艾立瑤，秦東旭，王力波，宋 英

（浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州310014）

神經(jīng)退行性疾病為慢性進(jìn)行性疾病，其特征在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感覺或認(rèn)知系統(tǒng)中神經(jīng)元和軸突的喪失.神經(jīng)退行性疾病包括阿爾茨海默氏?。ˋD）、帕金森?。≒D）、亨廷頓?。℉D）、精神分裂癥和肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）雖都具有不同臨床表型和遺傳病因的疾病，但都是由神經(jīng)變性過程形成的[1].現(xiàn)有的針對(duì)這些疾病的藥物只能通過緩解癥狀來延緩疾病進(jìn)展；然而，這些藥物不能對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行治愈，也無法預(yù)防神經(jīng)元的潛在退化.所以需要新的策略預(yù)防由神經(jīng)炎癥和神經(jīng)變性引起的進(jìn)行性神經(jīng)元損失.

香芹酚（CA）是在許多芳香植物中發(fā)現(xiàn)的酚類單萜，包括牛至和百里香[2].已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其具有抗癌、抗氧化、抑菌、調(diào)節(jié)血糖、抗炎等多種生物學(xué)活性[3].進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn) CA容易穿過血腦屏障（BBB）并調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)節(jié)劑，如多巴胺[4-5].以前的研究已經(jīng)證明了CA在不同動(dòng)物模型中的神經(jīng)保護(hù)作用，這些作用與抗氧化和抗炎作用相關(guān)[6].但是，CA在神經(jīng)退行性疾病中潛在的藥理學(xué)應(yīng)用需要進(jìn)一步研究.本研究應(yīng)用H2O2處理PC12細(xì)胞制作體外神經(jīng)元損傷模型.由于PC12細(xì)胞具神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的一般特征，因其具有可傳代培養(yǎng)的特點(diǎn)，廣泛的被作為神經(jīng)元細(xì)胞模型，應(yīng)用于腦缺血損傷[7]、化學(xué)性缺氧損傷[8]、神經(jīng)元分化[9]以及軸突生長(zhǎng)[10]等神經(jīng)系統(tǒng)疾病、神經(jīng)生理和神經(jīng)藥理學(xué)的體外研究.CA已被證明在抗氧化和抗凋亡方面有較好作用，而主要研究CA對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞損傷的修復(fù)作用和對(duì)神經(jīng)突生長(zhǎng)的作用.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器主要試劑：DMEM培養(yǎng)基（吉諾生物醫(yī)藥科技有限公司）、PBS（吉諾生物醫(yī)藥科技有限公司）、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰酶（吉諾生物醫(yī)藥科技有限公司）、胎牛血清（碧云天）、馬血清（Gibco）、B27 添加劑（Gibco）、N2 添加劑（Gibco）、二苯基四氮哇澳鹽（MTT，Sigma）、多聚賴氨酸（PLL，Sigma）、Hoechst 33341（碧云天）等.

主要儀器：酶標(biāo)儀（型號(hào)：speetramaxMZe）、垂直流超凈臺(tái)（ESCO，SCV-4A1）、CO2培養(yǎng)箱（Thermo Scientific系列8000）、顯微鏡（Nikon）等.

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1 PC12細(xì)胞培養(yǎng) PC12細(xì)胞培養(yǎng)于質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃體積分?jǐn)?shù)5%的CO2一定飽和濕度環(huán)境條件下連續(xù)培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài).

1.2.2 神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng) 從新生SD乳鼠的腦中提取原代皮質(zhì)神經(jīng)元，皮質(zhì)與大腦分離，置于預(yù)冷的Hank緩沖液中沖洗.再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.125%胰蛋白酶-EDTA在37℃下消化組織25 min.將細(xì)胞懸浮液以1 000 r/min離心5 min.然后將細(xì)胞沉淀物首先置于含多聚賴氨酸預(yù)涂蓋玻片的培養(yǎng)基中（DMEM，質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%馬血清），并在體積分?jǐn)?shù)5%的CO2濃度的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng).4 h時(shí)，將培養(yǎng)基更換為神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基（DMEM，質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%馬血清和質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的B27），并且每2～3 d更換1次.3 d后更換阿糖胞苷培養(yǎng)基抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng).

1.3 PC12細(xì)胞模型的建立與觀察為了觀察H2O2對(duì)細(xì)胞的損傷情況，將PC12細(xì)胞接種于96孔板.在培養(yǎng)液中加入不同濃度的H2O2，正常對(duì)照不加H2O2，僅加入等量的培養(yǎng)液，放在37℃體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱孵育.藥物處理24 h后，倒置顯微鏡下觀察PC12細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)情況.

1.4 細(xì)胞活性檢測(cè)

1.4.1 細(xì)胞存活率檢測(cè) 采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率.96孔板每孔加入10 μL MTT（質(zhì)量濃度5 mg/mL溶于磷酸鹽緩沖液（PBS）），置于37℃體積分?jǐn)?shù)5%的CO2，培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，棄去上清液，每孔加入 150 μL 二甲基亞砜（DMSO），震蕩10 min，待結(jié)晶完全溶解后，酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)490 nm處吸光值.以正常組所測(cè)的MTT吸光值為100%，損傷組及藥物處理組與正常組的比值百分比，計(jì)算存活細(xì)胞數(shù)的百分率.

1.4.2 細(xì)胞凋亡檢測(cè) Hoechst 33342核染色用來檢測(cè)細(xì)胞凋亡率.將PC12細(xì)胞接種于24孔板上，經(jīng)藥物處理后，加入Hoechst 33342，使其終體積濃度達(dá)到10 μL/mL，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照.

1.5 細(xì)胞突起長(zhǎng)度分析PC12細(xì)胞以3×104/孔的密度接種于6孔板，熒光顯微鏡下觀察并拍照，每組隨機(jī)選取5張圖，應(yīng)用Image J圖像分析軟件分別測(cè)量每張圖片中所有PC12突起的總長(zhǎng)度及神經(jīng)元的總數(shù)目，計(jì)算PC12細(xì)胞神經(jīng)元突起的平均長(zhǎng)度.

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析通過均數(shù)±標(biāo)注差（x±s）表示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，單因素方差分析采用 Graphpad Prism 5.0軟件進(jìn)行，多組間比較Tukey檢驗(yàn).

2 結(jié)果

2.1 H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷

2.1.1 H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞活力降低 用不同濃度H2O2作用于PC12，光鏡顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài).顯微鏡拍照結(jié)果可見對(duì)照組細(xì)胞胞體飽滿，以長(zhǎng)梭形為主，部分呈圓形或三角形，突起光滑粗大，交互成網(wǎng)狀.隨著 H2O2濃度上升，可見實(shí)驗(yàn)組PC12細(xì)胞胞體大部分萎縮變圓，突起明顯變短甚至消失，細(xì)胞損傷嚴(yán)重（圖1A）.MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率.結(jié)果提示，與對(duì)照組相比，損傷組MTT吸光度隨H2O2濃度升高逐漸降低，證明細(xì)胞存活率隨H2O2濃度升高不斷下降（圖1B）.

2.1.2 H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡增加 Hoechst 33342熒光染色發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組罕見凋亡小體，損傷組隨著H2O2濃度增加，凋亡小體比例逐漸增加（圖1BC）.

2.1.3 H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞突起減少 通過圖像軟件分析統(tǒng)計(jì)得出隨著H2O2濃度上升，細(xì)胞突起長(zhǎng)度發(fā)生短縮（圖1E）.（A）PC12的形態(tài)學(xué)觀察.（B）MTT測(cè)定（n=3）.（C）Hoechst 33342染色.（D）PC12細(xì)胞凋亡率的分析.數(shù)據(jù)表示平均值±SD.P＜0.000 1與對(duì)照組相比.（E）PC12細(xì)胞的神經(jīng)突長(zhǎng)度分析.數(shù)據(jù)表示平均值±SD.P＜0.000 1與對(duì)照組相比.

2.2 香芹酚對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷PC12細(xì)胞的保護(hù)

2.2.1 香芹酚降低H2O2誘導(dǎo)損傷PC12細(xì)胞凋亡MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率.檢測(cè)結(jié)果顯示濃度0.01 mmol/L CA能明顯改善細(xì)胞活力，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05（圖2B），而濃度較高時(shí)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)活力有較大影響，說明CA對(duì)細(xì)胞有一定的毒性.Hoechst 33342熒光染色發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組少見凋亡小體，CA給藥組（濃度0.001和0.01 mmol/L）的凋亡小體較損傷組都有較明顯的減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），而濃度0.1 mmol/L的CA凋亡小體減少趨勢(shì)較小（圖2CD）.

2.2.2 香芹酚對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷PC12細(xì)胞突起的保護(hù)作用 顯微鏡拍照結(jié)果可見損傷組較對(duì)照組PC12細(xì)胞胞體萎縮變圓，突起明顯變短（圖2A）.測(cè)量對(duì)照組及損傷組PC12細(xì)胞突起長(zhǎng)度，結(jié)果顯示，和對(duì)照組比較，損傷組PC12細(xì)胞突起明顯變短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1）.CA組和損傷組比較，PC12細(xì)胞突起明顯延長(zhǎng)，濃度 0.001 mmol/L CA和0.01 mmol/L CA有較明顯趨勢(shì)，差異明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.000 1（圖2E）.

（A）PC12的形態(tài)學(xué)觀察.（B）MTT測(cè)定（n=3）.（C）Hoechst 33342染色.（D）PC12細(xì)胞凋亡率的分析.數(shù)據(jù)表示平均值±SD.P＜0.001，與對(duì)照組相比.P ＜0.001，與 H2O2組相比.（E）PC12細(xì)胞的神經(jīng)突長(zhǎng)度分析.數(shù)據(jù)表示平均值±SD.P＜0.000 1，與對(duì)照組相比.P＜0.000 1，與H2O2組相比.

圖1 細(xì)胞損傷檢測(cè)Fig.1 Cell damage detection

圖2 CA對(duì)PC12細(xì)胞的作用Fig.2 Effect of CA on PC12 cells

2.3 CA對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞神經(jīng)突起的作用檢測(cè)結(jié)果顯示，神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）組較對(duì)照組有神經(jīng)突延長(zhǎng)趨勢(shì)，差異P＜0.01（圖3A）.另外CA組和正常組比較，神經(jīng)突變長(zhǎng)，差異P＜0.01（圖3B）.

（A）神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)觀察.（B）加入CA后一天神經(jīng)元的神經(jīng)突長(zhǎng)度分析.數(shù)據(jù)表示平均值±SD.（C）加入CA后兩天神經(jīng)元的神經(jīng)突長(zhǎng)度分析.數(shù)據(jù)表示平均值 ±SD.P＜0.01，與對(duì)照組相比.（D）加入CA后3 d神經(jīng)元的神經(jīng)突長(zhǎng)度分析.數(shù)據(jù)表示平均值±SD.P＜0.01，與對(duì)照組相比.

圖3 CA在神經(jīng)元細(xì)胞的影響Fig.3 Effect of CA on neurons

3 討論

氧化應(yīng)激是由活性物質(zhì)（過氧化物和氧自由基）的產(chǎn)生與清除之間的不平衡引起的.導(dǎo)致ROS大量積累，造成鈣穩(wěn)態(tài)的失調(diào)、脂類的過氧化和神經(jīng)細(xì)胞的死亡[11].研究表明，阿爾茲海默癥（AD）[12]等神經(jīng)退行性疾病都與氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，其特征在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)感覺或認(rèn)知系統(tǒng)中神經(jīng)元和軸突的喪失.PC12細(xì)胞為鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化而來的神經(jīng)細(xì)胞株，與神經(jīng)細(xì)胞在發(fā)生學(xué)上均來源于神經(jīng)脊，在結(jié)構(gòu)、功能上與神經(jīng)元有很多相似之處，是一種常用的神經(jīng)細(xì)胞株.而過氧化氫（H2O2）是氧化應(yīng)激模型常用的損傷藥物，通過氧化應(yīng)激作用可能誘導(dǎo)多種細(xì)胞的凋亡.本文通過H2O2損傷PC12細(xì)胞24 h建立氧化損傷模型，隨著H2O2濃度增加，細(xì)胞損傷程度逐漸加重，100 μmol/L濃度H2O2組細(xì)胞損傷較輕，而800 μmol/L濃度引起的細(xì)胞損傷較重，因此確定400 μmol/L為H2O2最適損傷濃度.隨著H2O2濃度增加，細(xì)胞凋亡率也隨之增加，細(xì)胞活力減少，細(xì)胞突起縮短.

香芹酚作為較有應(yīng)用前景的臨床藥物，除了抗炎、抗氧化應(yīng)激反應(yīng)、抗細(xì)胞凋亡以及抗腫瘤等生物學(xué)效應(yīng)[13].因其能通過血腦屏障，較多在不同動(dòng)物模型的神經(jīng)保護(hù)進(jìn)行研究，已被證實(shí)CA具有神經(jīng)保護(hù)作用.本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平上設(shè)立了不同濃度CA對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷細(xì)胞的作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)濃度0.01 mmol/L的CA組對(duì)照H2O2損傷組細(xì)胞活力有明顯增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡率明顯下降.另外H2O2降低了神經(jīng)突長(zhǎng)度，而在存在CA的情況下，PC12細(xì)胞可以將神經(jīng)突長(zhǎng)度恢復(fù)到一個(gè)較高的水平.證明CA可對(duì)損傷神經(jīng)細(xì)胞突觸進(jìn)行修復(fù)，使神經(jīng)細(xì)胞突觸較損傷組有一定的延長(zhǎng).

神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)單元，神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元之間通過突觸緊密聯(lián)系.突觸是將一個(gè)神經(jīng)元的沖動(dòng)傳到另一個(gè)神經(jīng)元或另一細(xì)胞間的相互接觸的結(jié)構(gòu)，包括突觸前膜、突觸間隙和突觸后膜三部分.通過突觸完成神經(jīng)元之間的信息傳遞與加工處理，這一過程中神經(jīng)元個(gè)體也需要通過突觸來完成自我的信息反饋，所以突觸傳導(dǎo)對(duì)神經(jīng)元活動(dòng)的影響也有著重要的意義[14].神經(jīng)元中的神經(jīng)突向外生長(zhǎng)是神經(jīng)退行性和神經(jīng)保護(hù)的標(biāo)志[1].神經(jīng)突生長(zhǎng)是神經(jīng)元發(fā)育，突觸形成和神經(jīng)再生的重要前提.所以促進(jìn)神經(jīng)突的生長(zhǎng)和神經(jīng)細(xì)胞損傷后的修復(fù)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的治療顯得尤為重要.在我們的研究中，發(fā)現(xiàn)CA對(duì)經(jīng)H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷細(xì)胞的活力增強(qiáng)、細(xì)胞凋亡減少、神經(jīng)細(xì)胞突起增長(zhǎng).所以確定了CA對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞損傷后的修復(fù)作用.另外將CA作用于神經(jīng)元細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)突起較正常組有一定的延長(zhǎng)，能夠促進(jìn)神經(jīng)突的生長(zhǎng)，進(jìn)一步證明了CA對(duì)神經(jīng)細(xì)胞突起的增長(zhǎng)作用.這也為香芹酚應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供一定的理論基礎(chǔ)，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供依據(jù).

綜上結(jié)果表明，CA可對(duì)神經(jīng)細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用，對(duì)神經(jīng)損傷具有一定的修復(fù)作用.并且CA對(duì)神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育、神經(jīng)突向外生長(zhǎng)都有一定的促進(jìn)作用，因此CA應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病需要進(jìn)一步研究.