李 蕊， 馬玉忠， 李睿文， 汪恩強

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000)

唾液是齦溝液、黏膜滲出液、唾液腺腺泡超滲液的混合體，由口腔腺體分泌產(chǎn)生，具有清潔、殺菌、排泄等多種功能[1]。最新科研成果表明，唾液成分的變化與機體病理生理狀態(tài)密切相關(guān)，唾液成分的變化可以作為疾病發(fā)生時的提示信息[2]，幫助臨床進行疾病診斷和對病理情況的掌控。并由于其采集方式較方便易行，非侵入性采集的方法可以減少對動物體的傷害，使其在越來越多的應(yīng)用于臨床的同時，也具有廣泛的使用前景。

目前，在對牛唾液的研究中，已經(jīng)有對發(fā)熱過程中急性相蛋白和氧化應(yīng)激標(biāo)記物的變化的初步研究[3]，但是還沒有在以子宮內(nèi)膜炎為模型下對奶牛唾液生物標(biāo)準(zhǔn)物變化的研究。子宮內(nèi)膜炎是由于飼養(yǎng)衛(wèi)生條件差，營養(yǎng)缺乏，激素分泌異常，病原微生物感染等因素導(dǎo)致的疾病，嚴(yán)重危害奶牛的生產(chǎn)繁殖性能，是阻礙畜牧業(yè)發(fā)展的重要產(chǎn)科疾病，給我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失。所以本試驗以子宮內(nèi)膜炎奶牛為模型，觀察在炎癥發(fā)生時奶牛唾液生物標(biāo)志物的變化，評價應(yīng)激、炎癥和氧化應(yīng)激在奶牛炎癥反應(yīng)中所選擇的唾液生物標(biāo)志物的可能變化。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗動物 試驗?zāi)膛＿x自保定唐縣某牛場，選取三胎次奶牛40頭，分為試驗組和對照組，每組20頭。試驗組為20頭典型性臨床型子宮內(nèi)膜炎患牛，對照組為20頭健康奶牛。兩組奶牛均每日清早未進食前收集唾液，每日飼喂2次，飼喂時間為8：00和17：00，飼料精粗比1∶4，自由飲水。

1.1.2 主要試劑 唾液淀粉酶試劑盒、腺苷脫氨酶試劑盒、溶菌酶檢測試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；皮質(zhì)醇試劑盒，購自上海瓦蘭生物科技有限公司；總抗氧化能力試劑盒，購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；尿酸檢測試劑盒、乳酸檢測試劑盒、乙酰膽堿酯酶試劑盒，均購自北京索萊寶科技有限公司；酸度計，購自北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.1.3 主要儀器 PF640火焰光度計，購自上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 試驗動物選取 按照奶牛子宮內(nèi)膜炎診斷方法，依據(jù)臨床癥狀與發(fā)情情況以及直腸檢查結(jié)果進行確診，選取20頭典型性臨床型子宮內(nèi)膜炎患牛作為試驗組奶牛。為排除奶?；茧[形子宮內(nèi)膜炎可能性的干擾，選擇30頭未見臨床型子宮內(nèi)膜炎特征的奶牛，無菌采集子宮分泌物，進行致病菌分離培養(yǎng)、革蘭氏染色、鏡檢，選取20頭未分離培養(yǎng)出致病菌的健康奶牛作為對照組。

1.2.2 試驗動物樣品采集 將奶牛頭部保定，試驗人員佩戴無菌長臂手套抻出牛舌，使唾液自然流出，用50 mL離心管收集，并編號，放入冰盒低溫保存，迅速送回試驗室進行檢測。

1.2.3 各標(biāo)志物測定 按照相關(guān)試劑盒指示步驟進行操作的檢測項目有：α唾液淀粉酶、皮質(zhì)醇、腺苷脫氨酶、乙酰膽堿酯酶、溶菌酶、總抗氧化能力、pH值、總蛋白含量、乳酸和尿酸含量。所有分析均在自動生化分析儀上進行。鈉鉀比的檢測使用PF640型火焰光度計。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 根據(jù)表格數(shù)據(jù)，對數(shù)據(jù)進行初步分析。使用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 20.0對各生標(biāo)志物前后變化數(shù)據(jù)進行處理，P<0.01時表示差異極顯著，P<0.05時表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗動物情況

選取的試驗動物分為試驗組(n=20)和對照組(n=20)，各組奶牛具體情況對比見表1。兩組試驗動物平均年齡均為4歲，平均胎次均為3胎；產(chǎn)后天數(shù)相差較??；兩組試驗?zāi)膛Ｖ须y產(chǎn)頭數(shù)差異明顯，試驗組難產(chǎn)頭數(shù)為16頭，而對照組健康奶牛中難產(chǎn)頭數(shù)為2頭；兩組試驗?zāi)膛Ｌヒ虏幌骂^數(shù)差異明顯，試驗組為14頭，對照組為1頭，兩組數(shù)據(jù)進行對比分析，差異極顯著(P<0.01)。

表1 試驗組和對照組奶牛信息對比

2.2 各標(biāo)志物測定結(jié)果

對照組(n=20)與試驗組(n=20)奶牛唾液被檢生物標(biāo)志物及其結(jié)果見表2和表3，表2數(shù)據(jù)均為總體樣本平均數(shù)。結(jié)果表明：在被檢測的各項唾液生化指標(biāo)中，試驗組與對照組兩組數(shù)據(jù)對比，差異極顯著(P<0.01)的生化指標(biāo)為膽堿酯酶，差異顯著(P<0.05)的生化指標(biāo)為乳酸。相比對照組，試驗組的升高項生化指標(biāo)為尿酸、皮質(zhì)醇、乳酸、唾液淀粉酶，下降項生化指標(biāo)為pH值、膽堿酯酶、抗氧化性、腺苷脫氨酶及總蛋白。由表3可知，相比對照組，試驗組子宮內(nèi)膜炎患牛鈉鉀比含量有所下降。

表2 對照組與試驗組奶牛唾液各項生物標(biāo)志物變化情況

表3 對照組和試驗組奶牛唾液中鈉鉀比對比

3 結(jié) 論

研究收集試驗組子宮內(nèi)膜炎患牛和對照組健康奶牛唾液，針對所選10種生物標(biāo)志物使用相關(guān)試劑盒在自動生化分析儀上進行檢測，并將所得數(shù)據(jù)進行對比分析，得出結(jié)論，被測各項指標(biāo)中，相比對照組健康奶牛，試驗組子宮內(nèi)膜炎患牛的升高項為尿酸、皮質(zhì)醇、乳酸、唾液淀粉酶，下降項生化指標(biāo)為pH值、膽堿酯酶、抗氧化性、腺苷脫氨酶及總蛋白，鈉鉀比下降0.83，說明鈉營養(yǎng)狀況受到該病影響。

4 討 論

尿酸一直被認為是一種抗氧化化合物，唾液中尿酸含量的增加可以體現(xiàn)機體在子宮內(nèi)膜炎過程中產(chǎn)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)[3]。據(jù)報道稱，唾液中的尿酸含量可作為診斷代謝綜合征的潛在生物標(biāo)志物[4]，子宮內(nèi)膜炎患牛唾液尿酸含量的上升，可以提示奶牛患病后機體的代謝功能受到一定的影響。

唾液淀粉酶和皮質(zhì)醇含量上升，可以體現(xiàn)交感神經(jīng)和腎上腺素的激活[3]。皮質(zhì)醇可作為人類臨床上很多內(nèi)分泌腺體異常的輔助診斷，唾液淀粉酶的升高和降低可作為慢性胰腺炎的診斷依據(jù)，同時人類對內(nèi)毒素的反應(yīng)也可以引起唾液淀粉酶的含量升高。而在炎癥當(dāng)中，唾液淀粉酶的增加則可能是炎癥癥狀使唾液腺交感神經(jīng)受到了刺激和激活[5]。

前有報道稱，炎癥和氧化應(yīng)激病例中都會出現(xiàn)乳酸增加的現(xiàn)象，可能是由于氧債或低氧灌注導(dǎo)致的厭氧糖酵解[3]。應(yīng)急反應(yīng)的激活也可以導(dǎo)致乳酸含量升高，尤其是腎上腺素系統(tǒng)的激活，會導(dǎo)致厭氧糖酵解[6]。

在試驗組的數(shù)據(jù)當(dāng)中筆者發(fā)現(xiàn)膽堿酯酶活性的降低。人類的膽堿酯酶的降低后多出現(xiàn)乙酰膽堿過剩而聚集，引起膽堿能興奮過度，類似有機磷中毒的現(xiàn)象[7]。目前還沒有對動物炎癥情況下膽堿酯酶活性降低原因的相關(guān)研究和報道，該部分還需要深入試驗和探討。

腺苷脫氨酶也是試驗組奶牛唾液指標(biāo)的降低項之一。它是一種與機體細胞免疫活性有重要關(guān)系的核酸代謝酶，也是反應(yīng)肝臟損傷的明顯指標(biāo)[8]，同時炎癥的發(fā)生是引起肝臟損傷的誘因之一，這可能意味著患子宮內(nèi)膜炎奶牛唾液的腺苷脫氨酶與炎性反應(yīng)和肝損傷之間存在著某些相關(guān)性，有待進一步研究。

總蛋白和鈉鉀比的降低主要提示炎癥奶牛有營養(yǎng)不良的現(xiàn)象出現(xiàn)。人類唾液總蛋白含量降低多提示肝臟、腎臟病變，營養(yǎng)不良及慢性消耗病[9]，也是抑制口腔齲齒發(fā)病的一項內(nèi)容[10]，但炎性奶牛唾液總蛋白含量的降低及其原因，至今未見過相關(guān)報道。據(jù)有效記載，反芻動物唾液中離子濃度Na和K之比是反映動物體內(nèi)Na營養(yǎng)狀況的最佳指標(biāo)。部分學(xué)者認為綿羊唾液鈉鉀比應(yīng)不小于10，另外反芻動物唾液鈉鉀比只有達到4，才能算是Na營養(yǎng)缺乏[11]。因此，澳大利亞制定的反芻動物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)指出：反芻動物腮腺唾液Na/K小于5則為鈉營養(yǎng)缺乏；在比值5～14之間為臨界范圍；比值大于14，則表明鈉營養(yǎng)狀況良好[12]。本試驗當(dāng)中的試驗組奶牛鈉鉀比為4.34，比對照組奶牛有所降低，按照澳大利亞反芻動物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定來看，屬于鈉營養(yǎng)缺乏的范疇。因此，在子宮內(nèi)膜炎奶牛的飼養(yǎng)過程中，有必要有針對性地對蛋白和鈉做出適當(dāng)補充。