崔 潔，向俊鋒,2

(1.中國科學院 化學研究所，北京 100190； 2.中國科學院大學，北京 100049)

核磁共振技術(shù)以其可對樣品實現(xiàn)無損檢測、全面的信息量、豐富的技術(shù)手段結(jié)合現(xiàn)代飛速發(fā)展的計算機系統(tǒng)成為了其他技術(shù)無法比擬的強大工具[1].近年來，核磁共振波譜儀在國內(nèi)得到了極大的普及，已經(jīng)成為科研工作者進行化合物結(jié)構(gòu)表征及動力學性能研究的首選儀器.核磁共振譜進行結(jié)構(gòu)鑒定、動力學研究及構(gòu)象分析時非常方便，尤其是現(xiàn)代的譜儀操作便捷性提高，通過自動程序幾分鐘即可測得一張氫譜，可在很大程度上縮短樣品分析時間[2].

在實際測試工作中，需要得到分辨率高、信噪比好、出峰位置明確且裂分清晰的譜圖[3-4].目前的核磁共振譜主要存在峰型不對稱、半峰寬大、靈敏度低和譜峰無法解釋等問題[5-6]，得到一張滿意的譜圖比較困難，因此研究譜圖的影響因素非常有必要.譜圖數(shù)據(jù)的影響因素最主要有兩個方面：儀器狀態(tài)和樣品的配制，在最優(yōu)的儀器狀態(tài)下，樣品的配制成為影響譜圖效果的關(guān)鍵因素.本文將從樣品制備的各個環(huán)節(jié)(核磁管的選擇、氘代試劑的選取、樣品制備和pH等方面)展開討論，最終提出樣品測試的最優(yōu)條件，為其它樣品核磁共振譜測試提供借鑒指導.

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

瑞士Bruker AVANCE Neo 600(配備了5 mm PATBO Z-GRD探頭)和Bruker AVANCE 500WB(配備了5 mm PABBO Z-GRD探頭)型高分辨液體核磁共振波譜儀.樣品均為實際測試的液體樣品，主要是由中國科學院化學研究所有機固體實驗室提供.氘代試劑來自于美國劍橋CIL、北京伊諾凱科技有限公司、百靈威氘代試劑及北大大北公司.

1.2 測試條件

試驗溫度控制在298.2 K，樣品在磁體中等待5 min以上以達到穩(wěn)定溫度，自動勻場采用(bruker)TOPSHIM程序結(jié)合TUNE(Z-X-Y-XZ-YZ-Z)過程勻場，常規(guī)的一維1H NMR試驗采用標準30 °傾倒角的單脈沖序列(zg30)，化學位移采用溶劑中的內(nèi)標TMS(δ 0)定標，一維水峰抑制1H NMR試驗采用預(yù)飽和技術(shù)抑制溶劑中水峰(zgpr)，1H化學位移采用水溶劑峰(δ 4.80)定標，脈沖間隔2 s，掃描次數(shù)16次，數(shù)據(jù)點數(shù)32 k或64 k，線寬因子0.3 Hz.

2 結(jié)果與討論

2.1 核磁管的選擇

為了確保測試結(jié)果的準確度，核磁管應(yīng)擇優(yōu)使用.核磁管的選擇主要涉及幾個方面：同心度、凸度、管體材質(zhì)/管體表面光潔度及核磁管類型[7].在本研究當中，重點討論了核磁管管體內(nèi)外表面光潔度和核磁管類型對核磁測試結(jié)果的影響.

2.1.1 核磁管管體內(nèi)外表面光潔度

在配置樣品或者存放過程中，核磁管很容易被污染，在放入磁體前應(yīng)擦干凈管體外表面，以避免試劑及雜質(zhì)干擾譜圖甚至污染核磁探頭.核磁管管體內(nèi)外表面光潔度對核磁測試結(jié)果的影響如圖1所示.

由圖1可見，圖1(b)核磁管表面光潔度明顯優(yōu)于圖1(a)，且圖1(a)譜峰寬化，峰型嚴重變形(勻場程序也不能改善)，而圖1(b)中譜峰都是很尖的峰，這是因為NMR需要具有精度非常高的均勻磁場，核磁管表面輕微的破損都能改變樣品檢測區(qū)域磁力線的分布，破壞基礎(chǔ)的均勻磁場，引起信號展寬甚至畸變.

圖1 相同樣品、不同核磁管的氫譜Fig.1 1H NMR spectra of sample using different nuclear magnetic tubes

2.1.2 核磁管類型

常用的核磁管類型主要有壓力閥門核磁管、螺紋口核磁管、厚壁核磁管、同軸核磁管、高溫核磁管及微量核磁管等[8].正確選擇核磁管可以最大限度的降低樣品區(qū)域磁化率的差異，以確保測試樣品處于均勻磁場中，從而得到最準確的試驗數(shù)據(jù).核磁管類型對核磁測試結(jié)果的影響如圖2所示.

圖2 同一樣品在常規(guī)核磁管(a)和升溫核磁管(b)中的1H NMR譜圖(353.2 K ,500 M)Fig.2 1H NMR spectra of sample using a normal tube (a) and a tube under high temperature conditions(b)

由圖2可見，在高溫條件下(353.2 K)，使用常規(guī)型核磁管得到的譜圖峰型畸變，相比之下，升溫核磁管中得到分辨率有很大提高的譜峰，這是由于后者所用的材質(zhì)具有更強的抗熱變形能力，保證了升溫過程中樣品磁場的均勻性，而常規(guī)型核磁管的各項參數(shù)在劇烈溫度變化中發(fā)生了不同程度的改變，破壞了原有的均勻磁場.

2.2 氘代試劑的選擇

氘代試劑中的氘可提供場頻鎖定信號，且可避免質(zhì)子譜中溶劑信號太強[9].配制核磁樣品時，通常情況下，充分提純干燥的樣品都是溶解在氘代試劑中.氘代試劑有很多種，在選擇氘代試劑時需要考慮的因素包括：(1)樣品在氘代試劑中的溶解度.(2)氘代試劑的粘度.(3)氘代試劑的熔點和沸點.(4)氘代試劑中含活潑氫.(5)避免氘代試劑與測試樣品發(fā)生反應(yīng).(6)不同來源氘代試劑.(7)氘代試劑中的水.在本研究當中，重點討論了(5)、(6)和(7)對核磁測試結(jié)果的影響.

2.2.1 避免氘代試劑與測試樣品發(fā)生反應(yīng)

當選擇的氘代試劑與測試樣品發(fā)生反應(yīng)后，會使得譜圖復雜化，無法得出真實的樣品結(jié)構(gòu)信息[10].更換不同的氘代試劑后可能會得到不同的譜圖，從而加大了譜圖解析難度.在選擇氘代試劑時應(yīng)充分考慮樣品的性質(zhì)，避開可能會與樣品發(fā)生反應(yīng)的氘代試劑.

如圖3所示，圖3(a)為圖中化合物在CDCl3中的氫譜，氫譜缺少了1,3-二硫雜環(huán)戊烯位置的氫.考慮到溶劑的影響因素，更換CD2Cl2，得到圖3(b)，觀察到6.5 ppm處出現(xiàn)了新峰，譜圖的化學位移及積分面積均與結(jié)構(gòu)一致.放大CDCl3中圖可見此處也有峰，但是面積不對，說明在CDCl3溶劑中分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，因此推測該氫與CDCl3溶劑中的活潑D發(fā)生了交換，導致譜峰強度變?nèi)酰踔料?，而CDCl3中的活潑D來自于其光解產(chǎn)物.

圖3 樣品分別溶解在CDCl3(a)和CD2Cl2(b)中得到的1H NMRFig.3 1H NMR spectra of sample dissolved in CDCl3 (a) and CD2Cl2(b)

2.2.2 不同來源氘代試劑

除此以外，不同廠家生產(chǎn)的溶劑質(zhì)量也有差別.對比了來自4家不同經(jīng)銷商的氘代氯仿，在Bruker AVANCE Neo 600核磁譜儀上，采用同樣的采樣參數(shù)及處理參數(shù)進行了氫譜測試，結(jié)果如圖4所示.由圖4可見，在0.8～3.0 ppm區(qū)域，4家不同經(jīng)銷商的氘代氯仿雜峰情況以及水峰高低具有明顯差異.在本對比試驗中，購于青島騰龍微波科技有限公司的CIL(Cambridge isotope laboratories，Inc)氘代試劑(d)的譜圖顯示其純度最高，雜質(zhì)峰甚至可以忽略.

圖4 不同生產(chǎn)廠家的CDCl3的1H NMR對比Fig.4 1H NMR spectra of sample using CDCl3 from different manufacturers

2.2.3 氘代試劑中的水

圖5 大瓶裝(a)和小支封裝(b)的CDCl3中水含量對比Fig.5 Comparison of water content in CDCl3 stored in large bottle (a) and small bottle (b)

幾乎所有的氘代試劑都含有少量的水，且由于許多溶劑本身具有一定的吸濕性，儲存時間越長，水含量越高.水峰的存在將極大降低核磁譜圖的質(zhì)量，尤其在測試溶解性差的樣品氫譜時更為明顯[11].因此氘代試劑的儲存也是非常重要的方面.如圖5所示，大瓶裝的氘代試劑與小支裝的相比，水峰有著顯著的增強，為了降低水峰的影響，建議選擇小支封裝的氘代試劑.

圖6 同一樣品不同濃度的1H NMR(500 M)(a)原濃度，(b)稀釋三倍Fig.6 1H NMR spectra of sample with different concentrations(a) original concentration, (b) 1/3 of the original concentration

2.3 樣品處理

2.3.1 樣品量的要求

樣品量的要求主要是針對不同的核測試項目進行[12].對于5 mm核磁管，如要測試氫譜，3～10 mg樣品足夠.對于碳譜和雜核，樣品濃度至少為氫譜的5倍(一般在100 mg左右)，但濃度太大會因飽和、粘度增加而降低分辨率.如圖6(a)可看出，由于樣品的濃度過大造成了譜峰寬化，多重裂分信號融合成一個寬峰，譜峰重疊嚴重.將該核磁管中的樣品稀釋三倍后重新進行1H NMR測試，結(jié)果如圖6(b)示，與之前氫譜相比分辨率有顯著提高，共振信號的寬度明顯變窄，多重裂分信號清晰可見.因此對于二維試驗，為了獲得較好的信噪比，樣品量要在溶液粘度與靈敏度之間做好平衡.

2.3.2 樣品的充分混合

能否在核磁管中溶解樣品最主要取決于樣品能夠混合均勻，未得到充分混合的溶液內(nèi)部磁化率不同，最終導致譜圖分辨率降低[13-14].樣品與氘代試劑充分混合，也就是保證溶液中無氣泡、無固體懸浮、漂浮、沉淀，得到均一的真溶液，且樣品一直保持在核磁管的底部.

同一樣品充分溶解前后的1H NMR譜圖如圖7所示.由圖7可看出，樣品與溶劑的混合液經(jīng)過簡單物理混合后，由于內(nèi)部均勻性差，即使勻場仍無法得到均一的磁場，氫譜中的譜峰存在明顯不規(guī)則裂分，峰型畸變，不是對稱的高分辨譜峰，如圖7(a)、(b)所示.與圖7(c)中充分搖勻的真溶液氫譜對比，半高寬增加了十幾倍，這種譜圖可能給人錯誤的結(jié)構(gòu)信息.因此，在配制溶液時應(yīng)進行多次的搖晃并靜置一段時間使之溶解完全再進行測試，消除分子的各向異性并保證樣品的均一性.

圖7 樣品混合對1H NMR結(jié)果的影響(a)未充分混合樣品的自動勻場譜圖，(b)手動勻場譜圖，(c)經(jīng)過充分混合樣品的自動勻場譜圖Fig.7 Effects of sample mixing on 1H NMR spectra(a) Automatic shimming spectrum of poorly mixed samples, (b) Manual shimming spectrum of poorly mixed samples, (c) Automatic shimming spectrum of fully mixed samples

2.4 pH值

pH值對于活潑氫的出峰影響很大，常見的活潑氫是與氧、氮和硫共價相連的氫原子,因存在著快速交換或四極矩弛豫機制, pH值有顯著的作用[15].如圖8所示，在不同的溶液環(huán)境下得到15N部分標記的NH4Cl的氫譜，在不恰當?shù)膒H溶液中，丟失很多有用的NH積分面積、耦合裂分等信息.當pH為弱酸性時，譜峰分辨率提高，可以同時觀察到14N和15N對活潑氫的裂分.

圖8 溶液的pH值對于活潑氫出峰的影響(a)D2O∶H2O=1∶9溶液，(b)加入1%體積比的氘代DMSO，(c)加入1%硫酸Fig.8 Effect of pH value of solution on peak of active hydrogen(a) D2O∶H2O=1∶9 solution, (b) adding 1% volume of deuterium DMSO, (c) adding 1% volume of sulfuric acid

3 結(jié)論

在本研究當中，基于液體樣品核磁試驗結(jié)果分析，討論了幾個關(guān)鍵因素對譜圖效果的影響：(1)在選擇核磁管時，必須保證核磁管管體內(nèi)外表面足夠光潔，且在高溫條件下(353.2 K)，優(yōu)先選用升溫核磁管，譜峰分辨率有很大的提高.(2)在選擇氘代試劑時，盡量選擇小支密封裝的氘代試劑，降低水峰的影響，并且應(yīng)該充分考慮樣品的性質(zhì)，避免試劑與測試樣品發(fā)生反應(yīng).(3)為了獲得較好的信噪比，樣品量要在溶液粘度與靈敏度之間做好平衡，樣品必須與溶劑充分混合均勻.(4)pH值主要是對于與氧、氮和硫共價相連的氫原子影響明顯，為提高譜峰分辨率，應(yīng)該選擇恰當?shù)膒H溶液.

致謝：感謝中國科學院化學研究所王巍工程師為本研究工作提供的支持.