張 偉，羅時(shí)華，王長(zhǎng)法，岳壽松，齊鵬飛，朱曼玲，張 燕*

（1. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250100；2. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，山東 濟(jì)南 250100；3. 聊城毛驢高效繁育與生態(tài)飼養(yǎng)研究院，山東 聊城 252000）

溶菌酶（Lysozyme）又稱(chēng)胞壁質(zhì)酶（Muramidase），能水解細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖使其細(xì)胞壁松散、裂解、胞內(nèi)物質(zhì)溢出而起到殺菌作用。溶菌酶還能與帶負(fù)電荷的病毒蛋白直接結(jié)合，與DNA、RNA、脫輔基蛋白等形成復(fù)鹽，使病毒失活。它還能夠與抗σ因子—RsiV 結(jié)合，激活σV[1]。溶菌酶具有抗菌消炎、抗病毒、提高機(jī)體免疫力、無(wú)殘留等特點(diǎn)，是一種有前景的抗生素替代品[2-3]。

按照來(lái)源不同，溶菌酶可分為3 類(lèi)：動(dòng)物溶菌酶、植物溶菌酶和微生物溶菌酶。動(dòng)物溶菌酶是來(lái)源最廣和數(shù)量最多的一種溶菌酶，包括c 型（Chick?en type）、g 型（Goose-type）和i 型（Invertebrate-type）溶菌酶。哺乳動(dòng)物中僅存在c 型和g 型溶菌酶，其中驢包含2 個(gè)g 型溶菌酶和6 個(gè)c 型溶菌酶[4]。莊桂龍等對(duì)驢乳溶菌酶研究顯示，馬屬動(dòng)物（馬、驢）和少量動(dòng)物（貓、狗等）具有特有的c 型溶菌酶基因LY?SC1，該基因在驢乳腺中高表達(dá)[4]，導(dǎo)致驢乳中溶菌酶含量達(dá)1.1 g/L[5]。驢乳中的高含量溶菌酶可能是驢乳體細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于牛乳體細(xì)胞數(shù)量的原因。目前，關(guān)于驢溶菌酶特性的研究較少，因此，本研究人工合成驢乳溶菌酶基因（donkey LYSC1，DKLY?SC1），構(gòu)建了原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)，測(cè)定其表達(dá)產(chǎn)物活性，為驢溶菌酶的開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 pET32a（+）原核表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室保存；pUC59 載體由生工生物工程（上海）股份有限公司提供；大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒和DNA 凝膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；T4 DNA 連接酶、Nco I 和Xho I 限制性?xún)?nèi)切酶均購(gòu)自TaKaRa 公司；T5 Super PCR Mix 購(gòu)自青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；His 標(biāo)簽蛋白純化試劑盒（包涵體蛋白）、兔抗His 標(biāo)簽多克隆抗體、HRP 標(biāo)記羊抗兔IgG 和高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；溶菌酶測(cè)試盒（比濁法）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；其它常規(guī)試劑均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 DKLYZC1 基因序列及引物的設(shè)計(jì)與合成 參考GenBank 登錄的驢DKLYSC1 基因序列（XM_014850098），人工合成目的基因全長(zhǎng)序列（兩端分別帶有Nco I 和Xho I 酶切位點(diǎn)），克隆于pUC59 載體，構(gòu)建pUCDKLYSC1 重組質(zhì)粒。PCR 鑒定引物：DKLYSC1-F：5'-atgaggtccactctgatcat-3'/DKLYSC1-R：5'-tcacaggttac agctagccaggt-3'，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小為447 bp。目的基因和鑒定引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 pET32a-DKLYSC1 原核表達(dá)載體構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá) pUC-DKLYSC1 質(zhì)粒經(jīng)Nco I 和Xho I 雙酶切，將目的片段亞克隆于pET32a（+）載體，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET32a-DKLYSC1。經(jīng)PCR 和酶切鑒定后，由青島擎科生物科技有限公司測(cè)序鑒定。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，獲得pET32a-DKLYSC1/DE3 菌株。參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE 電泳檢測(cè)。

1.4 重組DKLYSC1 蛋白純化及western blot 鑒定將誘導(dǎo)表達(dá)6 h 的pET32a-DKLYSC1/DE3 菌體超聲破碎，離心收集包涵體沉淀，并參照His 標(biāo)簽蛋白純化試劑盒（包涵體蛋白）方法純化DKLYSC1 蛋白。隨后以兔抗His 標(biāo)簽多克隆抗體（1∶1 000）為一抗，羊抗兔IgG-HRP（1∶3 000）為二抗進(jìn)行目的蛋白的western blot 鑒定。

1.5 重組DKLYZ C 蛋白驢源溶菌酶比酶活的測(cè)定參照文獻(xiàn)[7]透析復(fù)性法進(jìn)行重組蛋白復(fù)性，具體操作稍加改動(dòng)，整個(gè)透析過(guò)程使蛋白液中L-精氨酸濃度保持0.8 mol/L、氧化型谷胱甘肽（GSSG）和還原型谷胱甘肽（GSH）按1∶1 摩爾量混合，終濃度保持3 mmol/L。

透析液上清即為復(fù)性蛋白。利用超濾管濃縮復(fù)性蛋白至復(fù)性前包涵體蛋白體積后進(jìn)行12%SDS-PAGE 檢測(cè)。利用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（增強(qiáng)型）測(cè)定重組溶菌酶蛋白含量，利用溶菌酶測(cè)試盒（比濁法）測(cè)定重組溶菌酶的酶活力，重組溶菌酶的酶活力與重組溶菌酶蛋白含量的比值即為該重組溶菌酶的比酶活（U/mg）。

2 結(jié)果與討論

2.1 pET32a-DKLYSC1 原核表達(dá)載體構(gòu)建和鑒定結(jié)果 pUC59-DKLYSC1 經(jīng)Nco I 和Xho I 雙酶切后，將獲得的目的片段克隆至原核表達(dá)載體pET32a（+），構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a-DKLYSC1。構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR 擴(kuò)增結(jié)果顯示，在450 bp 左右獲得與目的片段大小一致的條帶（圖1A）；該質(zhì)粒經(jīng)Nco I 和Xho I 雙酶切后獲得5 900 bp 左右的載體片段和450 bp 左右的DKLYSC1 基因片段（圖1B）。測(cè)序結(jié)果顯示插入片段與DKLYSC1 基因序列完全一致，表明pET32a-DK?LYSC1 原核表達(dá)載體正確構(gòu)建。本研究采用人工合成DKLYSC1 基因序列，一方面因?yàn)镈KLYSC1 僅447 bp，且人工設(shè)計(jì)兩端添加酶切位點(diǎn)簡(jiǎn)便易行，合成成本低；另一方面因?yàn)槿斯ず铣苫蛐蛄懈弑Ｕ?，避免了PCR 擴(kuò)增片段時(shí)的堿基突變問(wèn)題。

圖1 pET32a-DKLYZC1 載體的PCR 鑒定（A）及酶切（B）鑒定Fig.1 Identification of pET32a-DKLYZC1 vector by PCR and restriction enzyme digestion

2.2 重組蛋白表達(dá)的分析 將鑒定正確的pET32a-DKLYSC1轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，獲得pET32a-DKLYSC1/DE3 重組菌株。經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)、SDSPAGE 檢測(cè)。結(jié)果顯示，重組菌在31 ku 處有目的蛋白條帶，與重組DKLYSC1 蛋白預(yù)期分子量大小一致，并且蛋白表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸提高，6 h 時(shí)達(dá)到最大值。菌體超聲破碎后離心收集上清和沉淀，SDS-PAGE 檢測(cè)重組蛋白表達(dá)形式，結(jié)果顯示重組蛋白主要存在于沉淀中，表明重組蛋白主要以包涵體形式表達(dá)（圖2A）。目前，不同來(lái)源的溶菌酶基因在大腸桿菌和酵母菌表達(dá)系統(tǒng)、植物及動(dòng)物乳腺中均獲得了表達(dá)[8-11]。大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)是應(yīng)用最廣泛的經(jīng)典蛋白表達(dá)系統(tǒng)，具有目的蛋白表達(dá)水平高，生長(zhǎng)周期短，抗污染能力強(qiáng)，安全性好和成本低等特點(diǎn)[12]。溶菌酶對(duì)大腸桿菌有一定的毒害作用，表達(dá)產(chǎn)物若為可溶性蛋白極易產(chǎn)生大腸桿菌的“自殺”現(xiàn)象，而以包涵體形式的表達(dá)則可避免其對(duì)重組菌株生長(zhǎng)性能的影響。

重組蛋白N 端帶有His 標(biāo)簽，利用Ni 柱參照包涵體蛋白純化方法獲得純化的重組包涵體蛋白。western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，在31 ku 處出現(xiàn)特異性條帶（圖2B）。表明重組蛋白DKLYSC1 具有較強(qiáng)的反應(yīng)原性。將純化的重組蛋白利用尿素法進(jìn)行透析復(fù)性，獲得了純度高的復(fù)性蛋白，但濃度較復(fù)性前降低。本研究中驢乳溶菌酶在大腸桿菌中以包涵體的形式表達(dá)，但溶菌酶中含有4 個(gè)二硫鍵，復(fù)性過(guò)程中二硫鍵能否正確排列和蛋白結(jié)構(gòu)能否正確折疊是獲得高活性溶菌酶的關(guān)鍵。本研究在復(fù)性過(guò)程中加入了賴(lài)氨酸和谷胱甘肽氧化還原對(duì)來(lái)促使重組驢乳溶菌酶的復(fù)性，復(fù)性效率有所提高。

圖2 重組蛋白DKLYSC1 表達(dá)的SDS-PAGE 檢測(cè)（A）及純化蛋白的westen blot 鑒定（B）Fig.2 Identification of recombinant DKLYSC1 by SDS-PAGE and verification of purified DKLYSC1 by western blots

2.3 重組蛋白比酶活測(cè)定 根據(jù)BCA蛋白濃度測(cè)定方法獲得復(fù)性后重組溶菌酶蛋白含量為0.308 mg/mL，依據(jù)比濁法測(cè)定重組溶菌酶活性為38.42 U/mL，經(jīng)計(jì)算，重組溶菌酶比酶活為124.74 U/mg。

本實(shí)驗(yàn)獲得的溶菌酶比酶活相對(duì)較低，究其原因，可能是復(fù)性條件中，其二硫鍵未能正確排列，雖獲得可溶性重組蛋白但其特有的蛋白酶功能卻下降了。因此，隨后將針對(duì)驢乳溶菌酶包涵體蛋白的復(fù)性條件進(jìn)一步研究，以期獲得最佳的包涵體復(fù)性條件和高活性重組蛋白。

我國(guó)驢業(yè)是獨(dú)具特色的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)，也是世界各國(guó)驢業(yè)發(fā)展中產(chǎn)業(yè)鏈最為完善的，涉及養(yǎng)殖、屠宰、畜產(chǎn)品加工等各個(gè)方面，其中阿膠制品是最為熟知的驢制品。但是，隨著機(jī)械化發(fā)展進(jìn)程，驢的役用功能下降，我國(guó)驢存欄量也呈現(xiàn)急劇下滑的現(xiàn)象。近年來(lái)，國(guó)家畜牧業(yè)發(fā)展結(jié)構(gòu)調(diào)整以及政策的支持，驢產(chǎn)業(yè)迎來(lái)了新的契機(jī)，驢養(yǎng)殖業(yè)也得到了很大發(fā)展，規(guī)?；H場(chǎng)相繼建成。驢耐粗飼、不易生病，具有良好的環(huán)境適應(yīng)性和較強(qiáng)的抗逆性的特性，但隨著集約化驢養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，疫病防控存在風(fēng)險(xiǎn)。溶菌酶具有殺菌、抗病毒等活性，本研究開(kāi)展驢乳溶菌酶的研究，不僅對(duì)驢基因資源的開(kāi)發(fā)利用具有重要意義，同時(shí)對(duì)驢基礎(chǔ)學(xué)科研究和探究更安全、高效和穩(wěn)定的抗生素替代產(chǎn)品用以防控驢的相關(guān)疫病具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。