高志新，丁樹(shù)雄

(1 河北省玉田縣市場(chǎng)監(jiān)督管理局，河北 玉田，064100；2 河北省玉田縣質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗(yàn)所)

膠原蛋白分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，具有極低免疫原性和致敏性，根據(jù)其在體內(nèi)的分布，分為間質(zhì)膠原蛋白、基膜膠原蛋白和細(xì)胞外周膠原蛋白。機(jī)體膠原的主要形式為間質(zhì)型膠原蛋白，包括Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ型，分布于皮膚和肌腱等組織；基底膜膠原蛋白通常是指分布于基底膜的Ⅳ型膠原蛋白；細(xì)胞周膠原蛋白通常是指結(jié)締組織中大量存在的Ⅴ型膠原蛋白[1]。食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用的膠原蛋白肽是以富含膠原蛋白的新鮮動(dòng)物組織(包括皮、骨、筋、腱、鱗等)為原料，經(jīng)過(guò)提取、水解、精制生產(chǎn)的，相對(duì)分子質(zhì)量低于10 000的產(chǎn)品[2]，大部分從間質(zhì)型膠原蛋白分解制備而得。我國(guó)GB 31645—2018食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)膠原蛋白肽已于2018年12月21日起正式實(shí)施，所采用的原料需為檢疫合格的新鮮牛、豬和魚等動(dòng)物的皮、骨、筋、腱和鱗等，或者制革鞣制工藝前，剪切下的帶毛邊皮或剖下的內(nèi)層皮，或者骨粒加工廠加工的清潔骨粒和自然風(fēng)干的骨料及可食水生動(dòng)物魚鰾、可食棘皮動(dòng)物、水母等[2～4]。

研究表明，膠原蛋白肽具有良好的食品加工特性，如溶解性、乳化性、起泡性和流動(dòng)性等在飲料、面包、糕點(diǎn)以及冰淇淋等食品的生產(chǎn)中有廣泛應(yīng)用[5～7]。近年來(lái)文獻(xiàn)報(bào)道多集中在膠原蛋白肽的制備工藝及其生物活性研究[8～11]，隨著膠原蛋白在食品工業(yè)中的廣泛應(yīng)用，有必要探討膠原蛋白肽中礦物質(zhì)含量，為其應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。本次研究對(duì)膠原蛋白肽中K，Ca，P及Na等4種宏量礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素進(jìn)行了檢測(cè)，分析不同來(lái)源膠原蛋白肽中元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異，以期為含膠原蛋白肽的食品配方及標(biāo)簽設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 725-OES垂直觀測(cè)電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀，美國(guó)安捷倫有限公司生產(chǎn)(參照J(rèn)JG 768—2005《發(fā)射光譜儀》國(guó)家計(jì)量檢定規(guī)程計(jì)量檢定合格，波長(zhǎng)示值誤差±0.03 nm，波長(zhǎng)示值重復(fù)性≤0.005 nm，最小光譜帶寬Mn 257.610 nm，半高度≤0.015 nm)；MDS-15高通量密閉微波消解儀，上海新儀微波化學(xué)科技有限公司生產(chǎn)；L-1000 XLS移液器，梅特勒-托利多儀器有限公司生產(chǎn)；GL 124電子天平，感量0.000 1 g，德國(guó)賽多利斯設(shè)備有限公司生產(chǎn)；PURELAB Option S-R 7-15超純水儀，萊特萊德(北京)純水設(shè)備技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)；量筒、容量瓶及燒杯等所有器材均用體積分?jǐn)?shù)為0.1的 HNO3浸泡過(guò)夜，用超純水沖洗。Ca，K，Na，P單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，1 000 mg/L，均購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；HNO3為優(yōu)純級(jí)，體積分?jǐn)?shù)為0.3的雙氧水為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；實(shí)驗(yàn)用水為自制超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

采用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線外標(biāo)法定量。取1 000 mg/L Ca，K和P元素單標(biāo)各5 mL，Na元素單標(biāo)10～100 mL容量瓶中，定容混勻得到混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，取上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別以2倍梯度稀釋，介質(zhì)為體積分?jǐn)?shù)為0.01的HNO3溶液，得到6個(gè)質(zhì)量濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中，Ca，K和P元素質(zhì)量濃度梯度依次為50.000，25.000，12.500，6.250，3.250，1.625 mg/L；Na元素質(zhì)量濃度梯度依次為100.00，50.00，25.00，12.50，6.50，3.25 mg/L，以標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋用溶劑為空白得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線系列。

1.3 樣品測(cè)定

1.3.1樣品來(lái)源與前處理 不同來(lái)源的膠原蛋白肽樣本均為市場(chǎng)上流通的國(guó)內(nèi)外不同生產(chǎn)廠家的原料產(chǎn)品，涵蓋法國(guó)羅賽洛Rousselot，德國(guó)嘉利達(dá) GELITA，比利時(shí)派寶 PB，日本AKAII，華達(dá)杰瑞及東寶生物等公司的產(chǎn)品。樣品呈粉末狀或細(xì)顆粒狀，無(wú)結(jié)塊，粉體流動(dòng)性較佳，色澤為白色或淡黃色，包括豬皮(ZP)來(lái)源14例，牛皮(NP)來(lái)源16例，魚皮(YP)來(lái)源15例。參考文獻(xiàn)[12,13]方法，進(jìn)行樣本制備。稱取0.5 g試樣(精確至0.000 1 g)，并制備平行樣1份，置于50 mL微波消解罐中，加5 mL HNO3和1 mL過(guò)氧化氫，預(yù)消解30 min，以使得消解產(chǎn)生的大量氣體溢出，避免爆罐。罐體密封后安裝溫度及壓力傳感器，對(duì)稱的置于微波消解腔內(nèi)，微波消化裝置消化程序?yàn)? min從室溫升至100 ℃，保持5 min，2 min升溫至120 ℃，保持5 min，5 min升溫至150 ℃，保持5 min，然后降至室溫，消解結(jié)束。待消解罐冷卻后，將溶液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用水沖洗罐壁3次以上，并定容至刻度，混勻。平行測(cè)定2次取平均值。

1.3.2原理與儀器工作條件 將高純惰性氣體氬氣在高頻電磁場(chǎng)中形成等離子體炬。樣品溶液在霧化器中被霧化后，被載氣帶入高溫的等離子體炬中，激發(fā)各種元素的原子或離子發(fā)射出各自的特征光譜線，依據(jù)這些特征光譜線，可以進(jìn)行定性或定量的元素分析。電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀工作條件見(jiàn)表1。在文獻(xiàn)[14]報(bào)道的方法步驟的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，進(jìn)行分析測(cè)定。新建并編輯工作方法，選擇各元素推薦最靈敏分析譜線作為待測(cè)元素波長(zhǎng)及并輸入標(biāo)準(zhǔn)工作曲線梯度濃度值。

表1 電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀工作條件

項(xiàng)目設(shè)定值項(xiàng)目設(shè)定值功率/W1200霧化氣壓力/MPa0.2泵速/(r·min-1)15讀數(shù)次數(shù)3進(jìn)樣延時(shí)/s20穩(wěn)定延時(shí)/s10等離子體氣流速/(L·min-1)15輔助氣流速/(L·min-1)1.5一次讀數(shù)時(shí)間/s10

1.3.3工作曲線與樣品測(cè)定 儀器檢測(cè)器溫度降至-35 ℃，光室35 ℃恒溫穩(wěn)定后，繼續(xù)高純氬氣吹掃30 min，以吹除系統(tǒng)中殘余氧氣，避免對(duì)低波長(zhǎng)元素的干擾。點(diǎn)燃等離子體，高純氬氣大流量吹掃20 min后，等離子體趨于穩(wěn)定。將制備好的工作曲線濃度梯度溶液參照儀器參考操作條件進(jìn)行測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定完畢后，體積分?jǐn)?shù)為0.01的HNO3溶液清洗1次，超純水清洗2次，然后再進(jìn)行試劑空白和樣品測(cè)定。

1.3.4檢出限及回收率 取一體積分?jǐn)?shù)為0.1 的HNO3溶劑空白重復(fù)測(cè)定7次，取3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差，計(jì)算出各元素檢出限；取標(biāo)準(zhǔn)曲線中間濃度溶液1 mL準(zhǔn)確加入待測(cè)樣品中，進(jìn)行加標(biāo)回收率分析，以考察方法的準(zhǔn)確性。

1.3.5樣品中元素含量計(jì)算 由各元素的標(biāo)準(zhǔn)系列濃度與對(duì)應(yīng)的發(fā)射強(qiáng)度，計(jì)算出回歸方程，由回歸方程得出測(cè)定樣液濃度C(mg/L)及溶劑空白液的濃度C0(mg/L)，樣品質(zhì)量為m(g)，后再由式(1)計(jì)算出樣品中元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Ci(mg/kg)。

Ci=[(C-C0)/(m·1 000)]·50·1 000

(1)

1.3.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用一元線性回歸法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，并得到相關(guān)系數(shù)；采用Graphpad Prism 5.0軟件Column statistics組件進(jìn)行作圖；采用Microsoft Excel 2016 描述統(tǒng)計(jì)功能進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法精密度及檢出限

不同元素在相應(yīng)的推薦定性定量檢測(cè)波長(zhǎng)下的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線詳見(jiàn)表2，凈光譜強(qiáng)度和對(duì)應(yīng)的元素濃度呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.999以上，滿足定量分析要求。方法檢出限0.2～0.6 mg/L，回收率介于90.5%～103.8%。

表2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限及回收率

2.2 樣品元素含量

測(cè)定結(jié)果表明：魚皮來(lái)源的膠原蛋白肽中Ca，P及Na的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高(圖1)。其中，Ca的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍3.50～35.90 mg/kg，平均14.05 mg/kg，中位數(shù)為13.30 mg/kg)顯著高于豬皮來(lái)源的(質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍1.81～12.46 mg/kg，平均5.23 mg/kg，中位數(shù)為3.73 mg/kg)及牛皮來(lái)源的(質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍2.52～13.90 mg/kg，平均6.21 mg/kg，中位數(shù)為5.24 mg/kg)。魚皮來(lái)源的膠原蛋白肽所用的原材料通常為各種魚類水產(chǎn)品加工的下腳料，取材自不同的魚組織部位，包括魚皮、魚鰭、魚鱗、魚鰾等，經(jīng)酶解或水解而制得，與其Ca，P及Na元素組成較高有關(guān)。采用水產(chǎn)動(dòng)物如鯽魚、鯉魚、鰈魚、鯖魚、鰱魚、鳙魚、草魚等，尤其是其加工廢棄物——皮、骨、鱗中含有豐富的膠原蛋白，由此制得的酶解制備膠原蛋白肽，是優(yōu)良的清真蛋白質(zhì)原料來(lái)源[15～18]。此外，魚骨/鰭來(lái)源的膠原蛋白通常富含Ca元素，而Ca元素為人類必需營(yíng)養(yǎng)礦物質(zhì)元素，膠原蛋白肽和Ca元素是機(jī)體皮膚、肌腱及結(jié)締組織的主要組成成分，兩者在組織修復(fù)營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充中可以起到協(xié)同作用[19～22]。

圖1 不同來(lái)源膠原蛋白肽中Na，K，Ca及P元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

Na元素在魚皮來(lái)源的膠原蛋白肽中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高(質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍15.60～93.90mg/kg，平均63.81 mg/kg，中位數(shù)為67.40 mg/kg)，顯著高于豬皮來(lái)源的(質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍16.30～80.30mg/kg，平均47.84mg/kg，中位數(shù)為49.55 mg/kg)及牛皮來(lái)源的(質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍7.40～87.20 mg/kg，平均55.36 mg/kg，中位數(shù)為64.50 mg/kg)。Na元素是預(yù)包裝食品營(yíng)養(yǎng)標(biāo)簽中必須標(biāo)示的項(xiàng)目之一，膠原蛋白肽作為食品原料之一，有必要對(duì)其Na元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行摸底，為產(chǎn)品配方設(shè)計(jì)提供依據(jù)。此外，由于不同來(lái)源的膠原蛋白肽中Na元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍跨度較大，因此通過(guò)對(duì)膠原蛋白肽原料進(jìn)行Na元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的檢測(cè)，篩選適合的來(lái)源和供應(yīng)商，并對(duì)來(lái)料進(jìn)行批次檢驗(yàn)，以避免對(duì)預(yù)包裝食品中Na的質(zhì)量分?jǐn)?shù)造成較大影響。

此外，研究結(jié)果顯示，魚皮來(lái)源的膠原蛋白肽中P的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍0.40～22.30 mg/kg，平均10.10 mg/kg，中位數(shù)為6.39 mg/kg)顯著高于豬皮來(lái)源的(質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍0.35～18.60 mg/kg，平均3.24 mg/kg，中位數(shù)為1.73 mg/kg)及牛皮來(lái)源的(質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍0.70～21.30 mg/kg，平均8.93 mg/kg，中位數(shù)為8.22 mg/kg)。牛皮來(lái)源的膠原蛋白肽中K的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在3種原料來(lái)源中最高(質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍7.95～31.20 mg/kg，平均18.67 mg/kg，中位數(shù)為20.30 mg/kg)，顯著高于豬皮來(lái)源的(質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍1.94～23.90 mg/kg，平均11.31 mg/kg，中位數(shù)為10.90 mg/kg)及魚皮來(lái)源的(質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍3.80～23.10 mg/kg，平均12.12 mg/kg，中位數(shù)為12.90 mg/kg)。本次研究選取的同一來(lái)源的膠原蛋白肽樣本，各元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)仍然有較大差異，可能與其產(chǎn)地及加工工藝有關(guān)。膠原蛋白肽的制備方法包括化學(xué)分解法和酶解法。其中，廣泛采用的膠原蛋白肽制備方法為酶解法，如中性蛋白酶、堿性蛋白酶及菠蘿蛋白酶等，而酶解效果影響因素包括酶種類、酶活力、酶用量、作用溫度及時(shí)間、體系pH等[7]，為了控制適宜的酶解體系pH，會(huì)加入標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的食品工業(yè)用加工助劑，膠原蛋白肽酶解體系通常應(yīng)用磷酸緩沖鹽進(jìn)行最佳pH的控制，因此，同一來(lái)源膠原蛋白肽中P，K及Na元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的差異，可能為工藝參數(shù)差異所致。

3 結(jié) 論

本次研究應(yīng)用微波消解聯(lián)合電感耦合等離子體發(fā)射光譜分析技術(shù)建立了不同膠原蛋白肽中Ca，P，Na及K元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的同時(shí)檢測(cè)方法。采用建立該方法進(jìn)行了實(shí)際樣品測(cè)定。結(jié)果顯示：魚皮來(lái)源的膠原蛋白肽中，Ca，Na，P的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高；牛皮來(lái)源的膠原蛋白肽中，K的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高。魚皮來(lái)源的膠原蛋白肽可作為優(yōu)良的補(bǔ)Ca營(yíng)養(yǎng)食品。不同來(lái)源的膠原蛋白肽的Ca，Na，K及P質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異較大，在食品工業(yè)中應(yīng)用時(shí)建議進(jìn)行各元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)摸底，以選擇適宜原料的膠原蛋白肽。同一來(lái)源的膠原蛋白肽中同一元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)仍然有較大差異，可能與產(chǎn)品的制備工藝相關(guān)。