李北林 鄧益斌 羅艷紅

[摘要] 目的 觀察松花粉對人肝癌SK-Hep-1細胞凋亡和自噬的影響，探討松花粉抗腫瘤作用及機制，為松花粉的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。 方法 體外培養(yǎng)SK-Hep-1細胞，隨機分為4組，分別為對照組、松花粉小劑量組（30 mg/mL）、松花粉中劑量組（45 mg/mL）、松花粉大劑量組（60 mg/mL）。CCK-8法檢測不同濃度松花粉干預(yù)不同時間（12、24、48、72 h）后的SK-Hep-1細胞抑制率;松花粉處理48 h后，相差顯微鏡和Hoechst33258熒光染色觀察細胞形態(tài)學(xué);流式細胞術(shù)觀察細胞凋亡率;RT-PCR檢測自噬相關(guān)mRNA表達水平。 結(jié)果 CCK-8法檢測顯示，松花粉能顯著抑制SK-Hep-1細胞增殖，并具有時間和劑量依賴性;相差顯微鏡顯示松花粉可以抑制細胞的增殖;Hoechst33258熒光染色顯示，與對照組比較，松花粉小、中、大劑量組細胞形態(tài)發(fā)生明顯的凋亡樣改變;Annexin V-FITC/PI雙染法結(jié)果顯示，與對照組比較，松花粉小、中、大劑量組細胞凋亡率明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）;RT-PCR分析顯示，與對照組比較，松花粉干預(yù)48 h后，松花粉小、中、大劑量組Beclin-1、LC3-Ⅱ表達明顯上調(diào)，而P62表達下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。 結(jié)論 松花粉能有效抑制人肝癌SK-Hep-1細胞增殖，促進其凋亡，并誘導(dǎo)其發(fā)生自噬，松花粉可能通過誘導(dǎo)自噬促進肝癌細胞凋亡。

[關(guān)鍵詞] 松花粉;SK-Hep-1細胞;凋亡;自噬

[中圖分類號] R285? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）05（a）-0013-05

Study on the effect of apoptosis and autophagy of pine pollen on human hepatocellular carcinoma SK-Hep-1 cells

LI Beilin? ?DENG Yibin? ?LUO Yanhong

Youjiang Medical University for Nationalities， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Baise? ?533000， China

[Abstract] Objective To observe the effect of pine pollen on apoptosis and autophagy of human hepatocellular carcinoma SK-Hep-1 cells， and to explore the anti-tumor effect and mechanism of pine pollen， so as to provide experimental basis for the clinical application of pine pollen. Methods SK-Hep-1 cells were cultured in vitro and randomly divided into 4 groups： the control group， the pine pollen low-dose group （30 mg/mL）， the pine pollen medium-dose group （45 mg/mL）， and the pine pollen high-dose group （60 mg/mL）. The inhibition rate of SK-Hep-1 cells was determined by CCK-8 method after pine pollen intervention at different concentrations at different time （12， 24， 48 and 72 h）. After pollen treatment for 48 h， cell morphology was observed by phase contrast microscopy and Hoechst33258 fluorescence staining. The apoptosis rate was observed by flow cytometry and mRNA expression levels of autophagy were detected by RT-PCR. Results CCK-8 assay showed that pine pollen could significantly inhibit SK-Hep-1 cell proliferation in time and dose dependence. Phase contrast microscopy showed that pine pollen could inhibit cell proliferation. Hoechst33258 fluorescence staining showed that， compared with the control group， the pine pollen low-dose， medium-dose and high-dose groups showed obvious apoptotic changes in cell morphology. Annexin V-FITC/PI double staining results showed that the apoptosis rates in the pine pollen low-dose， medium-dose and high-dose groups were significantly increased compared with the control group， with statistically significant differences （P < 0.05 or P < 0.01）. RT-PCR analysis showed that， compared with the control group， intervention of pine pollen intervention after 48 h， the expression of Beclin-1， LC3-Ⅱwas up-regulated obviously in the pine pollen low-dose， medium-dose and high-dose groups， but P62 expression was down-regulated， with statistically significant differences （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Pine pollen can effectively inhibit the proliferation of human hepatocellular carcinoma SK-Hep-1 cells， promote their apoptosis， and induce their autophagy. Pine pollen may promote apoptosis of hepatocellular carcinoma cells by inducing autophagy.

[Key words] Pine pollen; SK-Hep-1 cells; Apoptosis; Autophagy

肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，肝癌死亡率占全世界癌癥死亡的第3位，其中占男性癌癥死亡率的第2位[1]。中國是全球肝癌發(fā)病率最高的國家之一，其死亡人數(shù)占世界肝癌死亡人數(shù)的50%[2]。肝癌發(fā)病率與年齡和性別有關(guān)，隨年齡增長而升高，男性發(fā)病率為女性的3倍[3]。肝癌具有惡性程度高、易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移等特點[4]，因此，肝癌的防治已成為醫(yī)藥界亟待解決的問題。

松花粉（pine pollen），為松科植物馬尾松和油松等的花粉。其味甘、性溫，具有止血、祛風(fēng)益氣、收濕等功效[5]。通過H22荷瘤小鼠實驗，證明松花粉主要通過逆轉(zhuǎn)荷瘤小鼠的膽汁酸合成降低以及其他的氨基酸代謝障礙發(fā)揮體內(nèi)的抗腫瘤作用[6]。因此，本研究從體外實驗探討松花粉作用于SK-Hep-1細胞后，其增殖、凋亡和自噬的變化，為松花粉的臨床應(yīng)用提供更多的理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人肝癌細胞株SK-Hep-1細胞，購于廣西醫(yī)科大學(xué)。

1.2 藥物及試劑

松花粉（中國新時代公司，批號：1907012）;DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibico公司，批號：C11995500BT）;胎牛血清（浙江天抗生物公司，批號：11011-8611）;Hoechst33258熒光染料（索萊寶公司，貨號：IH0060）;CCK-8檢測試劑盒（博士德生物公司，貨號：AR1160）;Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（賽默飛公司，貨號：88-8005-72）;熒光定量試劑盒（Roche公司，貨號：4913914001）;AxyPrep總RNA小量制備試劑盒（AxyPrep公司，貨號：AP-MN-MS-RNA-50G）。

1.3 儀器

CO2恒溫培養(yǎng)箱（日本三洋公司，型號：MCO-18AIC），高速冷凍離心機（Eppendorf公司，型號：5427R）;倒置相差顯微鏡（Leccia公司，型號：LEICADMIL）;羅氏實時熒光定量PCR儀（德國Roche，型號：lightCycler96）;多功能酶標儀（Berthold，型號：TriStar LB941）;流式細胞儀（美國BD公司，型號：FACSVerse）;生物安全柜（蘇凈集團安泰公司，型號：BSC-1600ⅡB2）。

1.4 藥物制備

9 g松花粉溶于300 mL雙蒸水中，小火煮開15 min，濃縮至100 mL，過濾取上清液，藥物濃度為90 mg/mL。

1.5 細胞培養(yǎng)與分組

SK-Hep-1細胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM及含1%青霉素與鏈霉素雙抗。取對數(shù)生長期的細胞為研究樣本，實驗均重復(fù)3次。實驗分為4組：對照組、松花粉小劑量組（30 mg/mL）、松花粉中劑量組（45 mg/mL）、松花粉大劑量組（60 mg/mL）。

1.6 CCK-8法檢測松花粉對SK-Hep-1細胞增殖能力的作用

SK-Hep-1細胞接種于96孔板中，每孔5×104個細胞。分別設(shè)置空白對照組、正常對照組，以不同濃度松花粉處理細胞12、24、48和72 h，每個組設(shè)5個復(fù)孔。按試劑說明書操作。抑制率=[（對照孔OD值-實驗孔OD值）/（對照孔OD值-空白孔OD值）]×100%吸光度。

1.7 相差顯微鏡觀察SK-Hep-1細胞的形態(tài)學(xué)變化

以“1.5”分組方法處理細胞，藥物干預(yù)48 h后，相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)學(xué)變化。

1.8 Hoechst33258檢測細胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化

細胞接種于12孔板中，每孔1×105個細胞。藥物作用48 h后吸出培養(yǎng)基，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗2次。用4%的甲醛室溫固定15 min，取出PBS清洗3次。Hoechst33258試劑常溫避光染色30 min后，PBS清洗3次。直接在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.9 Annexin V-FITC/PI雙染結(jié)合流式細胞術(shù)檢測松花粉對SK-Hep-1細胞凋亡的影響

以“1.5”分組方法處理細胞，藥物干預(yù)48 h后，消化并收集細胞，1000 r/min，半徑5 cm，離心3 min。用1×Binding Buffer緩沖液將各組的細胞密度調(diào)至5×106/mL，培養(yǎng)48 h，按試劑說明書操作。

1.10 RT-PCR檢測自噬相關(guān)基因Beclin-1、LC3-Ⅱ、P62的mRNA表達水平

以“1.5”分組方法處理細胞，藥物干預(yù)48 h后，去除培養(yǎng)基。①細胞總RNA的提取：采用AxyPrep總RNA小量制備法提取總RNA，再使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA的1 μg mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)條件：42℃ 60 min，70℃10 min。②qPCR：PCR反應(yīng)體系為50 μL，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃15 s，58℃ 10 s和72℃ 10 s，完成45個循環(huán)。qPCR使用羅氏LightCycler96實時熒光定量PCR系統(tǒng)。以GAPDH作為內(nèi)參，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt表示mRNA的相對定量，ΔCt=Ct靶基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組。引物詳細序列見表1。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 松花粉對SK-Hep-1細胞增殖的影響

使用不同濃度的松花粉處理SK-Hep-1細胞后，細胞受到明顯的抑制。隨著松花粉濃度和作用時間的延長，抑制率逐漸增高。各濃度及作用時間對SK-Hep-1細胞的影響見圖1。由于松花粉作用48 h時，抑制率基本達到平臺期，故后續(xù)的實驗均采用48 h。

2.2 松花粉抑制SK-Hep-1細胞的形態(tài)學(xué)變化

與對照組比較，松花粉小、中、大劑量組細胞數(shù)目逐漸減少，細胞間隙增大，排列紊亂，細胞形態(tài)固縮變圓，隨著松花粉濃度的增大，部分細胞基本失去原有的形態(tài)，呈漂浮狀。見圖2。

2.3 Hoechst33258染色法觀察細胞形態(tài)學(xué)改變

對照組SK-Hep-1細胞胞膜完整，輪廓分明，核呈圓形，著色比較均勻。隨著松花粉濃度的增大，可見細胞核出現(xiàn)凋亡的特征性改變：核固縮，核碎裂，形成大小不一的塊狀。細胞核的改變見圖3。

2.4 松花粉對SK-Hep-1細胞凋亡的影響

與對照組比較，不同濃度的松花粉干預(yù)SK-Hep-1細胞后，細胞凋亡率隨著松花粉濃度的增大而增大，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。見圖4、表2。

2.5 松花粉誘導(dǎo)肝癌SK-Hep-1細胞自噬相關(guān)mRNA表達水平的改變

與對照組比較，松花粉干預(yù)48 h后，松花粉小、中、大劑量組Beclin-1、LC3-Ⅱ表達明顯上調(diào)，而P62表達下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。見圖5。

3 討論

肝癌的治療方法主要有放化療、生物免疫治療、分子靶向藥物治療和手術(shù)切除等，此類治療措施對中晚期遠處轉(zhuǎn)移的病灶治療效果不佳，其主要用于治療早期小肝癌等[7-8]。同時，放化療藥物毒副作用大，價格昂貴，對患者造成極大的精神和經(jīng)濟負擔(dān)。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，許多中藥通過抑制肝癌細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡、抑制侵襲和遷移等作用，達到殺滅肝癌細胞的目的[9]。中草藥相比于西藥，毒副作用小，通過中草藥可以達到延緩衰老、抗疲勞、保健等目的[10]。

松花粉，富含多糖、維生素、礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分和近百種生物活性成分[11]。近年研究發(fā)現(xiàn)松花粉具有增強免疫力、改善胃腸道功能、保護肝臟、調(diào)節(jié)血脂和抑制前列腺增生等作用[12]。通過實驗，松花粉在大鼠模型中不會引起明顯的毒性[13]。同時，松花粉具有明顯的增效減毒作用[14-15]。

本課題組前期以松花粉處理人肝癌細胞HepG2細胞株，闡明了松花粉具有對抗肝癌細胞的持續(xù)生長、抑制血管生成和細胞遷移的作用。本研究通過CCK-8實驗和相差顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)松花粉對細胞的增殖具有顯著的抑制作用。

細胞凋亡是由基因控制的自主有序的死亡，是細胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象。促進腫瘤細胞凋亡，對腫瘤治療有著重要的意義[16-17]。本研究結(jié)果提示，松花粉可以促進SK-Hep-1細胞凋亡，其凋亡率與松花粉呈明顯的量效關(guān)系。熒光顯微鏡下可見細胞核出現(xiàn)凋亡的特征性改變：核固縮，核碎裂。

細胞自噬是真核生物中進化保守的對細胞內(nèi)物質(zhì)進行周轉(zhuǎn)的重要過程[18]。自噬過程中一些損壞的蛋白或細胞器被雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小泡包裹后，送入溶酶體或囊泡中進行降解并得以循環(huán)利用[19]。泛素結(jié)合蛋白P62與蛋白質(zhì)的泛素化密切相關(guān)，P62是反映自噬活性的標記蛋白之一，其含量間接反映自噬小體清除水平[20]。LC3-Ⅱ和Beclin-1在哺乳動物細胞自噬過程中起著促進作用[21]。本實驗通過對自噬相關(guān)mRNA表達水平的研究，松花粉作用48 h后，與對照組比較，自噬相關(guān)基因Beclin-1、LC3-Ⅱ表達明顯上調(diào)，而P62表達下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。這表明，SK-Hep-1細胞經(jīng)松花粉處理后發(fā)生了自噬。

綜上所述，松花粉對肝癌SK-Hep-1細胞具有明顯的抑制增殖并誘導(dǎo)凋亡和自噬的作用，它可能通過誘導(dǎo)自噬促進肝癌細胞凋亡。松花粉有望成為治療肝癌的新藥物，為臨床上肝癌的治療方案提供新的思路和途徑。

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（收稿日期：2019-08-20? 本文編輯：顧家毓）