(jī)體健康的調(diào)節(jié)作用，減少了酪氨酸代謝過(guò)程中產(chǎn)生的毒素積累。

代謝標(biāo)志物L(fēng)-色氨酸(HMDB00929)是一種必需氨基酸，它參與了色氨酸代謝。色氨酸代謝后形成5-羥色胺(5-HT)和犬尿氨酸[17]。犬尿酸、黃尿酸、吲哚乙酸和5-羥吲哚乙酸自尿中排出。血清素(5-HT)是重要的神經(jīng)遞質(zhì)和旁分泌信號(hào)分子，已知具有多種生物學(xué)功能。游離L-色氨酸經(jīng)氧化脫羧后轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥色胺, 主要存在于腦組織、特別是在胃腸道內(nèi)[18]，它主要負(fù)責(zé)維持營(yíng)養(yǎng)吸收和運(yùn)動(dòng)[19]。衰老是許多使人衰弱的疾病(包括癌癥和神經(jīng)退行性疾病)的重要危險(xiǎn)因素[20]。最近在多種生物中的研究表明色氨酸代謝是與年齡有關(guān)的疾病和壽命的有力調(diào)節(jié)劑。它在整個(gè)進(jìn)化過(guò)程中的高度保守性使研究可以開始剖析單個(gè)酶和代謝產(chǎn)物的作用[21]。本實(shí)驗(yàn)中，與16月齡對(duì)照組相比，16月齡給藥組的L-色氨酸含量明顯回調(diào)，表明四君子湯對(duì)小鼠的抗衰具有一定的積極作用。

Behenic acid(HMDB00944)參與了不飽和脂肪酸的生物合成。不飽和脂肪酸對(duì)人體的缺乏癥和內(nèi)源性疾病有積極的防治作用[22-23]，促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育，調(diào)節(jié)刺激生長(zhǎng)激素、促腎上腺皮質(zhì)激素、抗利尿激素、性腺激素的釋放[24]。

共軛亞油酸(conjugated linoleic acid)有利于防止大鼠動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，通過(guò)調(diào)節(jié)組織中脂肪酸的代謝來(lái)維持組織中脂肪酸的平衡；當(dāng)CLA少量攝入時(shí)，生物體Sod的分子活性增加從而保護(hù)機(jī)體[25]。

綜上所述，小鼠在自然增齡過(guò)程中，體內(nèi)的酪氨酸代謝、色氨酸代謝、不飽和脂肪酸的生物合成等這些代謝通路發(fā)生了紊亂，在四君子湯的干預(yù)下發(fā)生轉(zhuǎn)歸，揭示了四君子湯對(duì)16月齡小鼠血漿內(nèi)源性代謝物質(zhì)的顯著影響。然而，四君子湯中四藥合參相互協(xié)同，基于代謝組學(xué)的研究下，我們可以對(duì)機(jī)體的調(diào)節(jié)有整體把握，但很難判斷出起決定作用的位點(diǎn)。是否可以找出一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)更小范圍的作用位點(diǎn)，抑或是這種起決定性作用的位點(diǎn)是否存在？此外，我們猜想經(jīng)過(guò)四君子湯干預(yù)后的VIP值越大的血漿代謝物是否意味著更有價(jià)值？這些問(wèn)題還需要我們進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)和探索。