李娜 盧娜 邵輝 劉磊 李輝 張玉婷 郭永澤

摘? ? 要：本研究建立了豆芽中6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸鈉、2，4-滴和赤霉素4種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。樣品中殘留的藥物經(jīng)甲酸乙腈提取，提取液濃縮、甲醇定容后，采用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀在正、負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測掃描（MRM）模式下進(jìn)行測定，基質(zhì)外標(biāo)法定量。4種藥物在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均為0.999。對黃豆芽和綠豆芽中6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸鈉、2，4-滴和赤霉素在定量限（LOQ）、5倍LOQ和10倍LOQ 3個(gè)添加濃度水平下的回收率進(jìn)行測定，其平均回收率為81.6% ～94.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%～6.9%。6-芐基腺嘌呤、2，4-滴、4-氯苯氧乙酸鈉和赤霉素的定量限（S/N≥10）分別為0.005，0.02，0.05和0.05 mg·kg-1。該方法操作簡便，凈化效果好，靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度均符合多殘留分析的要求，可為豆芽中非法添加物的殘留監(jiān)控提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;豆芽;植物生長調(diào)節(jié)劑;殘留

中圖分類號：TS255.7? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.04.001

Abstract：? An ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric method was developed for the determination of residues of four kinds of plant growth regulators in bean sprout. The target compounds were 6-benzylam inopurine， 4-chlorphenoxyacetic sodium， 2， 4-D and gibberellic acid. The analytes were extracted with acetonitrile containing 1% formic acid solution， and evaporated to remove acetonitrile， then dissolved by methanol， finally detected by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry under multiple reaction monitoring （MRM） mode via positive and negative electrospray ionization. The results showed that the correlation coefficients of the calibration curves for the four compouds were 0.999 in the range of LOQ ～ 20LOQ. The method was validated at three fortification levels （LOQ， 5LOQ and 10LOQ） in soybean sprout and mung bean sprout. The respective mean recoveries were found to be between 81.6% and 94.4%， and the relative standard deviations （RSD） were between 2.4% and 6.9%. The limits of quantification （S/N≥10） of 6-benzylam inopurine， 2， 4-D， 4-chlorphenoxyacetic sodium and gibberellic acid were 0.005， 0.02， 0.05 and 0.05 mg·kg-1 respectively. It was indicated that the method developed in this study was easy， sensitive and good purified. The sensitivity， accuracy and precision of the method were all acceptable. The method can meet the requirements of the multiple residue analysis and can be further applied to investigate the illegitimate additive residues status in bean sprout.

Key words： ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; bean sprout; plant growth regulator; residue

近年來，全國多地曝出“毒豆芽事件”，即在豆芽生產(chǎn)過程中使用6-芐基腺嘌呤（6-BA）、4-氯苯氧乙酸鈉（4-CPA）、2，4-滴（2，4-二氯苯氧乙酸，2，4-D）和赤霉素（GA）等植物生長調(diào)節(jié)劑促進(jìn)豆芽快速生長，達(dá)到只發(fā)芽不生根目的，因此又稱無根豆芽素、豆芽激素。目前，豆芽生產(chǎn)中使用上述物質(zhì)的安全性尚無定論，但是如果食用過量，肯定會給人的身體健康帶來危害。

我國GB 2760-1996《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》曾允許6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸鈉用于豆芽生產(chǎn)，后又在新版國標(biāo)GB 2760-2011中撤銷。農(nóng)業(yè)部2015年第11號公告《關(guān)于豆芽生產(chǎn)過程中禁止使用6-芐基腺嘌呤等物質(zhì)的公告》，明確規(guī)定不得生產(chǎn)和銷售含有6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸鈉、赤霉素等物質(zhì)的豆芽，否則將依照法律法規(guī)予以處理。

目前，豆芽激素的檢測方法有液相色譜法[1-5]、氣相色譜法[1]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[2，6-15]等，但是已有檢測方法普遍存在單組分測定、前處理步驟繁瑣，不同組分采用不同的前處理方法、存在檢測周期長、耗時(shí)耗力等缺陷，已不能滿足檢測機(jī)構(gòu)的要求。因此，亟需建立通過一種多殘留檢測方法，能夠同時(shí)測定豆芽中多種植物生長調(diào)節(jié)劑的方法。

本研究建立了同時(shí)測定豆芽中6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸鈉、2，4-滴和赤霉素4種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，操作簡便、快速，節(jié)約成本，可為各食品檢測機(jī)構(gòu)對豆芽中非法添加物的監(jiān)控提供更加便捷的檢測，對保障豆芽的質(zhì)量安全具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

AcquityTM UPLC超高效液相色譜儀，Quattro Premier XE三重四極桿質(zhì)譜儀（配電噴霧離子源），（美國Waters 公司）;旋渦混合器（QL-901，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）;臺式高速離心機(jī)（H1650，湘儀離心機(jī)儀器有限公司）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Laborota 4000 efficient，德國Heidolph）; Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）等。

6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸鈉、2，4-滴和赤霉素標(biāo)準(zhǔn)品，純度均不低于99%，購自德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司;乙腈、甲醇為色譜純，購自美國Fisher公司;水為超純水;甲酸為分析純，購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

分別稱取各標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇溶解并定容，配制成濃度為100 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4 ℃溫度條件下保存，有效期3個(gè)月。分別吸取4種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備液1.25 mL于25 mL容量瓶，用甲醇稀釋并定容，配制成濃度為10 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4 ℃條件下保存，有效期1個(gè)月。

1.2 樣品前處理方法

準(zhǔn)確稱取搗碎的試樣5.00 g（精確至0.01 g）于50 mL聚丙烯離心管中，加入20 mL乙腈，于旋渦混合器上渦旋2 min，加入0.4 mL甲酸，再渦旋2 min，4 000 r·min-1離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至100 mL梨形瓶中，于40 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約2.5 mL，用甲醇定容至5 mL，過0.22 μm有機(jī)濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。

1.3 色譜條件

色譜柱：AcquityTM BEH C18柱 （2.1×50 mm，1.7 μm）;流動相：乙腈（A相）-0.1%甲酸水溶液（B相）;梯度洗脫條件見表1。進(jìn)樣量：10 μL;柱溫：30 ℃。

1.4 質(zhì)譜條件

電離模式：電噴霧正離子ESI（+）和負(fù)離子ESI（-）切換;毛細(xì)管電壓：3.0 kv;離子源溫度：110 ℃;脫溶劑氣溫度：380 ℃;脫溶劑氣流量：550 L·h-1;錐孔反吹氣流量：50 L·h-1;多反應(yīng)監(jiān)測掃描方式（MRM）;質(zhì)譜采集參數(shù)見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件? ? 在電噴霧正離子或負(fù)離子模式下分別對1 μg·mL-1的單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描，得到每種化合物的母離子，再進(jìn)行母離子二級質(zhì)譜全掃描，選擇信號強(qiáng)度較大的兩個(gè)碎片離子為特征離子，并優(yōu)化最佳錐孔電壓和碰撞能量，最后以多反應(yīng)監(jiān)測方式掃描。最優(yōu)的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2.1.2 液相色譜條件? 本研究選擇通用的Acquity BEH C18柱（2.1×50 mm， 1.7 μm），分別以乙腈和甲醇作為流動相，結(jié)果表明，相同條件下乙腈的洗脫能力更強(qiáng)，色譜峰形和響應(yīng)更好。分別以水、0.1%甲酸和0.1%甲酸（含5 mmol·L-1乙酸銨）為流動相水相，結(jié)果表明，0.1%甲酸效果最好，加乙酸銨后負(fù)離子的響應(yīng)并未提高，反而降低。因此，本研究以乙腈-0.1%甲酸為流動相。

采用梯度洗脫，研究4種化合物的最佳分離條件。經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，確定最佳的梯度洗脫條件：在0.2 mL·min-1的流速下，0～3 min，乙腈從10%勻速變化至90%;3～4 min，乙腈保持90%，4～5 min，乙腈保持10%，如表1所示。4種化合物能夠完全分離，且峰形良好，整個(gè)分析過程在5 min之內(nèi)即可完成。LOQ濃度水平豆芽加標(biāo)樣品中4種化合物的總離子流圖和MRM色譜圖見圖1和圖2。

2.2 定容溶液的選擇

本研究比較了乙腈、甲醇及不同比例的甲醇-水混合溶液作為定容溶液的溶解效果。結(jié)果表明，6-芐基腺嘌呤用甲醇溶解比乙腈效果好，其他3種化合物無明顯差別。此后又比較（10+90）、（20+80）、（50+50）等不同體積比的甲醇-水溶液的溶解效果，結(jié)果表明，當(dāng)甲醇-水的體積比為（50+50）時(shí)，溶解效果最好。因此，確定甲醇-水（50+50， v/v）為定容溶液。

2.3 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

文獻(xiàn)報(bào)道的提取溶劑有酸化乙腈[1，10-15]、酸化甲醇[1-2]、丙酮[1]、稀堿（0.01mol·L-1氫氧化鈉溶液）[1-2，4]、甲醇[3，5]和乙腈[6-7]，凈化方法有MCS柱[10]、HLB柱[13]固相萃取凈化法和QuEChERS方法[11-12，14-15]。

本研究嘗試采用乙腈提取，但酸性化合物4-氯苯氧乙酸鈉、2，4-滴和赤霉素回收率較低;用1%甲酸乙腈提取，3種酸性化合物回收率提高，但6-芐基腺嘌呤回收率降低。最終本研究采用乙腈和1%甲酸乙腈各提取1次，獲得了滿意的回收率，同時(shí)減少了有機(jī)溶劑用量。

此外，本研究采用提取液濃縮、定容后直接進(jìn)樣分析的前處理方法，通過增大定容體積、稀釋樣品基質(zhì)從而達(dá)到降低基質(zhì)干擾的目的，無需固相萃取等步驟，既操作簡便，又節(jié)約成本，為各食品檢測機(jī)構(gòu)提供了快速、便捷的檢測方法。

2.4 方法的線性、靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度

為了消除基質(zhì)效應(yīng)，本試驗(yàn)用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以各組分的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，線性方程和相關(guān)系數(shù)見表3。結(jié)果表明，4種化合物在各自的濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均為0.999。以信噪比大于3計(jì)算方法的檢出限，以信噪比≥10確定方法的定量限，6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸鈉、2，4-滴和赤霉素的定量限分別為0.005，0.05，0.02和0.05 mg·kg-1。在LOQ、5LOQ和10LOQ 3個(gè)濃度水平做加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度水平做5個(gè)平行樣品，按照上述方法進(jìn)行前處理和測定。在3個(gè)加標(biāo)濃度水平，4種化合物在黃豆芽和綠豆芽中的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 （RSD） 均列于表3中。4種化合物的平均回收率為81.6% ～94.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4% ～6.9% ，符合多殘留分析的要求。

3 討論與結(jié)論

本研究分別對液相色譜和質(zhì)譜儀器條件、定容溶液的種類和不同配比、樣品處理?xiàng)l件進(jìn)行了篩選和優(yōu)化，建立了同時(shí)測定豆芽中6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸鈉、2，4-滴和赤霉素4種非法添加物殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，采用基質(zhì)外標(biāo)法定量，可有效消除基質(zhì)效應(yīng)。

跟現(xiàn)有檢測方法相比，省去了QuEChERS或SPE柱凈化操作，采用乙腈和酸化乙腈各提取1次，提取液只經(jīng)過一步旋蒸，最后用甲醇稀釋并定容，解決了酸性化合物4-氯苯氧乙酸鈉和2，4-滴提取回收率較低的難題，同時(shí)簡化了前處理步驟，提高了檢測效率，節(jié)約了檢測成本。該方法操作簡便，凈化效果好，靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度均符合多殘留檢測技術(shù)的要求，可為食品檢測機(jī)構(gòu)對豆芽激素的日常監(jiān)控提供更加便捷的檢測技術(shù)支持。

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