田 政 肖博文 張 環(huán)* 鄧全富

(重慶登康口腔護(hù)理用品股份有限公司,重慶 400025)

前言

隨著生活水平不斷提高，人們越來越關(guān)注自己的口腔健康，對口腔衛(wèi)生用品——牙膏的要求也越來越高，除單一清潔功能外，還需要具有護(hù)齦、抑菌、美白、抗敏等附加功能。牙齦炎是發(fā)生在牙齦組織的細(xì)菌感染性疾病，表現(xiàn)為牙齦出血、紅腫、脹痛，變異鏈球菌、具核梭桿菌等是牙齦炎的主要致病菌[1-3]。我國有超過百分之八十的成年人出現(xiàn)了不同程度的牙齦問題，使用抑菌劑抑制口腔有害細(xì)菌的生長，是維護(hù)口腔健康的重要環(huán)節(jié)，目前，尋找天然、有效的植物抑菌劑成為研究熱點，采用有抑菌功效的天然提取物來制備牙膏，賦予牙膏抑菌護(hù)齦功效，將備受消費者青睞[4,5]。

葡萄柚提取物是一種天然提取物，是一種廣譜抑菌類化合物，高效且很有發(fā)展?jié)摿?，殺菌在非常低的濃度時就可取得顯著的效果。柚皮苷是葡萄柚果提取物的活性成分之一，具有多種生物活性，如抗氧化、抗突變、抗腫瘤、抑菌、改善微循環(huán)等，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用[6,7]。本研究對葡萄柚提取物中柚皮苷的變異鏈球菌和具核梭桿菌最小抑菌濃度MIC值進(jìn)行測定，并根據(jù)最小抑菌濃度計算出牙膏中的添加量，考察了牙膏的穩(wěn)定性，及其牙膏中柚皮苷含量，為含葡萄柚提取物的抑菌護(hù)齦牙膏制備提供理論支持和試驗依據(jù)。

1 試驗部分

1.1 試驗材料

葡萄柚提取物：淺黃色澄清液體，柚皮苷含量為7.68mg/ml菌種：變異鏈球菌ATCC 25175，具核梭桿菌 ATCC 25586

培養(yǎng)基：雙倍TPY培養(yǎng)基，胰蛋白胨30g、酵母提取物8g、葡萄糖20g、12g KH2PO4、4g K2HPO4·3H2O、4g Na2CO3、4g NaCl，加水至 1000 mL，pH =7.0 ，滅菌備用，對應(yīng)雙倍固體培養(yǎng)基只需在其中加入 24g 的瓊脂。雙倍牛心浸液瓊脂培養(yǎng)基，稱取市售BHI瓊脂粉74g，加水至1000 mL，充分溶解，121℃滅菌15min, 4℃冰箱保存，使用時將其融化后冷卻至50℃左右，加入5%～10%脫脂纖維綿羊血，混勻后傾注于平板上。

液體石蠟

真空制膏機(jī)及牙膏用原料

1.2 試驗方法

1.2.1 葡萄柚提取物MIC值測定方法

1.2.1.1 制備菌懸液

將菌種進(jìn)行活化培養(yǎng)48小時后，配制成細(xì)菌濃度為 106CFU/mL 的供試菌懸液。

1.2.1.2 比濁法測定最小抑菌濃度

(1) 配制好液態(tài)培養(yǎng)基，反復(fù)過濾，然后按照以下方法稀釋測試樣品：

實驗組：每批取8支大小相同的滅菌小試管，向8支管內(nèi)分別加入5ml滅菌液態(tài)培養(yǎng)基，在第一管內(nèi)加入4mL葡萄柚提取物樣品和1mL的含0.5%吐溫 80的0.9%的無菌生理鹽水，用渦旋儀混勻，配成柚皮苷濃度為 3.07 mg/mL 的含樣品培養(yǎng)基，然后吸取5mL到第二管，再從第二管吸取5mL到第三管，依次類推進(jìn)行二倍稀釋，最后一支管吸取5mL棄去。最終得到柚皮苷濃度分別為：(3.07、1.54、0.77、0.38、0.19、0.096、0.048、0.024mg/mL)。

對照組(0.6%山梨酸鉀)：取一支相同的試管，加入5mL培養(yǎng)基，再加入 5mL 含 0.5%吐溫80的0.9%的無菌生理鹽水，最后加入0.06g山梨酸鉀。充分混勻后，吸取5mL棄去。

空白組：取一支相同的試管，加入5mL培養(yǎng)基，再加入5mL含0.5%吐溫80的 0.9%的無菌生理鹽水，充分混勻后，吸取5mL棄去。

(2)準(zhǔn)確吸取 106CFU/mL 的菌懸液 40uL，加入到系列濃度的各樣品試管中，混勻，在具核梭桿菌中加入液體石蠟封口。置于厭氧罐中 37 ℃下培養(yǎng) 24h-48h，并與現(xiàn)制備的未經(jīng)培養(yǎng)的含菌試管作對照，觀察生長狀況。

(3)吸取10ml以上含菌懸液的樣品管和對照管于平皿中,加入10mL雙倍BHI瓊脂培養(yǎng)基和5%-10%的脫脂纖維綿羊血，充分混勻，37℃于厭氧罐中培養(yǎng)48h，菌落生長完全被抑制的最低濃度則為該樣品的MIC。

1.2.2 含葡萄柚提取物的牙膏穩(wěn)定性測定

選擇一個比較有代表性的基礎(chǔ)配方(見表1)，加入一定量的葡萄柚果提取物進(jìn)行牙膏穩(wěn)定性研究。

表1 牙膏配方

(1)穩(wěn)定性測試依據(jù) GB/T 8372-2017《牙膏》進(jìn)行室溫3個月和45℃加速老化3個月測試(模擬室溫3年，3年為市面牙膏常規(guī)保質(zhì)期)。

(2)牙膏中柚皮苷含量測定參照《口腔清潔護(hù)理用品 牙膏中柚皮苷含量的測定 高效液相色譜法(報批稿)》。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄柚提取物的MIC值

通過比濁法測定葡萄柚提取物的最小抑菌濃度，測試結(jié)果見表2。測試結(jié)果顯示，葡萄柚提取物中柚皮苷對變異鏈球菌和具核梭桿菌這兩種口腔細(xì)菌種都有較好的抑制作用，其對變異鏈球菌和具核梭桿菌的 MIC 值均為 0.048mg/mL，與文獻(xiàn)值[8](0.04688 mg/mL)基本吻合。

表2 葡萄柚提取物的MIC值

2.2含葡萄柚提取物的牙膏穩(wěn)定性

根據(jù)抑菌測試結(jié)果，可推算出葡萄柚提取物(柚皮苷含量為7.68mg/ml)在牙膏中的添加量應(yīng)不低于0.65%時，柚皮苷含量可達(dá)到該葡萄柚提取物的MIC值,起到抑制變異鏈球菌和具核梭桿菌的效果。為驗證葡萄柚提取物加入到牙膏中對膏體穩(wěn)定性的影響，選擇一個比較有代表性的基礎(chǔ)配方進(jìn)行研究，添加葡萄柚果提取物百分比含量分別為0.65%、0.75%、1%，放于室溫和45℃烘箱進(jìn)行跟蹤測試，觀察樣品的感官指標(biāo)、理化指標(biāo)、衛(wèi)生指標(biāo)、柚皮苷含量等，結(jié)果見表3、表4。

表3 含葡萄柚提取物牙膏的穩(wěn)定性測試數(shù)據(jù)

表4 牙膏中柚皮苷含量測定數(shù)據(jù)

由表3可以看出，含葡萄柚提取物的牙膏配方1、配方2、配方3穩(wěn)定性滿足《牙膏(GB/T 8372-2017)》標(biāo)準(zhǔn)的要求，膏體細(xì)膩、均勻，在三個月加速老化試驗過程中，pH無顯著性變化，穩(wěn)定性好，膏體無變色、分水、分油異?，F(xiàn)象，通過三個月穩(wěn)定性試驗。由表4可以看出，牙膏中柚皮苷含量參照《口腔清潔護(hù)理用品 牙膏中柚皮苷含量的測定 高效液相色譜法(報批稿)》測定時，配方1、配方2、配方3的柚皮苷含量均可檢出，3個月室溫試驗，柚皮苷含量基本穩(wěn)定，3個月加速老化試驗，柚皮苷含量略有下降，為保證牙膏中45℃加速老化試驗后牙膏的柚皮苷含量高于葡萄柚果提取物的最小抑菌濃度0.048mg/ml,建議牙膏中葡萄柚果提取物(柚皮苷含量為7.68mg/ml)的添加量不低于0.75%。

3 結(jié)論

①葡萄柚提取物對變異鏈球菌和具核梭桿菌這兩種口腔細(xì)菌種都有較好的抑制作用，其對變異鏈球菌和具核梭桿菌的 MIC 值均為 0.048mg/mL。

②牙膏中葡萄柚提取物的添加量為0.65%～1%時，牙膏穩(wěn)定性好，通過三個月45℃加速老化穩(wěn)定性測試，但牙膏的柚皮苷含量在加速老化實驗中略有下降，為保證牙膏在3年保質(zhì)期內(nèi)柚皮苷含量高于0.048mg/ml,建議牙膏中葡萄柚果提取物(柚皮苷含量7.68mg/ml)的添加量不低于0.75%。