張曉鷹，劉興偉，張興會，黃國衛(wèi)，張立斌，武師良，王曉銘，鄒麗娜，宋恩吉

（1.遼寧省現代農業(yè)生產基地建設工程中心，沈陽 110000；2.遼寧省建平縣畜牧技術推廣總站，遼寧 建平 122400；3.建平縣動物疫病預防控制中心，遼寧 建平 122400；4.蓋州市畜牧技術推廣站，遼寧 蓋州 115200）

近年來，遼西驢以耐粗飼、出肉率高、肉質鮮美、皮質好、出膠率高等深受市場的青睞，飼養(yǎng)數量逐年增加，養(yǎng)殖量居全國前列，已成為我國重要的肉驢生產及供種基地。為了做好遼西驢品種資源的保護利用，同時解決缺少優(yōu)秀種驢等實際問題，遼西驢項目組于2019年6—8月開展了遼西驢細管冷凍精液的制作研究，并取得了良好成效。

1 材料與方法

1.1 精液來源

精液來源于建平縣芮林牧業(yè)有限公司的4頭種公驢。

1.2 試劑及藥品

無機鹽（分析純）、糖類、乙二醇、甘油［1］等試劑及抗菌素等。

1.3 試驗器材

400～600 倍光學顯微鏡［2］、離心機、恒溫水浴鍋、超低溫溫度儀、控溫冰箱、電子天平、0.5 mL與0.25 mL細管［3］等。

1.4 試驗方法

1.4.1 篩選冷凍稀釋液 冷凍稀釋液包括以乙二醇為防凍劑的初選配方，以等量甘油替代乙二醇為防凍劑的二次篩選配方，不同含量的防凍劑的優(yōu)化配方。各配方具體成分見表1、表2、表3。

表1 初選凍精稀釋液配方成分

表2 二次篩選凍精稀釋液配方成分

表3 優(yōu)化凍精稀釋液配方成分

1.4.2 稀釋液配制 原精離心液配制：蔗糖分析純試劑110 g，加純化水1 000 mL煮沸至蔗糖全部溶解。

冷凍稀釋液配制：準桷稱量各配方中的基礎試劑，煮沸，溶解，制成溶液，常溫冷卻后加入抗菌素和卵黃，攪拌均勻。

1.4.3 精液離心與稀釋 原精經紗布（6～8層）過濾［4］后，按1∶1體積比例加入離心液［5］，緩慢均勻混合后，裝入離心管，在（30±4）℃范圍內以2 000 r／min［6］離心10min；離心后精液棄去上清液后在干凈的容器內按1∶1～1∶2加入冷凍稀釋液，等溫緩慢混勻。

1.4.4 降溫平衡 稀釋后的精液放入緩沖容器內，封口，進行降溫平衡。

1.4.5 精液冷凍溫度 初凍溫度［7］分別設置為（90±5）℃、（100±5）℃、（110±5）℃、（120±5）℃、（130±5）℃、（140±5）℃共6組，當凍精細管變成乳白色時全部浸入液氮中。

1.4.6 細管凍精解凍及質量檢測 解凍后，在37℃環(huán)境下檢查活力、頂體完整率和存活時間［8］。

1.4.7 分析方法 采用SPSS軟件進行統計分析［8］，用LSD法多重比較各處理的差異性。

2 結果與分析

2.1 不同的稀釋液初選配方冷凍效果比較（見表4）

表4 不同的稀釋液初選配方的冷凍效果

從表4可以看出：C1配方的解凍后活力、凍后頂體完整率均最高。據此，以C1配方為首選配方。

2.2 凍精稀釋液配方的第二次篩選（見表5）

從表5可以看出：用等量的甘油替代乙二醇作為防凍劑，冷凍后精子活力A2＞A1，B2＞B1，C2＞C1；解凍后精子的解凍完整率A2＞A1，B2＞B1，C2＞C1，凍精解凍后在38℃下存活時間A2＞A1，B2＞B1，C2＞C1。上述情況表明，采用等量的甘油替代乙二醇作為防凍劑可以提高遼西驢細管凍精的綜合質量。

表5 第二次篩選的凍精稀釋液配方效果比較

2.3 優(yōu)化稀釋液配方中不同甘油濃度對凍精質量的影響（見表6）

表6 不同甘油濃度對凍精質量的影響

由表6可以看出：C23（甘油含量為5mL）冷凍后活力、凍后頂體完整率、存活時間都比其他組高，其中C23的精子冷凍后活力較C21相比差異極顯著（P＜0.01），與C22、C25相比差異顯著（P＜0.05），與C24比較差異不顯著（P＞0.05）；C23凍后頂體完整率與C21、C22、C25相比差異顯著（P＜0.05），與C24比較差異不顯著（P＞0.05）；精子解凍后38℃下存活時間以C23組最高，與C21比較差異極顯著（P＜0.01），與C22、C25比較差異顯著，C23與C24比較差異不顯著（P＞0.05）。綜上所述，甘油的添加量以5 mL最為適宜。

2.4 不同的冷凍溫度對冷凍效果的影響

使用C23配方配制稀釋液，對不同的初凍溫度下各組冷凍效果進行比較結果見表7。

表7 不同的冷凍溫度對冷凍效果的影響

由表7可以看出：不同初凍溫度的冷凍結果存在微小的差異，冷凍后活力以（100±5）℃～（120±5）℃較好，但各組間差異不顯著。凍后的頂體完整率也存在同樣的規(guī)律。因此，可以初步判定初凍溫度應控制在（90±5）℃～（140±5）℃的溫區(qū)內，溫度過高或過低對冷凍結果均會造成不良影響。

2.5 不同的平衡時間對冷凍效果的影響

使用配方C23對原精進行稀釋，利用冰箱低溫保存稀釋后的精液，將冰箱的溫度設置為2℃，降溫到2℃最短的時間為6 h，測定降溫平衡后不同時間的細管凍精的解凍效果，結果見表8。

由表8可以看出：精液稀釋后，在2℃下降溫平衡10 h效果最好，解凍后精子活力從高到低依次為平衡10，8，12，18，14，6，16 h。平衡10 h與平衡8，12 h間差異不顯著（P＞0.05），平衡10 h與平衡18，6，14 h間差異顯著（P＜0.05）；精子頂體完整率各組間差異不顯著（P＞0.05），但與精子解凍后活力的變化規(guī)律是相同的，即降溫平衡10 h效果最好，從高到低依次為平衡10，8，14，16，12，18，6 h。精子解凍后38℃下存活時間以平衡10 h最長，18 h最短。由此所見，精液降溫平衡時間過長或較短都不好，以6～12 h為宜，與山羊凍精平衡適宜時間（2～4 h）有較大區(qū)別。

表8 降溫平衡時間對細管凍精效果的影響

2.6 不同的平衡溫度對冷凍效果的影響

使用配方6對原精進行稀釋，將控溫冰箱的溫度分別調整到0，2，4～5℃（允許上下波動0.5℃），通過調整溫度緩沖容器內的細管精液量和包裹物層數等方法，使每份稀釋后的細管精液在10 h降溫到0℃和4℃，待溫度穩(wěn)定后進入冷凍程序操作，比較解凍后的精子活力及頂體完整率的變化，結果見表9。

表9 不同平衡溫度對冷凍效果的影響

從表9可以看出：平衡溫度以0℃組解凍后精子活力最好，其次為2℃組，4～5℃組最低，0℃組與其他兩組間差異顯著（P＜0.05）；頂體完整率比較，三組之間差異均不顯著（P＞0.05）。解凍后38℃下存活時間，以0℃下平衡最長，4～5℃平衡時最短。可見在0℃下進行精液降溫平衡，可以取得較好的冷凍效果。

2.7 不同的解凍溫度對細管凍精質量的影響試驗

將生產的同一批次的細管凍精按照試驗要求分組，再使用不同溫度的熱水進行解凍，觀察精子的存活情況，結果見表10。

由表10可以看出：遼西驢細管凍精解凍后活力、頂體完整率和解凍后在38℃存活時間各項指標隨著解凍溫度的提高而增加，表明高溫解凍有利于精子的凍后復蘇?？紤]38℃、40℃解凍的各項指標與＞40℃解凍的各項指標差異性不大；高溫解凍需要操作者操作快速、反應靈敏、對解凍的時間掌握得準確及時，才能收到好的效果；高溫解凍在生產現場水溫的保持有一定的困難，因此，以38～40℃的溫水解凍為宜。

表10 不同的解凍溫度對驢細管凍精質量的影響

2.8 不同容量細管精液冷凍效果比較（見表11）

由表11可以看出，0.25 mL細管與0.5 mL細管盛裝遼西驢精液進行冷凍后，兩組之間的解凍后活力、頂體完整率、解凍后在38℃存活時間等均無差異，說明二者可以通用。

表11 0.5 m L和0.25 m L細管凍精冷凍效果比較

3 結論與討論

1）研究結果表明，以甘油為冷凍劑的配方（葡萄糖1.2 g、檸檬酸1.3 g、Tris 2.4 g、甘油5 mL、卵黃20 mL、雙蒸水70 mL、青鏈霉素各1×105IU）可為制作遼西驢細管冷凍精液的首選配方。

2）精液降溫平衡以時間8～12 h、溫度0～2℃的冷凍效果最好；精液初凍溫度在（90±5）℃～（140±5）℃的溫區(qū)內冷凍效果最好。

3）冷凍精液解凍時，隨著解凍溫度的提高解凍效果也隨著提高，建議以38～40℃的溫水解凍較為適宜。

4）0.5 mL和0.25 mL細管凍精冷凍和解凍效果無差異，在生產實踐中建議0.5 mL細管為宜。

本研究因季節(jié)限制沒進行細管凍精受胎率試驗，有待于進一步的試驗驗證。