當(dāng)歸芍藥散活血利水不同配伍對(duì)缺血性腦卒中小鼠神經(jīng)再生的影響

李思頡，楊勇，李海燕，高晨，任長(zhǎng)虹*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院，低氧適應(yīng)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100053; 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院方劑教研室,北京 100029)

腦中風(fēng)以其高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高致殘率、高死亡率及逐年遞增的防治費(fèi)用成為危害我國(guó)居民健康最為嚴(yán)重的疾病之一，其人群的疊加效應(yīng)和快速增長(zhǎng)給社會(huì)、家庭造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神壓力，已成為嚴(yán)重影響國(guó)計(jì)民生的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題[1-2]，因此探討有效的治療藥物，積極改善患者的預(yù)后，意義重大。

當(dāng)歸芍藥散(DSS)對(duì)腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用已得到共識(shí)[3]，當(dāng)歸芍藥散全方六味藥分為兩組，一是以當(dāng)歸、芍藥、川芎調(diào)肝理血；一是以白術(shù)、茯苓、澤瀉健脾調(diào)津。全方三血三水之品相濟(jì)并用，共奏調(diào)肝健脾，活血利水之功。當(dāng)歸芍藥散發(fā)揮其治療作用，是與其獨(dú)特的配伍結(jié)構(gòu)和活血利水的功效不能分割的。我們前期研究結(jié)果顯示，當(dāng)歸芍藥散原方配伍可以增加缺血性腦卒中小鼠的神經(jīng)再生[4]。本研究采用小鼠遠(yuǎn)端大腦中動(dòng)脈結(jié)扎模型(dMCAO)，探討當(dāng)歸芍藥散活血、利水不同配伍對(duì)腦缺血損傷神經(jīng)保護(hù)及神經(jīng)再生的貢獻(xiàn)度，以期從微觀層次上解讀中藥復(fù)方的效應(yīng)機(jī)制，豐富中醫(yī)活血利水法在缺血性腦血管病治療的內(nèi)涵，并為當(dāng)歸芍藥散在臨床的優(yōu)化配伍及用于缺血性腦血管病的治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)C57/BL6雄性小鼠，體質(zhì)量20～24 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，SCXK(京)2007-0001。飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度(22±2)℃，相對(duì)濕度(45±5)%，日照時(shí)間12 h。小鼠分籠喂養(yǎng)，每5只1籠，自由攝食飲水。

1.2 藥物及制備

當(dāng)歸芍藥散組成(當(dāng)歸、川芎、白芍、澤瀉、茯苓、白術(shù)，當(dāng)歸、川芎、白芍、澤瀉、茯苓、白術(shù))，飲片購(gòu)自同仁堂，采用醇提水沉法提取各個(gè)樣品，按照1∶5 w/v的比例加入95%乙醇室溫過(guò)夜，然后煮沸2次，每次2 h。過(guò)濾離心后留取提取液，剩余藥物殘?jiān)尤胝麴s水(1∶4 w/v)煮沸兩次，每次1 h。過(guò)濾離心留取提取液，將兩次的提取液混合測(cè)濃度，調(diào)至1 g/mL，4 ℃冷藏。

1.3 主要試劑

恩氟烷(河北九派制藥)，水合氯醛(化學(xué)純，天津大茂化學(xué)試劑廠)，2,3,5氯化三苯基四氮唑藍(lán)(TTC，Sigma公司)，抗BDNF抗體及抗CXCR4抗體(Cells Signaling Technology公司)，抗DCX抗體(Santa Cruze公司)，抗BrdU抗體(Sigma公司)，免疫熒光二抗(Lifetechnologies公司)。

1.4 主要實(shí)驗(yàn)器材

小動(dòng)物肛溫檢測(cè)儀器(上海生物技術(shù)儀器有限公司)，手術(shù)器械(上海醫(yī)療器械公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大腦中動(dòng)脈遠(yuǎn)端阻塞模型(dMCAO)

小鼠稱(chēng)體質(zhì)量后，面罩吸入1%～2%恩氟烷于30%O2和70%N2O的混合氣體中維持麻醉，術(shù)中監(jiān)測(cè)肛溫，維持在(37±0.2)℃。將右側(cè)頭部及頸部腹側(cè)的毛發(fā)剃除。局部皮膚用0.5%聚烯吡酮磺和75%乙醇消毒。將雙側(cè)頸總動(dòng)脈與周?chē)M織分離出來(lái)，并用顯微彎鑷將雙側(cè)頸總動(dòng)脈挑起。小鼠呈右側(cè)位放置，在左側(cè)眼外眥至外耳道之間作一長(zhǎng)約0.5 cm切口。暴露顳肌，在顯微鏡下小心剪開(kāi)顳肌，此時(shí)能隱約看到顱骨下的大腦中動(dòng)脈皮層的分支，用顱骨鉆輕輕鉆一個(gè)小口，直徑約2 mm，暴露皮層支，用顯微彎鑷鉤住大腦中動(dòng)脈并將其電凝阻斷。用小血管動(dòng)脈夾阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈，15 min后松開(kāi)并去除小血管夾，在切口處噴灑0.05 mL 0.25%布比卡因，縫合傷口。此模型具有與人的腦缺血發(fā)病模式較為近似的臨床特點(diǎn)。

2.2 動(dòng)物分組及給藥

實(shí)驗(yàn)分為7組，Sham組、空白對(duì)照組、原方組、活血2組、利水2組、活血倍量組、利水倍量組。每組按照以下藥物比例配伍：原方組：當(dāng)歸、川芎、白芍、澤瀉、茯苓、白術(shù)分別為68.3 mg/kg、68.3 mg/kg、363.8 mg/kg、181.9 mg/kg、91.0 mg/kg、91.0 mg/kg；活血組2組：當(dāng)歸、川芎、白芍分別為136.6 mg/kg、136.6 mg/kg、727.6 mg/kg；利水組2組：澤瀉、茯苓、白術(shù)分別為363.8 mg/kg、180.2 mg/kg、180.2 mg/kg；活血倍量組：當(dāng)歸、川芎、白芍、澤瀉、茯苓、白術(shù)分別為136.6 mg/kg、136.6 mg/kg、727.6 mg/kg、181.9 mg/kg、91.0 mg/kg、91.0 mg/kg；利水倍量組：當(dāng)歸、川芎、白芍、澤瀉、茯苓、白術(shù)分別為68.3 mg/kg、68.3 mg/kg、363.8 mg/kg、363.8 mg/kg、180.2 mg/kg、180.2 mg/kg；Sham組及空白對(duì)照組只灌注等體積的生理鹽水。dMCAO手術(shù)后立即灌胃給予DSS，每日1次直到取材。

2.3 神經(jīng)功能評(píng)分

采用兩種神經(jīng)功能評(píng)分方法。圓筒實(shí)驗(yàn)：將小鼠放入高25 cm，直徑8 cm的透明圓筒中，記錄10 min內(nèi)小鼠患側(cè)(C)、健側(cè)(I)及雙前肢(B)觸碰圓筒壁的次數(shù)。計(jì)算公式為[I/(I+C+B)]-[C/(I+C+B)]×100%。貼條去除實(shí)驗(yàn)：從籠子中取出動(dòng)物，使用長(zhǎng)0.4 cm寬0.3 cm的長(zhǎng)方形粘性標(biāo)簽粘貼在動(dòng)物的兩個(gè)前肢，而后將動(dòng)物置于直徑10 cm、高30 cm的透明圓筒中。分別記錄動(dòng)物的嘴觸碰到貼條的時(shí)間，以及動(dòng)物從每一個(gè)前肢上扯掉貼條所需的時(shí)間，允許扯掉貼條所需的時(shí)間最多為2 min。實(shí)驗(yàn)的前3 d進(jìn)行訓(xùn)練以篩選實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，每天每只動(dòng)物進(jìn)行3次訓(xùn)練。

2.4 免疫熒光化學(xué)染色

小鼠深麻醉，使用生理鹽水由心臟灌注固定，取腦后固定于4% PFA，放在4 ℃冰箱，經(jīng)30%蔗糖脫水，至腦組織自然沉淀，冰凍切片20 μm。用5% BSA-PBST，室溫封閉60 min。甩去封閉液，滴加一抗，濕盒內(nèi)4 ℃孵育過(guò)夜。PBS洗3次，3×10 min。二抗用Alex488或Alex594標(biāo)記。不加一抗作為陰性對(duì)照，以確認(rèn)抗體免疫反應(yīng)特異性。室溫避光孵育1 h。PBS洗3次，3×10 min。用含有DAPI的封片劑封片，用激光共聚焦顯微鏡(Biorad, Hertfordshire, UK)觀察。用Image Pro Plus V5進(jìn)行病理學(xué)分析。BrdU染色，在加一抗之前用3N 鹽酸在37℃孵育30 min，然后用0.5 M硼酸洗10 min。

2.5 蛋白免疫印跡(Western blot)分析

小鼠10%水合氯醛腹腔麻醉，生理鹽水灌注后斷頭取腦，放入冰盒內(nèi)，將大鼠腦組織表面的血管絲剝離干凈。將鼠腦腹面朝上，去除腦干、雙側(cè)嗅腦及小腦，迅速置于液氮中速凍后，轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱備用。腦組織稱(chēng)重，按照腦重量(mg)/裂解液體積(mL)=1∶3的比例用RIPA蛋白裂解液(加入10 mM PMSF)，用玻璃勻漿器在冰上研磨后，靜置30 min；將研磨后的組織勻漿4 ℃，14 000 rpm，離心30 min；吸取上清，分裝后儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱；酶標(biāo)儀測(cè)定蛋白濃度。取60 μg蛋白樣品加5×上樣緩沖液，100℃沸水浴變性5 min，置于冰上驟冷。根據(jù)蛋白分子量配置相應(yīng)濃度的聚丙烯酰胺凝膠分離膠，5%積層膠。60 μg蛋白上樣，電泳轉(zhuǎn)膜。用5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h，PVDF膜放入雜交袋中加入一抗，封口，4 ℃過(guò)夜；棄去一抗，TBST洗膜3×10 min，搖晃，室溫；加入二抗，封于雜交袋中，置于搖床上搖動(dòng)，室溫下1 h；棄去二抗，TBST洗膜3×10 min，TBS洗膜1×10 min；將膜放入ECL化學(xué)發(fā)光試劑中孵育1 min后在化學(xué)發(fā)光儀上曝光拍照。使用Image J軟件進(jìn)行半定量分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 DSS活血利水不同配伍對(duì)神經(jīng)功能的影響

我們采用兩種神經(jīng)功能評(píng)分方法評(píng)估小鼠的神經(jīng)功能(見(jiàn)表1及表2)。結(jié)果顯示，采用圓筒實(shí)驗(yàn)評(píng)估神經(jīng)功能，與空白組比較，原方組改善了神經(jīng)功能，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而活血倍量組與空白組比較顯著改善了神經(jīng)功能(P<0.01)，與原方組比較更進(jìn)一步改善了神經(jīng)功能，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。貼條實(shí)驗(yàn)評(píng)估神經(jīng)功能，與空白組比較，原方組P<0.05，活血倍量組P<0.01；與原方組比較，活血倍量組更進(jìn)一步改善了神經(jīng)功能，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3.2 DSS活血利水不同配伍對(duì)神經(jīng)再生的影響

見(jiàn)圖1及表3。圖1為各組SVZ區(qū)DCX及BrdU染色。由表3可見(jiàn)，與空白組比較，原方組DCX陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)以及DCX+/BrdU+細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.05)，活血倍兩組也顯著增加(P<0.01)，與原方組，活血倍量組更進(jìn)一步增加了DCX陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)以及DCX+/BrdU+細(xì)胞數(shù)(P<0.01)。

表1 DSS活血利水不同配伍的圓筒實(shí)驗(yàn)神經(jīng)功能結(jié)果比較

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與原方組比較，#P<0.05

表2 DSS活血利水不同配伍的貼條實(shí)驗(yàn)神經(jīng)功能結(jié)果比較

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與原方組比較，#P<0.05

表3 SVZ區(qū)DCX陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及BrdU+/DCX+細(xì)胞數(shù)

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與原方組比較，#P<0.05

3.3 DSS活血倍量組對(duì)BDNF、CXCR4的影響

根據(jù)我們前期免疫組織熒光實(shí)驗(yàn)篩選出活血倍量組能夠顯著促進(jìn)神經(jīng)再生(見(jiàn)圖1)。因此，我們選取3組動(dòng)物：Sham組、dMCAO組、活血倍量組，在缺血后第7天取缺血半球SVZ區(qū)，采用Western blot檢測(cè)了與神經(jīng)再生相關(guān)因子BDNF(成熟及非成熟片段)、CXCR4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，活血倍量配伍顯著增加了成熟型BDNF片段的水平及CXCR4的表達(dá)(見(jiàn)圖2及表4)。

注：圖片為SVZ區(qū)DCX以及BrdU免疫熒光染色代表圖圖1 當(dāng)歸芍藥散活血利水不同配伍對(duì)神經(jīng)再生的影響

注：A.在缺血后第7天取缺血半球腦組織，采用Western blot分析DSS活血倍量組對(duì)BDNF的影響;B.采用Western blot分析DSS活血倍量組對(duì)CXCR4的影響圖2 DSS活血倍量組對(duì)BDNF及CXCR4表達(dá)的影響

表4 各組SVZ中BDNF的相對(duì)含量

注：與Sham組比較，☆P<0.05,☆☆P<0.01;與dMCAO組比較，△△P<0.01

表5 各組SVZ中CXCR4的相對(duì)含量

注：注：與Sham組比較，☆P<0.05,☆☆P<0.01;與dMCAO組比較，△△P<0.01

4 討論

DSS為醫(yī)圣張仲景創(chuàng)立，具有通調(diào)血脈、祛濕健脾之能，凡肝郁血虛、脾虛濕困、氣血不和、沖任失調(diào)等所致婦科病證，皆可辨證應(yīng)用。自當(dāng)歸芍藥散創(chuàng)立以來(lái)，歷代醫(yī)家多從仲景之說(shuō)，以本方治婦人諸腹痛，亦間有醫(yī)家及方書(shū)依據(jù)本方調(diào)肝理脾，活血利水的組成結(jié)構(gòu)對(duì)其主治功用有所增益，《三因極一病證方論》記述本方“常服通暢血脈, 不生癰瘍”；《蘭臺(tái)軌范》、《赤水玄珠》均載其不僅能治妊娠腹中絞痛，心下急痛，及療產(chǎn)后血暈，崩中，久痢；考?xì)v代醫(yī)籍對(duì)本方諸藥用量，治腹痛者，多以仲景《金匱要略》為藍(lán)本，以芍藥用量最大，而《證治摘要·卷上·眩暈》以此方治眩暈，當(dāng)歸芍藥散中，三倍芎歸煎服，頭痛者，亦以本方治之[4-5]。

隨著中醫(yī)臨床實(shí)踐的發(fā)展和基礎(chǔ)研究的深入，DSS被越來(lái)越多的應(yīng)用于內(nèi)科疾病，泌尿系統(tǒng)疾病如腎病綜合征、膜性腎病、腎性高血壓及慢性腎功能衰竭等；消化系統(tǒng)疾病如脂肪肝、潰瘍性結(jié)腸炎等；近年來(lái)本方還被用于腦血管疾病，如血管性癡呆，腦梗死等[6]。當(dāng)歸芍藥散主治證的演化和增益，與其調(diào)肝理脾的配伍結(jié)構(gòu)，活血利水的雙重功效不可分割，特別是其用于治療腦血管疾病方面，有其深刻的中醫(yī)理論內(nèi)涵。腦在中醫(yī)屬奇恒之府，腦絡(luò)是腦神的功能和結(jié)構(gòu)載體，具有貫通營(yíng)衛(wèi)、環(huán)流經(jīng)氣、滲透氣血、互化津血的生理功能。脾失健運(yùn)、水濕內(nèi)停、上犯腦絡(luò)、肝失疏泄、血瘀絡(luò)阻均可影響腦絡(luò)，而致腦絡(luò)受損，神機(jī)失養(yǎng)，造成神機(jī)運(yùn)動(dòng)物質(zhì)基礎(chǔ)匱乏，臟腑形骸信息聯(lián)絡(luò)欠暢。如果損傷日久，濕聚成痰，瘀久生熱，甚至化火動(dòng)風(fēng)，則腦中風(fēng)的發(fā)生在所難免。而水津失調(diào)，瘀血阻絡(luò)無(wú)疑是中風(fēng)的基礎(chǔ)病機(jī)。因此，活血和利水是腦中風(fēng)的重要治法，而具有活血利水作用的DSS具有治療腦血管病的基礎(chǔ)優(yōu)勢(shì)，是防治腦缺血的有效方劑。因此我們根據(jù)DSS的活血利水不同配伍，將實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)7組：正常對(duì)照的Sham組、單純模型給與生理鹽水的空白組、原方配伍比例(當(dāng)歸、川芎、白芍、澤瀉、茯苓、白術(shù)比例為3∶3∶16∶8∶4∶4)的原方組、在原方基礎(chǔ)上，將活血的三味藥加倍的活血倍量組、將利水的三味藥加倍的利水倍量組、僅有活血的三味藥且加倍的活血2組，以及僅有利水的三味藥且加倍的利水2組。我們的結(jié)果顯示，原方雖然對(duì)神經(jīng)再生具有促進(jìn)作用，但是活血倍量組對(duì)神經(jīng)再生的貢獻(xiàn)度最大，說(shuō)明在腦中風(fēng)后神經(jīng)功能恢復(fù)期，活血調(diào)肝的治法可能對(duì)神經(jīng)功能恢復(fù)更有裨益。但是活血2組對(duì)神經(jīng)功能的改善以及神經(jīng)再生都沒(méi)有顯著影響，說(shuō)明單純活血調(diào)肝的治法不如在活血調(diào)肝基礎(chǔ)上佐以利水。以上研究目前只限于實(shí)驗(yàn)研究，有待進(jìn)一步臨床試驗(yàn)。

腦中風(fēng)后，腦組織中的神經(jīng)干細(xì)胞增殖，這些新生細(xì)胞能夠遷移到缺血區(qū)域并分化為成熟的神經(jīng)元，這種神經(jīng)再生機(jī)制對(duì)腦中風(fēng)患者的預(yù)后特別是腦高級(jí)神經(jīng)功能的恢復(fù)有著重要作用[7]。在局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭?，SVZ 神經(jīng)干細(xì)胞早在48 h即開(kāi)始增殖，1～2周后達(dá)到高峰，3～4周后恢復(fù)到未增殖前的水平[8]。我們檢測(cè)了dMCAO模型后第7天SVZ區(qū)神經(jīng)前體細(xì)胞即DCX陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量，同時(shí)檢測(cè)了DCX與細(xì)胞增殖標(biāo)志物BrdU雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果顯示，在活血倍量組，這兩種細(xì)胞數(shù)都顯著高于原方組，說(shuō)明活血倍量組對(duì)促進(jìn)神經(jīng)再生貢獻(xiàn)度最大。我們進(jìn)一步探討了活血倍量配伍促進(jìn)神經(jīng)再生的分子機(jī)制。研究報(bào)道BDNF及CXCR4在神經(jīng)再生中具有重要調(diào)節(jié)作用[9-10]。成熟 BDNF(mBDNF)由前體 BDNF(Pro-BD-NF) 轉(zhuǎn)變合成，Pro-BDNF 分子量為35kD，mBDNF為14kD。我們的研究發(fā)現(xiàn)，活血倍量組顯著增加了mBDNF蛋白的表達(dá)。研究報(bào)道CXCR4在活化神經(jīng)干細(xì)胞中高表達(dá)，抑制CXCR4顯著降低神經(jīng)干細(xì)胞的增殖[11]，我們發(fā)現(xiàn)活血倍量配伍顯著增加了CXCR4的表達(dá)。以上研究結(jié)果表明，DSS活血倍量配伍可能通過(guò)增加mBDNF、CXCR4的表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)再生，從而促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。