王遵寶，賀 筍，李俊輝，劉 宏，豆智華，鄭 侃，李森江，寇 春

（天康生物股份有限公司，新疆 烏魯木齊 830032）

豬瘟是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸性烈性傳染病，給中國和其他許多國家養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。雖然中國利用自行研制的豬瘟兔化弱毒疫苗進行強制免疫，有效控制了豬瘟的大規(guī)模流行，但豬瘟仍在中國部分地區(qū)呈散發(fā)、周期性流行。近年來的研究結(jié)果表明，CSFV 基因2 群已取代1 群，成為我國豬瘟流行的優(yōu)勢基因群，臨床中以慢性、非典型性豬瘟為主要表現(xiàn)形式，對養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展造成極為嚴重的危害[1-4]。Luo 等報道在華東地區(qū)溫和型豬瘟散發(fā)的豬場分離獲得了2.1d 亞型CSFV，攻毒結(jié)果表明豬瘟活疫苗對該株病毒只能提供臨床保護，經(jīng)病理解剖及免疫組化分析證實免疫豬存在組織損傷，熒光定量PCR（RT-qPCR）結(jié)果顯示免疫豬攻毒后存在排毒和帶毒情況，提示豬瘟活疫苗不能完全抵抗2.1d 亞型CSFV 對豬的攻擊[5]。 此外，由于豬瘟兔化弱毒疫苗在制造時易受BVDV、支原體、圓環(huán)病毒等血清外源病原污染，且在臨床使用過程中受母源抗體干擾較大，無法克服免疫耐受等問題，而且使用豬瘟活疫苗免疫后，無法用血清學(xué)方法快速鑒別疫苗免疫和CSFV 野毒感染的豬，是我國豬瘟凈化面臨的關(guān)鍵科學(xué)難題[6-7]。因此有必要研制保護譜廣、安全、可靠，不會與野毒發(fā)生重組變異、可進行鑒別診斷的新型標記豬瘟疫苗。研究表明，CSFV E2 蛋白位于病毒的囊膜表面，參與病毒的感染過程，是CSFV 的主要保護性抗原蛋白之一，能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體[8]。為研制、開發(fā)對不同亞群CSFV 均有保護力的豬瘟E2 亞單位疫苗，本研究以豬瘟兔化弱毒株（Hog cholera lapinized virus，HCLV）的E2 基因為基礎(chǔ)，參考近年來國內(nèi)CSFV 流行株的E2 基因序列，并根據(jù)昆蟲細胞密碼子偏嗜性、簡并性對其進行優(yōu)化，使其與CSFV 基因1、2群病毒株的E2 基因編碼的氨基酸同源性最高，以提高E2 蛋白對不同亞群病毒株的交叉保護性。經(jīng)基因合成、構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體及穿梭載體，最終將E2 基因轉(zhuǎn)染至桿狀病毒中，獲得了CSFV E2 重組蛋白（Bac-E2），并利用豬瘟抗體陰性豬評價了該蛋白的免疫原性及保護效力，為豬瘟亞單位疫苗的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 優(yōu)化的CSFV E2 基因序列由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；SF9 細胞、High Five 細胞、PK-15 細胞、HCLV 細胞適應(yīng)株、豬瘟活疫苗（傳代細胞源）等均由天康生物股份有限公司傳代、保存和提供；CSFV 石門強毒株、豬瘟陽性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌毒種保存保藏中心。

pFastBac1 載 體、DH5s、DH10Bac 感 受 態(tài) 細 胞、Cellfectin 轉(zhuǎn)染試劑盒等均購自美國Invitrogen 公司；Mini BEST Viral RNA/DNA Extraction Kit、ExTaq DNA聚合酶、PCR Mix、Xho I、EcoR I 內(nèi)切酶等均購自寶生物（大連）工程有限公司；兔抗豬IgG-HRP、兔抗豬IgG-FITC 均購自Sigma 公司；His TrapTMHP 預(yù)裝柱購自GE 公司；ISA 660VG 佐劑購自法國賽彼科公司。4 周齡～5 周齡CSFV 中和抗體陰性豬，購自新疆天康畜牧科技有限公司。

1.2 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFast-E2 的構(gòu)建及鑒定 以HCLV 為基礎(chǔ)，同時參考近年來國內(nèi)CSFV 流行株的E2 基因序列，根據(jù)昆蟲細胞密碼子偏嗜性對其進行優(yōu)化和修飾，并在其N 端引入保護堿基、酶切位點、包含ATG 的Kozak 轉(zhuǎn)錄起始序列及6-His Tag后，由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。將人工合成的E2 基因序列經(jīng)EcoR I、Xho I 雙酶切后克隆至轉(zhuǎn)移載體pFastBac1 中構(gòu)建重組質(zhì)粒pFast-E2，并經(jīng)測序鑒定。將其進一步轉(zhuǎn)化至含有穿梭桿粒的DHl0Bac 感受態(tài)細胞，經(jīng)PCR 鑒定獲得重組桿粒Bac?mid-E2。參考Cellfectin 轉(zhuǎn)染試劑盒說明書，將其轉(zhuǎn)染于生長狀態(tài)良好的SF9 細胞，27 ℃恒溫培養(yǎng)72 h～96 h 待細胞出現(xiàn)病變后，收集上清，提取核酸進行PCR 擴增并測序鑒定，將其作為第一代重組桿狀病毒，記為P1，命名為：Rb-E2。以10%接種比例分別在SF9細胞中盲傳、擴增，至P5代時收集上清用于后續(xù)試驗及檢測。重組病毒的PCR 鑒定引物序列如下：E2-F1：5'-CACCATGGCATTTCTCATCTGCTTGGT A-3'/E2-R1：5'-AAATTCTGCGAAGTAATCTGAGTG-3'

1.3 重組桿狀病毒的間接免疫熒光試驗（IFA）鑒定將1.2 收獲的重組桿狀病毒P5 代，10 倍倍比稀釋后接種于96 孔板中生長狀態(tài)良好的SF9 細胞，以不接種病毒的SF9 細胞作為陰性對照，7 d 后用4%甲醛固定，以豬瘟陽性血清（1∶500）為一抗，兔抗豬IgG-FITC（1∶5 000）為 二 抗 經(jīng)IFA 鑒 定 重 組 病 毒Rb-E2 及檢測重組E2 蛋白（Bac-E2）的表達，根據(jù)Reed-Muench 法計算重組病毒病毒含量[9]。

1.4 重組蛋白的western blot 鑒定重組病毒 將1.2收獲的重組桿狀病毒P5 代，根據(jù)病毒含量測定結(jié)果，以MOI 2 接種生長良好的High Five 懸浮細胞，27 ℃恒溫培養(yǎng)，在接種病毒后60 h、72 h、84 h、96 h，分別取細胞上清樣，進行SDS-PAGE 檢測。以豬瘟陽性血清（1∶500）為一抗，兔抗豬IgG-HRP（1∶5 000）為二抗，經(jīng)western blot 鑒定重組病毒及Bac-E2 蛋白的表達，通過SDS-PAGE 電泳后經(jīng)灰光度值法測定表達的Bac-E2 蛋白的濃度。

1.5 重組Bac-E2 的免疫效力評價

1.5.1 動物實驗設(shè)計 用搖瓶培養(yǎng)High Five 懸浮細胞，接種Rb-E2，大量制備抗原；接種病毒后96 h，離心取上清，用鎳親和層析法純化Bac-E2 蛋白。將Bac-E2 蛋白與ISA 660VG 佐劑等質(zhì)量混合后乳化免疫豬，以健康High Five 細胞上清液乳化制劑免疫的豬為陰性對照，同時以豬瘟活疫苗（HCLV，傳代細胞源）免疫的豬作為陽性對照。參照《豬瘟活疫苗（兔源）質(zhì)量標準》附注中“豬瘟病毒中和試驗方法”篩選4 周齡～5 周齡豬瘟抗體陰性豬15 頭，動物分組及免疫方案見表1[10]。

1.5.2 各組豬中和抗體的測定 首免后每周采血，連續(xù)5 次，無菌分離血清；將待測血清樣品置56 ℃水浴槽中滅活30 min；用MEM 培養(yǎng)基連續(xù)2 倍倍比（1∶4～1∶4 096），取50 μL 加入96 孔板，每個濃度設(shè)8 個重復(fù)孔；在每孔中加入HCLV（200 TCID50/50 μL/孔），以MEM 培養(yǎng)基為陰性對照，豬瘟陽性血清作為陽性對照，37 ℃中和1 h。另取一個96 孔板進行病毒含量的回歸滴定，每孔加入50 μL MEM，將稀釋的HCLV（200 TCID50/50 μL）連續(xù)2 倍倍比（1∶4～1∶4 096），以MEM 培養(yǎng)基作為陰性對照。在以上兩塊96 孔板的每孔加入密度為105個/mL 的PK-15 細胞懸液100 μL，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)3 d 后，用甲醛固定，以豬瘟陽性血清（1∶500）為一抗，兔抗豬IgG-FITC（1∶5 000）為二抗，在倒置熒光顯微鏡觀察熒光，以Reed-Muench 法計算各組豬血清的中和抗體滴度和病毒含量。回歸滴定的病毒含量在50 TCID50/50 μL～300 TCID50/50 μL 時所稀釋的病毒符合檢驗要求，判定的血清中和抗體成立。

1.5.3 免疫效力試驗 Bac-E2 組、HCLV 組和陰性對照組豬均在首免后35 d，經(jīng)耳后頸部肌肉注射CSFV 石門強毒（105.0最小致死劑量/頭，即105.0MLD/頭），攻毒后連續(xù)觀察16 d，每天測溫、記錄各組豬的發(fā)病和死亡情況，死亡豬剖檢后觀察各組織的病變情況，并計算免疫組的保護率。攻毒后每4 d 采集各組豬的咽拭子及肛拭子，凍存于-80 ℃冰箱，常規(guī)處理后提取病毒核酸，反轉(zhuǎn)錄成cDNA 后，采用RT-qPCR 檢測各組豬排毒情況[11]。

表1 實驗設(shè)計Table 1 The experimental design

2 結(jié) 果

2.1 重組桿狀病毒的PCR 鑒定結(jié)果 構(gòu)建的重組質(zhì)粒pFast-E2 經(jīng)測序結(jié)果顯示，該E2 基因與HCLV的親緣關(guān)系較近，同源性達95.2%，同屬于1.1 亞群。pFast-E2 轉(zhuǎn)化至含有穿梭桿粒的DHl0Bac 感受態(tài)細胞，構(gòu)建重組桿粒Bacmid-E2，經(jīng)PCR 鑒定正確后轉(zhuǎn)染SF9 細胞，96 h 后取病變細胞上清液，提取核酸后經(jīng)PCR 鑒定，結(jié)果顯示擴增得到約1 100 bp 的目的片段（圖1），測序結(jié)果顯示E2 基因序列正確。表明獲得了攜帶E2 基因的重組桿狀病毒將其命名為Rb-E2。

圖1 重組桿狀病毒的PCR 鑒定Fig.1 Amplification of E2 gene by PCR from recombinant baculovirus

2.2 重組桿狀病毒的IFA 鑒定結(jié)果 將P5 代重組桿狀病毒以10 倍倍比稀釋后接種SF9 細胞，7 d 后進行IFA 鑒定。結(jié)果顯示，感染病毒的細胞可觀察到特異的綠色熒光，而陰性對照則未出現(xiàn)熒光（圖2），表明獲得了重組桿狀病毒，且桿狀病毒中的CSFV E2 基因能夠在昆蟲細胞中獲得正確表達。根據(jù)Reed-Muench 方法計算重組桿狀病毒滴度為107.8TCID50/mL。

圖2 重組桿狀病毒Rb-E2 的IFA 鑒定結(jié)果（×200）Fig.2 Identification of Rb-E2 in SF9 cell by IFA(×200)

2.3 重組桿狀病毒的western blot 鑒定結(jié)果 將P5代Rb-E2 接種生長良好的High Five 懸浮細胞，收獲的上清液經(jīng)western blot 鑒定。結(jié)果顯示，經(jīng)桿狀病毒感染60 h 的細胞即可出現(xiàn)大小為52 ku 的目的蛋白條帶；接種桿狀病毒后96 h，上清液中Bac-E2 含量最高（圖3），經(jīng)SDS-PAGE 電泳后采用灰光度值法測定蛋白濃度可達50 μg/mL，表明獲得了能夠表達CSFV E2 蛋白的重組桿狀病毒Rb-E2，表達的Bac-E2主要存在于細胞上清液中，且具有良好的反應(yīng)原性。

圖3 重組桿狀病毒E2 蛋白表達的western blot 鑒定結(jié)果Fig.3 Identification of the recombinant E2 protein by western blot in Rb-E2

2.4 Bac-E2 的免疫效力評價

2.4.1 各組豬中和抗體的測定結(jié)果 將重組蛋白Bac-E2 乳化后免疫豬，同時設(shè)陽性對照組和陰性對照組，首免后每周測定各組豬血清的中和抗體。結(jié)果顯示，免疫前各組豬中和抗體效價均小于1∶4（以1∶4 統(tǒng)計），Bac-E2 組首免后2 周，5 頭豬中3 頭豬的中和抗體效價不低于1∶32，首免后3 周，5 頭豬血清中和抗體效價均不低于1∶64，首免后5 周（加強免疫后2 周）該組豬中和抗體效價均不低于1∶1 024；HCLV 組豬首免后3 周中和抗體效價介于1∶11～1∶22，首免后5 周（加強免疫后2 周）中和抗體效價提高至1∶64～1∶128。采用t 檢驗比較了兩個免疫組的抗體水平，首免后5 周兩組豬中和抗體效價差異極顯著（p＜0.01）；陰性對照組豬血清中和抗體效價始終小于1∶4（圖4）。表明Bac-E2 能夠誘導(dǎo)豬產(chǎn)生高水平的豬瘟中和抗體。

圖4 各組豬血清中和抗體效價的測定結(jié)果Fig.4 The titers of neutralizing antibody against CSFV in immuned pigs

2.4.2 攻毒試驗結(jié)果 首免后35 d 經(jīng)CSFV 石門強毒攻擊后，在16 d 的觀察期內(nèi)，Bac-E2 組、HCLV組豬的體溫正常、無發(fā)病、無死亡，保護率為100%；陰性對照組豬呈高熱稽留、畏寒怕冷，食欲不振最終廢絕，便秘與腹瀉交替發(fā)生，并伴有體表出血、結(jié)膜炎等典型豬瘟臨床癥狀，在攻毒后12 d內(nèi)全部發(fā)病死亡（圖5），剖檢可見扁桃體潰瘍、脾臟邊緣梗死、淋巴結(jié)切面呈大理石樣花紋，腎臟表面有大量出血點，呈現(xiàn)典型“雀斑腎”病理變化。

各組豬攻毒后的拭子中CSFV 的排毒檢測結(jié)果顯示，Bac-E2組、HCLV組豬攻毒后0～16 d的咽拭子及肛拭子中均未檢測到CSFV 核酸。對照組豬攻毒后第4 d即可在其咽拭子中檢出CSFV 核酸，平均為2.31×103拷貝/μL，肛拭子中病毒核酸為3.25×103拷貝/μL，此后拭子中病毒核酸拷貝數(shù)逐漸升高，至攻毒后第12 d 時咽拭子中病毒核酸可達1.038×104拷貝/μL；肛拭子中病毒核酸可達1.15×104拷貝/μL（表2）。以上結(jié)果表明，Bac-E2 能夠有效抵御CSFV 石門強毒的攻擊，與HCLV 組免疫效力相當，可以作為豬瘟E2 亞單位疫苗的候選抗原蛋白。

圖5 攻毒后各組豬的存活情況Fig.5 Survival curve of pigs at 0-16 days post challenge with CSFV Shimen strain

表2 攻毒后各組豬咽拭子、肛拭子排毒量檢測結(jié)果（平均拷貝數(shù)/μL）Table 2 Viral loads of challenged swine in pharyngeal and anal swabs(Mean copies/μL)

3 討 論

疫苗接種是控制豬瘟的重要手段，其包括滅活疫苗、亞單位疫苗和弱毒疫苗。我國長期堅持采用全面接種豬瘟兔化弱毒疫苗來防控豬瘟，但目前豬瘟在我國依然存在，而且流行株由基因1 群演變?yōu)榛? 群，流行特點也從以往的頻發(fā)大面積流行轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)律區(qū)域性的散發(fā)，隱性持續(xù)性感染病例增多，大部分豬場不得不加強疫苗免疫劑量及次數(shù)、采用超前免疫的方式防控豬瘟。此外，豬瘟弱毒疫苗在制造時易受BVDV、支原體、圓環(huán)病毒等血清外源病原污染，而且在臨床使用過程中受母源抗體干擾較大，無法克服免疫耐受、區(qū)分野毒感染與疫苗免疫等問題，阻礙了中國豬瘟的凈化，因此市場上亟待能夠更有效防控并凈化豬瘟的疫苗產(chǎn)品。 昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng)可高效表達外源基因，并可對外源蛋白進行轉(zhuǎn)錄后糖基化、磷酸化等加工過程，最終獲得與天然蛋白功能相似的可溶性重組蛋白，顯著優(yōu)于細菌、酵母表達體系[12]。季新成等將CSFV E2 基因克隆到桿狀病毒中，經(jīng)SDS-PAGE、western blot 等方法證明該基因在昆蟲細胞中正確表達，能夠與豬瘟陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，但表達量較低[13]。本研究所選的E2 基因去除了跨膜區(qū)，保留了信號肽序列，獲得了在上清中正確表達的重組E2 蛋白，表達量顯著提高。胡剛?cè)~等構(gòu)建了兩株含HCLV E2 基因的重組桿狀病毒，并在蠶蛹血淋巴中獲得了重組E2 蛋白，但制備工藝不適合工業(yè)化放大生產(chǎn)，而且未見免疫原性研究報道[14]。本研究利用懸浮培養(yǎng)的High Five 昆蟲細胞接種重組桿狀病毒進行E2 蛋白表達，生產(chǎn)工藝易于放大，適合工業(yè)化生產(chǎn)。 孫元等用腺病毒表達了重組E2 蛋白，免疫家兔和豬后均能產(chǎn)生豬瘟特異性抗體，并進行了靶動物的攻毒試驗，攻毒后rAdV-E2 免疫豬抗體迅速升高，除了一頭豬短期體溫升高外，未出現(xiàn)任何其它臨床癥狀[15]。本研究制備獲得的Bac-E2 蛋白免疫豬后，在攻毒前其中和抗體已不低于1∶1 024，利用CSFV 石門強毒攻毒后5 頭豬體溫均未升高，未見異常臨床癥狀，表明Bac-E2 蛋白的免疫原性較好。

高瑩以CSFV 石門強毒的E2 基因為基礎(chǔ)構(gòu)建了3 種重組桿狀病毒，可誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生高水平中和抗體，但未見其對基因2 群病毒的交叉保護性研究的報道[16]。本研究根據(jù)昆蟲細胞密碼子偏嗜性、簡并性對E2 基因序列進行優(yōu)化，使其與CSFV 基因1、2群病毒的E2 基因編碼的氨基酸同源性最高，以提高E2 蛋白對不同亞群病毒株的交叉保護性。本實驗結(jié)果表明，BAC-E2 免疫動物后可以誘導(dǎo)豬產(chǎn)生高水平的豬瘟特異性中和抗體，能夠有效抵御CSFV 石門強毒的攻擊，后期將采用CSFV 基因2 群流行株進行免疫攻毒試驗，確定該蛋白對CSFV 2.1b、2.1c、2.1d 等亞群的廣譜保護力。本研究制備的Bac-E2 可以作為豬瘟E2 亞單位疫苗的候選抗原蛋白，為豬瘟E2 亞單位疫苗的研制提供了實驗依據(jù)。為了穩(wěn)定并進一步提升Bac-E2 蛋白產(chǎn)量，后期擬對重組桿狀病毒進行連續(xù)傳代穩(wěn)定性測試，同時建立生物反應(yīng)器全懸浮培養(yǎng)昆蟲細胞的生產(chǎn)工藝，促進該產(chǎn)品向大生產(chǎn)轉(zhuǎn)化。