黃培培 艾克拜爾·熱合曼 米爾孜合買提·買買提明 阿爾孜古麗·木塔力甫 謝 輝＊

（1、齊魯醫(yī)藥學(xué)院機能學(xué)實驗中心，山東 淄博255000 2、寧德師范學(xué)院化學(xué)與材料學(xué)院，福建 寧德352100 3、烏魯木齊市第四人民醫(yī)院戒酒科，新疆 烏魯木齊830000 4、新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院臨床檢驗中心，新疆 烏魯木齊830001 5、新疆醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)教研室，新疆 烏魯木齊830011）

酒精濫用嚴(yán)重危害個人健康，長期飲酒會引起慢性肝臟損害和精神認(rèn)知障礙及其它身體障礙，同時產(chǎn)生酒精依賴，導(dǎo)致個人和社會公共安全問題[1]。在酒精依賴患者的治療監(jiān)測和司法鑒定中，需要新的可靠的、準(zhǔn)確的生化指標(biāo)物，這對個體健康和社會安全具有重要意義。然而，眾所周知，酒精飲用傳統(tǒng)的生化指標(biāo)物如丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷胺酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）和平均紅細(xì)胞體積（MCV）[2]，均缺乏敏感度和特異性。所以，迫切需要用于早期檢測酒精攝入過多的新的標(biāo)志物。

CDT 是無唾液酸轉(zhuǎn)鐵蛋白、單唾液酸轉(zhuǎn)鐵蛋白和二唾液酸轉(zhuǎn)鐵蛋白的總和[3，4]，其中二唾液酸轉(zhuǎn)鐵蛋白含量最多。研究表明，糖缺陷轉(zhuǎn)鐵蛋白（CDT）水平與酒精飲用度有密切的關(guān)系。飲酒會增加血清CDT 含量，尤其是無唾液酸和二唾液轉(zhuǎn)鐵蛋白[4]，每天飲酒60-80g 持續(xù)至少10-15 天時，該值明顯升高，而戒酒治療2 周或3 周時，則CDT 值恢復(fù)到正常水平。自1976 年[3]被首次發(fā)現(xiàn)后，CDT 已經(jīng)迅速成為基礎(chǔ)和臨床研究中用于檢測重度酒精的焦點[3，4]。

最近二十年，一個基于Sebia（Every，F(xiàn)rance）分析原理的完全自動的毛細(xì)管區(qū)帶電泳法（CZE）技術(shù)迅速發(fā)展起來[3-7]。CZE可以檢測所有轉(zhuǎn)鐵蛋白及其基因變異體。有研究證實檢測CDT的毛細(xì)管電泳法目前已擁有了良好的精密度、可靠的線性范圍[3，4]。這篇文章，我們將測試新疆未飲酒健康者、偶爾飲酒者、酒精依賴者的CDT 含量并進行差異分析，為酒精依賴臨床診斷、治療監(jiān)測和司法鑒定提供科學(xué)檢測數(shù)據(jù)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

毛 細(xì) 管 區(qū) 帶 電 泳Capillarys （Sebia， 法 國）。 冰 箱（FCD-217SE，海爾電冰柜）。低速大容量離心機（TDL-50B，上海安亭科學(xué)儀器廠）。羅氏cobas c311 全自動生化分析儀（Mannheim，德國），貝克曼庫爾特LH750 血細(xì)胞分析儀（Coulter，美國）。Capillarys CDT 試劑盒（Sebia 公司）：CDT 正常質(zhì)控品（批號：23022/01）和高值質(zhì)控品（批號：07062/01）、堿性緩沖液（批號：07055/80）、樣品稀釋液（批號：26055/01）、洗液（批號：01065/80）和CDT 洗液（批號：06015/01）；質(zhì)控條形碼、稀釋小杯、濾器、CDT 清洗杯。一次性使用真空貯血管（贛達醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 研究對象及分組

新疆烏魯木齊市第四人民醫(yī)院戒酒科提供漢族、維吾爾族、哈薩克酒精依賴患者血樣141 份和漢族、維吾爾族、哈薩克偶爾飲酒者血樣154 份，新疆醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科提供73份未飲酒健康人血樣。共368 份血樣。研究對象分成三組：未飲酒健康人組（23 個漢族人、21 個維吾爾族人、29 個哈薩克族人）、偶爾飲酒者組（57 個漢族人、65 個維吾爾族人、32 個哈薩克族人）和酒精依賴者組（72 個漢族人、31 個維吾爾人、38 個哈薩克族人）。新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會允許進此項研究。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

護士在清早人員空腹時收集靜脈血樣于不含抗凝劑的真空采血管中。樣品取回后，用離心機（TDL-50B）3000r/min 離心5分鐘。離心后，取上清液保存于-20℃冰箱中，直至測量。

1.3.2 毛細(xì)管區(qū)帶電泳檢測CDT 含量

毛細(xì)管電泳儀配備有8 個毛細(xì)管，17.5cm×25mm。毛細(xì)管電泳儀可以同時檢測7 個樣品，其中8 號位置放樣品稀釋液。毛細(xì)管電泳法依據(jù)不同轉(zhuǎn)鐵蛋白亞型電荷差異進行區(qū)分，可提供可見的轉(zhuǎn)鐵蛋白亞型條帶，并對不同亞型分別進行定量，毛細(xì)管電泳法是在200 nm 處檢測肽鍵的紫外（UV）吸收峰[3，5]。二唾液酸轉(zhuǎn)鐵蛋白等電點PI 為5.7，無唾液酸轉(zhuǎn)鐵蛋白PI 為5.9，單唾液酸轉(zhuǎn)鐵蛋白PI 為5.8[8，9，10]。在毛細(xì)管區(qū)帶電泳系統(tǒng)中（Sebia，F(xiàn)rance），帶電分子在具有一定pH 的堿性緩沖液中根據(jù)電解液的pH 和電滲流的不同，而遷移分離開。CDT 值以無唾液酸轉(zhuǎn)鐵蛋白和二唾液酸轉(zhuǎn)鐵蛋白峰面積之和（A0+A2）占無唾液酸轉(zhuǎn)鐵蛋白到五唾液酸轉(zhuǎn)鐵蛋白峰面積之和（A0+A2+A3+A4+A5）的 百 分 比 形 式 表 達[11]，即CDT=（A0+A2）/（A0+A2+A3+A4+A5）×100%。毛細(xì)管電泳法主要將各亞型分離后再進行吸光度檢測，依據(jù)峰面積來計算出CDT 與轉(zhuǎn)鐵蛋白總量的百分比[3，5，12]。所有操作根據(jù)制作商提供的說明書的操作步驟完成。根據(jù)制作商的指令，CDT 值＞1.6%為陽性，1.3%＜CDT 值≤1.6%需要再次檢查，CDT≤1.3 為陰性[11]。電泳分析使用軟件CAPILLARYS release 6.1.2 完成。

1.3.3 精密度實驗

準(zhǔn)備低、中、高濃度的CDT 血清樣品，每種濃度的樣品分別連續(xù)進樣5 次，按1.3.2 毛細(xì)管電泳條件進行檢測，測得CDT值，其RSD 值為1.245 0%～5.826 8%。見表1。

表1 毛細(xì)管電泳儀測量糖缺陷轉(zhuǎn)鐵蛋白的精密度

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS21.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 漢、維、哈三民族健康未飲酒者和酒精依賴者CDT 含量

CDT 包括無唾液酸轉(zhuǎn)鐵蛋白和二唾液酸轉(zhuǎn)鐵蛋白。正常人，CDT 含量極少，主要是二唾液酸轉(zhuǎn)鐵蛋白，幾乎不含無唾液酸轉(zhuǎn)鐵蛋白或單唾液酸轉(zhuǎn)鐵蛋白[3，5]，如表2、圖1。飲酒后，尤其是酒精依賴者體內(nèi)轉(zhuǎn)鐵蛋白所含的唾液酸分子減少，使二唾液酸轉(zhuǎn)鐵蛋白、無唾液酸轉(zhuǎn)鐵蛋白的轉(zhuǎn)鐵蛋白亞型水平升高[4]。酒精依賴者體內(nèi)的二唾液酸轉(zhuǎn)鐵蛋白含量明顯增加[13]，且出現(xiàn)無唾液酸轉(zhuǎn)鐵蛋白，如表3、圖2。無唾液酸轉(zhuǎn)鐵蛋白、二唾液酸轉(zhuǎn)鐵蛋白、三唾液酸轉(zhuǎn)鐵蛋白、四唾液酸轉(zhuǎn)鐵蛋白、五唾液酸轉(zhuǎn)鐵蛋白在圖表中分別使用0-sialo、2-sialo、3-sialo、4-sialo、5-sialo來表示。表2、表3 中各唾液酸值均以其占所有唾液酸百分含量來表示。

表2 CZE 法健康未飲酒者血清CDT 檢測結(jié)果值

圖1 未飲酒者血清CDT 毛細(xì)管電泳檢測圖

表3 CZE 法酒精依賴者血清CDT 檢測結(jié)果值

圖2 酒精依賴者血清CDT 毛細(xì)管電泳檢測圖

2.2 新疆三個民族健康未飲酒者組、偶爾飲酒者組、酒精依賴者組CDT 含量差異分析

表4 新疆漢、維、哈三個民族未飲酒者組、偶爾飲酒者組、酒精依賴者組CDT 水平的比較

健康未飲酒者、偶爾飲酒者和酒精依賴者三組之間的CDT含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見表4。健康未飲酒組與偶爾飲酒者組之間的CDT 水平差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），健康未飲酒者組與酒精依賴者組間的CDT 水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）,偶爾飲酒者組與酒精依賴者組間的CDT 水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見表6。

各民族受試正常健康人群CDT 含量之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），各民族偶爾飲酒人員CDT 含量之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），酒精依賴者組漢、維、哈三民族間的CDT水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表4。漢族與維吾爾族之間CDT 水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），漢族與哈薩克族之間CDT 水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），維吾爾族與哈薩克族之間CDT 水平差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），如表5。

表5 酒精依賴者組CDT 的兩兩比較結(jié)果

2.3 轉(zhuǎn)鐵蛋白遺傳變異的頻率

在368 個新疆人的血清CDT 中，15 個血清樣品有轉(zhuǎn)鐵蛋白的遺傳變異（B 型或D 型），變異率為4.07%。毛細(xì)管電泳變異圖如圖3，2-sialo=0.6%，變異體97.9%，變異體1.5%。

圖3 血清CDT 毛細(xì)管電泳遺傳變異圖

3 討論

毛細(xì)管電泳法由于其固有的高選擇性、易操作、高生產(chǎn)率、自動化、省時省力等特點，被臨床優(yōu)選確認(rèn)使用。本文選擇此方法檢測新疆漢族、維吾爾族、哈薩克族未飲酒健康人、偶爾飲酒者和酒精依賴者血清中CDT 的含量。結(jié)果顯示漢、維、哈三個民族中酒精依賴人群血清CDT 水平之間具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。CDT 是一個靈敏度、特異性最佳的標(biāo)記物，將作為司法鑒定酒精依賴的標(biāo)記物。

表6 未飲酒健康人組、偶爾飲酒者組、酒精依賴者組CDT 兩兩比較結(jié)果

人轉(zhuǎn)鐵蛋白的38 個遺傳變異會引起氨基酸替換[3，5]。常見的等位基因型是陽極B 型和陰極D 型等位基因。D 型-轉(zhuǎn)鐵蛋白可以引起非濫用者的假陽性結(jié)果，B 型-轉(zhuǎn)鐵蛋白可以引起慢性酒精濫用的假陰性結(jié)果。CZE 可以檢測所有轉(zhuǎn)鐵蛋白及其基因變異體，避免不準(zhǔn)確的CDT 測量。據(jù)報道，白種人的遺傳變異率是低的（＜1%），而非洲裔美國人、非洲黑人和美國南部土著人的遺傳變異率是高的[3，5]。本文研究結(jié)果顯示新疆人轉(zhuǎn)鐵蛋白變異的頻率是4.07%，這比Hee-Won Moon[5]和Binbin Song[3]的研究變異率稍低。Hee-Won Moon[5]研究顯示在韓國人中，變異率為4.1%。Binbin Song[3]研究顯示在中國漢族人中，變異率為4.14%。

盡管有大量研究試圖解釋飲酒為何能使轉(zhuǎn)鐵蛋白中的唾液酸含量減少，但是目前具體機制仍不明確[4]，確定其中并不是一個簡單的過程，而是由多種酶類參與、多步驟的過程[15]。在健康的對照組中尚未發(fā)現(xiàn)無唾液酸轉(zhuǎn)鐵蛋白和單唾液酸轉(zhuǎn)鐵蛋白。這證實了酒精濫用會引起轉(zhuǎn)鐵蛋白的唾液酸缺失，這可能是由于糖基轉(zhuǎn)移酶改變，特別是唾液酸轉(zhuǎn)移酶。

本次研究，不能準(zhǔn)確地評估飲酒習(xí)慣，因為我們的評估是基于回顧性研究。然而，長期飲酒的前瞻性實驗可能會發(fā)生倫理問題，這對進一步研究造成一定困難。另外，部分研究對持續(xù)飲用量定義不明，比如有關(guān)文獻報道在持續(xù)酒精飲用（50-80g/d）中至少一周后血CDT 的濃度增加[5]，而另一份報道卻顯示酒精飲用（60g/d）至少兩周后CDT 濃度增加[14]，戒斷期間，CDT 值慢慢恢復(fù)正常。盡管在CDT 水平和慢性酒精飲用間有一個清晰的關(guān)系，但如何用CDT 值來診斷酒精濫用程度尚未清楚，迫切需要更多的研究來解決這個問題。