荔枝泛素結(jié)合酶基因（LcUBC12）的生物信息學及表達特性分析

董晨 魏永贊 王弋 鄭雪文 李偉才 石勝友

摘要：【目的】分析荔枝泛素結(jié)合酶（E2）基因（LcUBC12）的生物學信息，并檢測其組織表達特異性及烯效唑處理下花穗不同發(fā)育階段中的表達情況，為研究E2響應烯效唑的作用機制及泛素化修飾在調(diào)控荔枝花穗發(fā)育中的功能提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳詮腻有笾ㄋ朕D(zhuǎn)錄組（RNA-seq）數(shù)據(jù)中篩選出的LcUBC12基因為參考序列，利用本地BLAST從荔枝基因組中查找出該基因cDNA全長（Litchi_GLEAN_10004716），并利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測LcUBC12基因在妃子笑荔枝不同組織及烯效唑處理下花穗不同發(fā)育階段的表達情況?！窘Y(jié)果】LcUBC12基因cDNA全長519 bp，編碼172個氨基酸，其編碼的蛋白分子量19.68 kD，等電點6.52，不穩(wěn)定指數(shù)35.70，親水性的平均值? -0.734，為親水穩(wěn)定蛋白，定位于細胞核，不存在信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)，包含典型的UBC12保守結(jié)構(gòu)域，屬于Class I家族E2蛋白，二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主。LcUBC12蛋白與向日葵（XP_022009656.1）、柑橘（XP_006466720.1）、草莓（XP_004300599.1）和蘿卜（XP_018466680.1）等UBC12蛋白的氨基酸序列同源性較高，分別為70.11%、68.16%、67.76%和67.03%。LcUBC12蛋白與蕓香科的柑橘UBC12親緣關(guān)系最近，其次是與同屬菊科的向日葵和萵苣UBC12蛋白親緣關(guān)系較近。LcUBC12基因在不同組織中表達量排序為雌花>雄花>種子>果皮>葉>莖>根>果肉。烯效唑處理0～21 d LcUBC12基因在花穗中的表達量與對照無明顯差異，烯效唑處理28 d其表達量明顯低于對照，但烯效唑處理35 d其表達量上調(diào)，且較對照高。【結(jié)論】LcUBC12基因具有組織表達特異性，在妃子笑荔枝雌花、雄花和種子中高效表達，推測其主要在花穗發(fā)育和生殖生長過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，但烯效唑處理后LcUBC12基因?qū)ㄋ氚l(fā)育發(fā)揮負調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞： 荔枝;妃子笑;泛素結(jié)合酶;基因;實時熒光定量PCR;生物信息學;花穗發(fā)育;組織表達

中圖分類號： S667.103.6? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）05-1091-07

Abstract：【Objective】Biological information of ubiquitin-conjugating enzyme（E2） gene（LcUBC12） in litchi was ana-lyzed， and the expression pattern specificity and the expression of LcUBC12 were studied in different stages of litchi inflorescences under uniconazole treatment. The results could provided a theoretical basis for studying the mechanism of E2 response to uniconazole and the function of ubiquitination modification in regulating the development of Feizixiao litchi inflorescences. 【Method】With LcUBC12 gene screened from the transcriptome data of the Feizixiao litchi inflorescences（RNA-seq） as reference sequence， the full-length cDNA of LcUBC12 was obtained by local BLAST to find the litchi genome（Litchi_GLEAN_10004716）. Real-time fluorescence quantitative PCR（qRT-PCR） was used to analyze the expression of Feizixiao litchi LcUBC12 in different tissues and at different developmental stages of inflorescence which were treated by uniconazole. 【Result】The cDNA of LcUBC12 gene was 519 bp in length，encoding 172 amino acids with a molecular weight of 19.68 kD and an isoelectric point of 6.52， and the instability index was 35.70， the average hydrophilic value was -0.734， which was a hydrophilic stable protein. The predicted subcellular localization was in the nucleus. There was no signal peptide and transmembrane. The structure contained a typical conserved UBC domain. It belonged to Class? I family E2 protein， the secondary structure of the protein was mainly random coiling. NCBI blast analysis indicated the homology of UBC12 protein amino acid sequence of LcUBC12 amino acid sequence with sunflower（XP_022009656.1），citrus（XP_006466720.1）， strawberry（XP_004300599.1） and radish（XP_018466680.1） were high， which were 70.11%，68.16%，67.76% and 67.03%，respectively.? Phylogenetic analysis indicated that LcUBC12 protein was the closest to citrus UBC12 of Rutaceae and also had close relationship with sunflowers and lettuce of the Compositae. qRT-PCR analysis indicated the expression of LcUBC12 gene in different tissues was female flower>male flower>seed>peel>leaf>stem>root>pulp. The expression treated by uniconazole at 28 d was lower than that in control， however the expression at 35 d up-regu-lated in treatment and was higher than that in control. 【Conclusion】The LcUBC12 gene has tissue expression specificity and is abundantly expressed in Feizixiao litchi female flowers， male flowers and seeds. It is speculated that it mainly plays an important role in the inflorescences development and reproductive growth of litchi， but LcUBC12 gene plays a negative regulatory role in inflorescences development after uniconazole treatment.

Key words： litchi; Feizixiao; ubiquitin-conjugating enzyme; gene; real-time fluorescence quantitative PCR; bioinformatics; inflorescences development; tissue expression

Foundation item： Basic Scientific Research Project of Central Public Welfare Research Institutes（1630062016006）;National Litchi and Longan Industrial Technology System Project（CARS-33-21）

0 引言

【研究意義】泛素化蛋白酶體途徑是一種真核生物蛋白質(zhì)翻譯后的修飾途徑。在該途徑中，泛素主要通過泛素蛋白酶與靶蛋白結(jié)合形成一條多泛素鏈，將底物蛋白泛素化，使靶蛋白被26S蛋白酶所識別并降解（Ciechanover et al.，2000;Pickart，2001）。在泛素化過程中，泛素與靶蛋白的結(jié)合需要3種酶參與，分別為泛素激活酶（Ubiquitin-activating enzyme，E1）、泛素結(jié)合酶（Ubiquitin-conjugating enzyme，E2）和泛素蛋白連接酶（Ubiquitin ligase，E3）。泛素化過程涉及三步酶促級聯(lián)反應：首先E1激活泛素分子，然后被激活的泛素分子連接到E2上，E3結(jié)合目標蛋白并促進E2將激活的泛素分子轉(zhuǎn)移到目標蛋白上，最終實現(xiàn)目標蛋白的泛素化（Kerscher et al.，2006）?？梢姡珽2作為植物蛋白泛素化降解途徑中的關(guān)鍵酶，包含典型的UBC保守結(jié)構(gòu)域，長約140～200個氨基酸，在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用（Cui et al.，2012）。因此，本研究通過克隆荔枝發(fā)育花和果實中的E2基因，研究其編碼蛋白生物學信息及表達特性，對其在荔枝坐果中的生物學功能研究具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，E2基因的研究主要集中在對DNA的修復進程和抗逆響應（王金利等，2010），在調(diào)控花和果實發(fā)育方面研究較少（Wang et al.，2014）。Picton等（1993）首次從番茄中克隆到E2基因，研究發(fā)現(xiàn)其在番茄葉片衰老和果實成熟過程中表達。王園等（2010）從香蕉采后早期抑制差減文庫中篩選得到E2基因（MaUCE1），研究發(fā)現(xiàn)MaUCE1基因可調(diào)控香蕉果實成熟過程中淀粉酶活性或含量，在香蕉果實成熟的分解代謝中發(fā)揮作用。Li等（2013）通過研究荔枝早期果實發(fā)育遮陰處理差異基因表達發(fā)現(xiàn)，遮蔭處理下UBCE2基因表達量上調(diào)，高于對照的表達量，推測遮陰處理對UBCE2基因表達發(fā)揮正向誘導作用。Wang等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，番茄中2個E2基因（SlUBC32和SlUBC41）參與調(diào)控番茄果實成熟，但具體分子調(diào)控機制尚不清楚。Dong等（2016）通過研究香蕉花后果實不同發(fā)育階段E2基因家族的表達情況發(fā)現(xiàn)，E2基因家族不同成員在果實發(fā)育不同階段行使功能，推測這些基因在果實發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。陳曙等（2018）通過研究低磷處理下玉米幼苗不同組織中E2基因的表達情況發(fā)現(xiàn)，ZmUBC17基因具有組織表達特異性，在葉片中大量表達，推測ZmUBC17基因是通過調(diào)控玉米對磷元素吸收和轉(zhuǎn)運間接影響光合作用效率。Nurdiani等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，水稻OsSCE1基因（LOC_ Os10g39120）在日本晴中過表達從而降低了植株對干旱脅迫的耐受性，而敲除OsSCE1基因后其耐旱性略升高，表明該基因可能在水稻干旱脅迫中起到負調(diào)節(jié)作用?！颈狙芯壳腥朦c】目前鮮見有關(guān)妃子笑荔枝花穗發(fā)育過程中E2基因（LcUBC12）表達的相關(guān)研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于本課題組前期烯效唑處理的荔枝花穗發(fā)育轉(zhuǎn)錄組（RNA-seq）數(shù)據(jù)，從中篩選出LcUBC12基因，利用本地BLAST從荔枝基因組中查找出該基因cDNA全長，并利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測LcUBC12在妃子笑荔枝不同組織及烯效唑處理下花穗不同發(fā)育階段的表達情況，分析該基因在調(diào)控妃子笑荔枝花穗發(fā)育中的作用，為研究E2響應烯效唑的作用機制及泛素化修飾在調(diào)控妃子笑荔枝花穗發(fā)育中的功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗材料為妃子笑荔枝，種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院南亞熱帶作物研究所荔枝栽培示范園。主要試劑：植物總RNA提取試劑盒（北京華越洋生物科技有限公司）、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermal Fisher Scientific公司）和SYBR Premix Ex TaqTM熒光定量PCR試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]。主要儀器設(shè)備：實時熒光定量PCR儀（羅氏LightCycler，北京龍躍生物科技發(fā)展有限公司）。

1. 2 樣品采集及處理

采集妃子笑荔枝的根、莖、葉、雌花、雄花、果肉、果皮和種子等組織。此外，隨機選擇樹齡相同、長勢相近的妃子笑果樹6株，當花穗抽生至約18 cm時，對整個樹冠噴施50 mg/L烯效唑（有效成分含量5%），噴至葉面滴水，對照不作任何處理。完全隨機區(qū)組排列，單株小區(qū)，3次重復。追蹤花穗和果實發(fā)育動態(tài)，分別在0、7、14、28、35和42 d取花穗樣品，用液氮速凍后于-80 ℃保存，用于后續(xù)RNA提取。

1. 3 生物信息學分析

基于妃子笑花穗RNA-seq數(shù)據(jù)（GenBank登錄號SRP092890）（Wei et al.，2017），篩選獲取荔枝LcUBC12基因轉(zhuǎn)錄本，利用本地BLAST查找荔枝基因組中該基因的cDNA序列全長，對其編碼蛋白（LcUBC12）進行生物信息學分析：利用ExPASy ProtParam和ProtScale預測其基本理化性質(zhì)、Plant-mPLoc進行亞細胞定位、SMART預測保守結(jié)構(gòu)域、SOPMA預測二級結(jié)構(gòu)、SignalP 4.1 Server預測信號肽、ExPASy TMPred預測跨膜結(jié)構(gòu)及NetPhos分析磷酸化位點。此外，利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST將LcUBC12蛋白氨基酸序列與其他物種的E2蛋白進行同源性比對。利用Clustalx 1.83進行多重序列比對。采用MEGA 6.0的鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（1000次重復，其他參數(shù)均為默認）。

1. 4 qRT-PCR檢測

參照植物總RNA提取試劑盒說明提取樣品的總RNA，用RNase-free DNase消化去除DNA污染，利用核酸蛋白檢測儀檢測RNA質(zhì)量和濃度。利用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。利用Pri-mer3plus設(shè)計LcUBC12基因的qRT-PCR引物（F：5'-AGCCGGGGAATTACGTCTTA-3';R：5'-ACCGT TGTCTTGCACTTAACC-3'）和內(nèi)參基因（GenBank登錄號HQ615689）引物（F：5'-GTGGTTCTACTATG TTCCCTG-3';R：5'-CTCGTCGTACTCATCCTTTG-3'），委托廣州艾基生物技術(shù)有限公司合成。qRT-PCR反應體系20.0 μL：cDNA 1.0 μL（相當于25 ng總RNA），10 μmol/L上、下游引物各2.0 μL，2×SYBR Premix Ex TaqTM 10.0 μL，ddH2O（無RNA酶）補足至20.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性2 min;94 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共進行40個循環(huán)。每個樣品設(shè)3次重復。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量，以根和處理0 d花穗為對照。

1. 5 統(tǒng)計分析

利用Excel 2016進行數(shù)據(jù)處理，SigmaPlot作圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 LcUBC12蛋白基本理化性質(zhì)分析及亞細胞定位結(jié)果

從烯效唑處理的妃子笑花穗RNA-seq數(shù)據(jù)中篩選獲取荔枝LcUBC12基因轉(zhuǎn)錄本（Unigene 0021028），通過本地BLAST從荔枝基因組中獲得該基因cDNA的核苷酸序列全長，該基因編號為Litchi_GLEAN_10004716，將其命名為LcUBC12。該基因在基因組中編碼區(qū)序列（CDS）全長為519 bp，編碼172個氨基酸，其編碼蛋白的分子量19.68 kD，分子式C879H1363N237O260S8，等電點6.52，不穩(wěn)定指數(shù)35.70，為穩(wěn)定蛋白，脂肪指數(shù)70.23，親水性的平均值為-0.734，存在明顯的疏水區(qū)和親水區(qū)，疏水氨基酸的最大值（1.311）小于親水性氨基酸的最大值（-2.944），且親水性氨基酸總數(shù)為127個，比疏水性氨基酸總數(shù)（36個）多，為親水蛋白（圖1）。LcUBC12蛋白亞細胞定位于細胞核。

2. 2 LcUBC12蛋白跨膜結(jié)構(gòu)及信號肽預測

利用TMPred對LcUBC12蛋白進行跨膜結(jié)構(gòu)預測分析，結(jié)果（圖2）表明，LcUBC12蛋白不存在跨膜區(qū)。利用SignalP 4.1 Server的euk network算法對LcUBC12蛋白N端30個氨基酸進行信號肽預測，結(jié)果以氨基酸殘基C/S/Y值表示，當C/S/Y平均分值>0.5時被認為存在信號肽，結(jié)果如圖3所示。C/S/Y平均分值<0.5，推測LcUBC12蛋白不含有信號肽，可能在細胞質(zhì)中合成，無蛋白轉(zhuǎn)運功能，為非分泌型蛋白。

2. 3 LcUBC12蛋白結(jié)構(gòu)域及磷酸化位點分析結(jié)果

如圖4所示，LcUBC12蛋白包含典型的泛素結(jié)合酶UBC保守結(jié)構(gòu)域（32～158 aa），并含有半胱氨酸活性位點，屬于Class I家族E2蛋白。利用NetPhos 3.1 Server預測分析LcUBC12蛋白的磷酸化位點，結(jié)果（圖5）顯示，該蛋白可能存在的磷酸化位點中有5個絲氨酸（Ser）、4個蘇氨酸（Thr）和3個酪氨酸（Tyr）。

2. 4 LcUBC12的蛋白二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果

如圖6所示，LcUBC12蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要包含α-螺旋（26.74%）、延伸鏈（18.60%）、β-折疊（6.98%）和無規(guī)則卷曲（47.67%）4種形式。其中無規(guī)則卷曲、α-螺旋和延伸鏈貫穿于整個氨基酸鏈，而β-折疊散布于無規(guī)則卷曲和α-螺旋附近。

2. 5 LcUBC12蛋白同源性比對和進化分析

將LcUBC12蛋白與其他13個物種UBC12蛋白進行氨基酸序列多重比對，結(jié)果如圖7所示。LcUBC12蛋白與向日葵（Helianthus annuus，XP_022009656.1）、柑橘（Citrus sinensis，XP_006466720.1）、草莓（Fra-garia vesca subsp. vesca，XP_004300599.1）、蘿卜（Raphanus sativus，XP_018466680.1）、甘藍型油菜（Brassica napus，XP_013723962.1）、醉蝶花（Tarenaya hassleriana，XP_010531183.1）、芥菜（Brassica juncea，ACI16426.1）、萵苣（Lactuca sativa，XP_02375 9845.1）、蕪菁（Brassica rapa，XP_009109342.1）、月季（Rosa chinensis，XP_024180934.1）、黃瓜（Cucumis melo，XP_008447054.1）、蓖麻（Ricinus communis，XP_002525098.1）和菠菜（Spinacia oleracea，XP_ 021861377.1）的UBC12蛋白氨基酸序列的同源性分別為70.11%、68.16%、67.76%、67.03%、66.49%、65.59%、66.49%、66.67%、66.95%、66.12%、65.03%、65.57%和65.22%。LcUBC12與其他物種UBC12蛋白有高度保守的UBC結(jié)構(gòu)域和相同的半胱氨酸活性位點。

荔枝為無患子科植物，但目前無患子科物種的UBC尚未見發(fā)表，因此只能與其他科UBC蛋白相比。利用MEGA 6.0構(gòu)建上述物種UBC12蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結(jié)果如圖8所示。LcUBC12與蕓香科的柑橘UBC12親緣關(guān)系最近，其次是與菊科的向日葵和萵苣UBC12蛋白親緣關(guān)系較近。同屬于十字花科的蘿卜、蕪菁、甘藍型油菜和芥菜UBC12蛋白也聚在同一分支上，再與隸屬于十字花目的醉蝶花聚在一起，表明其親緣關(guān)系較近;同屬薔薇科的草莓和月季UBC12蛋白也聚在同一分支上?？梢?，同科植物的UBC12蛋白親緣關(guān)系較近。

2. 6 LcUBC12基因表達分析結(jié)果

qRT-PCR檢測LcUBC12基因在不同組織中的時空表達模式及烯效唑處理下在花穗的表達情況。由圖9可知，LcUBC12基因在不同組織中表達量排序為雌花>雄花>種子>果皮>葉>莖>根>果肉，尤其在雌花、雄花和種子的表達量明顯高于其他組織，推測LcUBC12基因主要在花穗發(fā)育和生殖生長中發(fā)揮重要調(diào)控作用。由圖10可知，烯效唑處理0～21 d LcUBC12基因在花穗中的表達量與對照無明顯差異，烯效唑處理28 d其表達量明顯低于對照，但烯效唑處理35 d其表達量上調(diào)，且較對照高，推測LcUBC12分別在對照和烯效唑處理的花穗發(fā)育過程中發(fā)揮不同的調(diào)控功能。

3 討論

不同物種中含有不同數(shù)量的E2基因家族成員。目前，已從擬南芥（Kraft et al.，2005）、酵母（Michelle et al.，2009）、番茄（Wang et al.，2014）、玉米（Jue et al.，2015）、水稻（Zhiguo et al.，2015）和香蕉（Dong et al.，2016）中分別鑒定出14、50、39、75、52和72個E2基因家族成員。本研究通過分析荔枝品種妃子笑的花穗RNA-seq數(shù)據(jù)，共篩選到33個E2基因，其中LcUBC12基因在轉(zhuǎn)錄組中RPKM（Reads Per Kilobase per Million mapped reads，每百萬reads中來自于某基因每千堿基長度的reads數(shù)）值較高，通過LcUBC12基因生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，LcUBC12蛋白包含典型的泛素結(jié)合酶UBC保守結(jié)構(gòu)域（32～158 aa），并含有半胱氨酸活性位點，屬于Class I家族E2蛋白，亞細胞定位于細胞核。此外，不同物種E2基因序列高度保守，由于無患子科其他物種UBC蛋白尚未見發(fā)表，本研究將LcUBC12蛋白與其他科UBC12蛋白進行進化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LcUBC12蛋白與柑橘UBC12蛋白（XP_006466720.1）親緣關(guān)系最近。E2作為植物蛋白泛素化降解途徑中的關(guān)鍵酶在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，通過分析該基因的時空表達模式，有助于了解E2基因在生物體中潛在的功能。前人研究證實，在植物不同組織中E2基因均有表達，但不同組織間的表達量存在差異，例如石斛DoUBC24基因在不同組織中的表達量排序為花>莖>種子>根>葉（安紅強等，2016）;巴西橡膠樹中HbUBC5基因在花中的表達量僅次于樹皮（朱家紅等，2014），香蕉中MaUCE1基因在花和果實中的表達量均較高（王園等，2010）。本研究結(jié)果與上述前人研究結(jié)果相似。LcUBC12基因在不同組織中均有表達，但表達量存在差異，具有組織特異性，其中在雌花、雄花、種子等生殖器官中的表達量較高，推測LcUBC12基因在妃子笑荔枝花穗發(fā)育和生殖生長過程中發(fā)揮重要作用，尤其是在花和種子的發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在烯效唑處理花穗0～21 d，LcUBC12基因表達量與對照無明顯差異，在35 d時其表達量達到高峰，而對照在28 d時表達量達到峰值，可見，烯效唑處理LcUBC12基因出現(xiàn)表達峰較對照晚7 d，表明烯效唑作為生長延緩劑，可導致LcUBC12基因表達峰延遲，且烯效唑處理35 d時的表達量遠低于對照28 d的表達量，推測烯效唑處理后LcUBC12基因?qū)ㄋ氚l(fā)育發(fā)揮負調(diào)控作用。當無烯效唑處理（對照）時，LcUBC12基因在花穗發(fā)育28 d時表達量最高，42 d時表達量最低，推測LcUBC12基因在花穗發(fā)育的28 d時高效表達，發(fā)揮正向調(diào)控作用，今后可通過轉(zhuǎn)基因驗證LcUBC12基因在花穗發(fā)育中的功能。

4 結(jié)論

LcUBC12基因具有組織表達特異性，在妃子笑荔枝雌花、雄花和種子中高效表達，推測其主要在花穗發(fā)育和生殖生長過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，但烯效唑處理后LcUBC12基因?qū)ㄋ氚l(fā)育發(fā)揮負調(diào)控作用。

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（責任編輯 陳 燕）