何慧，葉垚君，楊瑤君，付春

樂山師范學院生命科學學院，竹類病蟲防控與資源開發(fā)四川省重點實驗室，樂山 614000

長足大竹象（Cyrtotrachelus buqueti），屬鞘翅目象甲科，主要分布于四川、重慶、貴州、廣東以及廣西等省區(qū)。長足大竹象寄主廣泛，危害水竹（Phyllostachys heteroclada）、青皮竹（Bambusa textilis）、崖州竹（Bambusa textilisvar. gracilis）、慈 竹 （Neosinocalamus affinis） 、 綠 竹（Dendrocalamopsis oldhami） 、 撐 綠 雜 交 竹（Bambusa pervaria-bilis×Dendrocalamopsis daii）等約28 種竹種的竹筍。

在世界范圍內，每年大約會有1010～2×1011t 植物有機物質被生產(chǎn)，其中將近一半都為纖維素[1]，同時纖維素作為飲食中的一種重要的膳食纖維，是自然界最豐富的可再生資源之一。纖維素作為最難降解成葡萄糖的碳水化合物，在其利用過程中常常沒有得到充分的利用，從而造成了大量資源浪費，因此纖維素如何高效地利用和轉化對于解決當前世界能源匱乏、糧食稀缺以及環(huán)境污染等問題具有不可或缺的意義[2]。隨著現(xiàn)代生物技術的發(fā)展，纖維素酶由于具有降解速度高、降解底物環(huán)保的優(yōu)點而被廣泛利用，特別是昆蟲內源纖維素酶在工業(yè)生產(chǎn)與能源領域等方面得到廣泛關注與應用[3-4]。

大多數(shù)昆蟲體內都有纖維素酶，可以消化他們所攝取的食物中的纖維素，從而提供昆蟲正常生長所需的物質和能量。昆蟲纖維素酶首先在白蟻和蟑螂的腸道中發(fā)現(xiàn)[5-6]，然后在細菌（如大腸桿菌）、放線菌（如馬都拉放線菌）、真菌（如木霉屬的綠色木霉與青霉屬的灰綠青霉）和其他昆蟲（如屬鱗翅目昆蟲的蝗蟲）以及其他動物（如白蟻和蝸牛）都檢測到纖維素酶[7-8]。劉潔麗，王靖[9]中研究發(fā)現(xiàn)：除了昆蟲腸道內所含有的共生微生物能夠產(chǎn)生纖維素酶以外，某些特殊的昆蟲體內還存在內源性的纖維素酶。

昆蟲內源性纖維素酶研究以鞘翅目昆蟲最為廣泛，李燕利[6]等研究了12 種甲蟲體內的纖維素酶活性，研究發(fā)現(xiàn)除了栗山天牛體內檢測不到內切-β-1，4-葡聚糖苷酶活性，其余實驗組甲蟲體內均能檢測到完整的纖維素酶。徐麗霞[10]等研究了黑胸散白蟻、黃翅大白蟻、象白蟻和鋸白蟻4 種白蟻及其腸道不同組織部位的內切-β-1，4-葡聚糖酶（EG）、β-葡萄糖苷酶（BG）和外切-β-1，4 葡聚糖酶（CBH）3 種纖維素酶活性，并研究了白蟻腸道不同組織部位的內切-β-1，4-葡聚糖酶（EG）的分布及多樣性。研究表明，在這研究的4 種白蟻中，EG 酶的比活力均高于BG 酶和CBH 酶。劉新博[11]、段旭[12]等研究了竹蟲體內纖維素酶系活性，研究發(fā)現(xiàn)竹蟲體內存在完整的纖維素酶系，并對3 種酶活性大小進行了研究為，β-葡萄糖苷酶的底物羧甲基纖維素鈉的降解活性＞外切-β-1，4-葡聚糖苷酶的底物微晶纖維素的降解活性＞內切-β-1，4-葡聚糖苷酶的底物水楊素的降解活性，CB 的最適pH 為7.0，實驗組還設置了對底物的不同反應時間和纖維素酶系的分離，結果顯示，CB 的最適pH 值為7.0，溫度為70 ℃，反應時間為60 min；CMC 的最適pH 值為9.4，溫度為30 ℃，反應時間為40 min；SA 的最適pH 值為8.2，溫度為50 ℃，反應時間為20 min。該研究為接下來研究長足大竹象腸道酶活性質提供了研究方法和可靠地實驗數(shù)據(jù)。劉超、萬東海[13]等研究了長足大竹象幼蟲體內消化酶活性，并比較出了其體內消化酶活性大小為：半纖維素酶 ＞果膠酶 ＞纖維素酶，但對于體內纖維素酶系的活性沒有做進一步研究。盡管各類鞘翅目昆蟲體內纖維素酶活性研究較多，但尚未有長足大竹象幼蟲體內纖維素酶活性的比較，本研究選取了長足大竹象幼蟲腸道的纖維素酶來作為研究對象，對不同的溫度及pH 值條件下對纖維素酶活性影響進行比較研究，篩選出纖維素酶酶活的最佳條件，為開發(fā)高效纖維素酶系提供了數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 蟲體來源

長足大竹象幼蟲均采于四川省樂山市沐川縣大楠鎮(zhèn)（N28°58′5.06″，E104°0′6.93″）。

1.2 試劑來源

水楊素（Salicin）試劑、羧甲基纖維素（CMC）試劑購買于Sigma 公司，微晶纖維素（MCC）試劑購買于Fluka 公司，其余試劑沒有特別說明均為國產(chǎn)分析純。

1.3 初酶液的制備

選取體型大小，生長狀況大體相同的長足大竹象幼蟲5 只，在冰浴條件下解剖，完整取出其腸道，再根據(jù)鞘翅目昆蟲腸道分段要點，用解剖針將腸道分成前、中、后腸，分別放在含有0.02 mol·L-1pH 值7.5 的檸檬酸緩沖液的研缽中充分勻漿，然后在溫度為5 ℃、轉速為10 000 r·min-1的離心機上離心20 min，離心管上層的上清液即為長足大竹象幼蟲各段腸道的原酶液。分別各取3 mL 的5 只幼蟲蟲體的3 段腸道的原酶液與只含相同濃度的檸檬酸緩沖液放入5 mL 的離心管中進行對應編號。分裝好之后放入到-75 ℃的冰箱中保存。

1.4 稀釋酶液的蛋白含量

采用Bradford 法[12]測定蛋白質的含量。配制1 mg·mL-1的標準蛋白溶液。

取11 支試管，分別用移液管加入濃度為1 mg·mL-1的 標 準 蛋 白 溶 液0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.30、0.50、0.70、0.90 和1.00 mL，用蒸餾水定容到1 mL，再分別用移液管移取加入2.4 mL 考馬斯亮藍試劑，試管用勻微型旋渦混凝器混勻。最后在酶標儀595.0 nm 處測定這11 支試管的OD 值，構建出蛋白質標準曲線。

用移液槍分別移取腸道前、中、后3 段的供試酶液0.05 mL，以及蒸餾水0.05 mL，再分別用移液管移取加入2.4 mL 考馬斯亮藍試劑，用勻微型旋渦混凝器混勻之后在酶標儀595.0 nm 下測定3 段腸道的OD 值，每個樣品設置3 個重復組，根據(jù)上述繪制出的蛋白質標準曲線計算出稀釋后酶液當中的蛋白質含量。

1.5 葡萄糖標準曲線的繪制

首先配置1 mg·mL-1的葡萄糖標準溶液。

選取8 支相同刻度試管，編號為1～8，其中編號為1 的試管為空白對照組。依次向這8 支試管當中加入濃度為1 mg·mL-1的葡萄糖標準溶液0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 和0.14 mL，分別用蒸餾水定容至1 mL，再分別加入1.5 mLDNS 顯色劑，搖勻后將其置于沸水浴中加熱5 min。加熱完成后用水冷卻搖勻，在酶標儀540.0 nm 處測定8 支管的OD 值。以這8 支試管當中的葡萄糖的濃度來作為橫坐標，酶標儀所測量出的OD 值為縱坐標，從而繪制出葡萄糖標準曲線。

1.6 纖維素酶活性的測定

從溫度、pH 值兩個外界因素出發(fā)，探究5 個不同溫度（分別為30、40、50、60、70℃）和7 個不同pH 值（分別為3、4、5、6、7、8、9）的35 個不同的外界因素組合條件下長足大竹象幼蟲腸道前、中、后段的內切β-1，4-葡聚糖酶（Cx 酶）、外切β-1，4-葡聚糖酶（C1 酶）和β-葡萄糖苷酶的活性，并從以下3 個方面進行比較：1）同腸段內3 種纖維素酶活性的比較；2）不同腸段內同種酶之間活性比較；3）幼蟲不同生長段的不同酶活性比較。

在測定Cx 酶的活性時以濃度為2%的羧甲基纖維素作為底物，在測定β-葡萄糖苷酶活性時以濃度為1%的水楊素作為底物，在測定外切β-1-4-葡聚糖酶活性時以濃度為1%的微晶纖維素作為底物[13]。底物在進行酶促反應之前還需要分別用0.2 mol·L-1pH 值為3、4、5、6、7、8 的磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液和0.2 mol·L-1pH 值=9 的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液來創(chuàng)造實驗中不同的酸堿度環(huán)境。

分別將0.1 ml 長足大竹象幼蟲3 段腸道（即前、中和后）的稀釋酶液與上述3 種底物0.3 mL 混合。分別在30、40、50、60、70 ℃水中浸泡2 h后，再向裝有腸段稀釋酶液的試管當中加入DNS 顯色劑2 mL。在沸水中顯色5 min 后，將試管置于流動水中冷卻，最后在酶標儀的540 nm 處測定OD 值，每支試管的酶液測定設置3 個重復組，計算時取平均值，同時理應設置空白對照。以試驗條件下酶液蛋白含量（mg）在單位時間（min）內酶促反應產(chǎn)生的還原糖（葡萄糖）量（μmol）計算酶活性，即μmol·min-1·mg-1。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用DPSS22.0 軟件對所測數(shù)據(jù)進行方差分析和多重比較[14]。

2 結果與分析

2.1 長足大竹象幼蟲前腸內3 種纖維素酶活性與pH 值和溫度的關系

試驗表明，溫度和pH 值對3 種酶的活性均有顯著影響（見圖1-圖3），β-葡萄糖苷酶的最佳溫度范圍為30～60 ℃，最佳pH 值為4～6，最高酶活性為0.0255 μmol·min-1·mg-1（ pH 值=6，40 ℃） ，當pH 值較低（pH 值＜4）、溫度高于40 ℃時，β-葡萄糖苷酶活性呈上升趨勢；而當pH 值較低（pH 值＞7）、酶活性隨溫度的升高呈現(xiàn)下降趨勢直至無活性。在前腸中，當β-葡萄糖苷酶在60 ℃時，活性是隨著pH 值的增加而減小直至無活性狀態(tài)，即堿性狀態(tài)時，酶活性更易受到影響；Cx 酶的最適溫度范圍在30～60 ℃，最適pH 值在5～8 之間，最高酶活性為-0.0342 μmol·min-1·mg-1，在較酸或者較堿條件下，該酶活性較低，如在pH 值為3 溫度為30 ℃時，該酶無活性；C1 酶的最適溫度為30～60 ℃，最適pH 值為5～8，最高酶活性為0.0342 μmol·min-1·mg-1，在超出最適溫度和最適pH 值后，酶活性均較低或失落（見圖1）。

圖1 長足大竹象幼蟲前腸纖維素酶活性Fig.1 Cellulase activity in the foregut of Cyrtotrachelus bugueti larvae

2.2 長足大竹象幼蟲中腸內3 種纖維素酶活性與pH 值和溫度的關系

在長足大竹象幼蟲中腸中，β-葡萄糖苷酶、Cx酶和C1 酶都受溫度和pH 值的較大影響，3 種酶都只能在最適溫度和最適pH 值條件下表現(xiàn)出相對較高的活性，其他不適條件活性較低或無活性（見圖3）。在試驗條件下，β-葡萄糖苷酶的最適溫度為30～70 ℃，最適pH 值為4～9，β-葡萄糖苷酶最高酶活0.0262 μmol·min-1·mg-1，在溫度較高或較低，酸堿度較酸或較堿條件下活性均低甚至無活性；Cx 酶最適溫度為30～60 ℃，最適pH 值為5～8，Cx 酶最高酶活為0.0258 μmol·min-1·mg-1，在超出最適溫度和最適pH值外活性較低；C1 酶的最適溫度為30～70 ℃，最適pH值為4～8，C1 酶最高酶活為0.0343 μmol·min-1·mg-1，在溫度較高或較低，酸堿度較酸或較堿條件下活性均較低。酶間比較發(fā)現(xiàn)，在相同條件下，C1 酶活性最高，且它的溫度范圍和pH 值范圍較大。

圖2 長足大竹象幼蟲中腸纖維素酶活性Fig.2 Cellulase activity in the midgut of Cyrtotrachelus bugueti Larvae

圖3 長足大竹象幼蟲后腸纖維素酶活性Fig.3 Cellulase activity in the hindgut of Cyrtotrachelus bugueti Larvae

2.3 長足大竹象幼蟲后腸內3 種纖維素酶活性與pH 值和溫度的關系

在長足大竹象后腸中，3 種纖維素酶酶活性均受溫度和pH 值的影響較大，3 種酶都只能在最適溫度和最適pH 值條件下表現(xiàn)出相對較高的活性，其他不適條件活性較低或無活性。在試驗條件下，β-葡萄糖苷酶的最適溫度為30～70 ℃，最適pH 值為4～8，β-葡 萄 糖 苷 酶 的 最 高 活 性 為0.0274 μmol·min-1·mg-1，在溫度較高或較低，酸堿度較酸或較堿條件下活性均低甚至無活性；Cx 酶的最適溫度為30-70 ℃，最 適pH 值 為3～8，Cx 的 最 高 酶 活 性 表 現(xiàn) 為0.0279 μmol·min-1·mg-1，在超出最適溫度和最適pH 值外活性較低；C1 酶的最適溫度為30～70 ℃，最適pH 值為3～9，C1 酶最高酶活性為0.0365 μmol·min-1·mg-1，在溫度較高或較低，酸堿度較酸或較堿條件下活性均較低（見圖3）。

2.4 長足大竹象成蟲腸道各段內（前、中、后）β-葡萄糖苷酶活性的比較

β-葡萄糖苷酶在前腸中的最高酶活性為0.0255 μmol·min-1·mg-1（pH 值=6，40 ℃），pH 值值3、7、8、9 時，該酶均無活性；β-葡萄糖苷酶在中腸中的最高酶活性為0.0249 μmol·min-1·mg-1（pH值=6，40 ℃），pH 值在3、8、9 時，該酶存在無活性狀態(tài)；β-葡萄糖苷酶在后腸中的最高酶活性為0.0273 μmol·min-1·mg-1（pH 值=8，60 ℃）。β-葡萄糖苷酶活性在腸道各段內的大小依次是后腸＞前腸＞中腸（圖4）。

2.5 長足大竹象幼蟲腸道各段內（前、中、后）Cx 酶活性的比較

Cx 酶在長足大竹象成蟲的前腸中的最高酶活性為 0.0249 mol·min-1·mg-1（ pH 值=5，60 ℃） ，pH 值3、8、9 時，Cx 酶活性較低，pH 值7 開始，酶活性逐漸降低且降低趨勢顯著，推測這是Cx 酶適生pH 值臨界點；Cx 酶在長足大竹象成蟲的中腸當中 的 最 適 酶 活 性 為0.0258 μmol·min-1·mg-1（pH值=3，60 ℃）。在中腸中，當pH 值在3、9 時，在30～70 ℃的溫度范圍內都存在Cx 酶的無活性狀態(tài)；Cx 酶在長足大竹象成蟲的后腸當中的最適酶活性為0.027 μmol·min-1·mg-1（pH 值=5，70 ℃）。在后腸中，當pH 值為3、8、9 時，在30～70 ℃的溫度范圍內β-葡萄糖苷酶無活性。Cx 酶在長足大竹象成蟲腸道各段內的酶活性大小依次是中腸＞前腸＞后腸（見圖5）。

圖4 長足大竹象幼蟲腸道3 段中β-葡萄糖苷酶活性比較Fig.4 Comparison of β-enzyme activity in three intestinal segments of Cyrtotrachelus bugueti larvae

圖5 長足大竹象幼蟲腸道3 段中CX 酶活性比較Fig.5 Comparison of CX enzyme activity in three intestinal segments of Cyrtotrachelus bugueti larvae

2.6 長足大竹象幼蟲腸道各段內（前、中、后）C1 酶活性的比較

前腸C1 酶最高酶活性為0.0342 mol·min-1·mg-1（ pH 值=7，60 ℃） ，pH 值3、 4、 9，溫 度30-70 ℃均無活性；中腸C1 酶最高酶活性為0.034 μmol·min-1·mg-1（pH 值=7，60 ℃）。pH 值3、4、8、9，溫度30-70 ℃均無活性；后腸C1 酶最 高 酶 活 性 為0.0365 μmol·min-1·mg-1（pH 值=7，60 ℃），pH 值3、4、7、8、9，溫度30-70 ℃均無活性。C1 酶在長足大竹象成蟲腸道各段內的酶活性大小依次是后腸＞中腸＞前腸（見圖6）。

圖6 長足大竹象幼蟲腸道3 段中C1 酶活性比較Fig.6 Comparison of C1 enzyme activity in three intestinal segments of Cyrtotrachelus bugueti larvae

3 討論

劉新博[11]，段旭[12]，劉超[13]等人都研究了竹蟲體內纖維素酶系活性，均發(fā)現(xiàn)竹蟲體內存在完整的纖維素酶系，并比較出3 種纖維素酶的活性大小，這都為接下來研究長足大竹象腸道酶活性質提供了研究方法和可靠地實驗數(shù)據(jù)。測定纖維素酶活性的方法有很多種，但最主要且運用最廣泛的是DNS 顯色法，同時李燕利，劉新博等人也都運用該技術作為探究纖維素酶的主要手段，這直接作為本研究大足象幼蟲腸道纖維素酶活性的技術選擇。本研究利用該技術研究了長足大竹象幼蟲不同腸道段的纖維素酶活性，結果表明，長足大竹象腸道（分前腸、中腸和后腸）中均有完整的纖維素酶系，它們的酶活性大小為后段＞中段＞前段，但各腸道段中的纖維素酶活性基本相同，差異不顯著。通過設置pH 值3，4，5，6，7，8，9 等7 個梯度和溫度為30 ℃，40 ℃，50 ℃，60 ℃，70 ℃等5 個溫度梯度對3 種纖維素酶在長足大竹象幼蟲不同段腸道的酶活性的探究得出，長足大竹象幼蟲不同段中3 種纖維素酶活性在最適條件下酶的活性大小變化不大，差異不顯著；3 種纖維素酶活性主要受溫度和pH 值的影響，在最適溫度為40～70 ℃具有相對較高的活性，在最適pH 值為4～7 也具有較高活性，在高溫和低溫以及過酸和過堿條件下，檢測到纖維素酶較低，β-葡萄糖苷酶在pH 值＞7 下，酶活基本不能檢測到。

對長足大竹象幼蟲腸道不同組織部位的纖維素酶活測定結果表明，不同組織部位和不同纖維素酶比活力均有可能有較大差異，這種同種組織不同酶比活力的差異可能與腸道內酶分解纖維素所起的作用不同有關[15]，不同組織之間同種酶比活力的差異可能與竹象蟲組織的生理狀態(tài)不同有關，為進一步研究竹象蟲生活習性奠定基礎。竹象蟲對于纖維素的需求主要是在幼蟲階段，幼蟲蛀食竹筍、嫩筍，導致竹筍枯死，嫩筍無法生長，利用這一差異，可針對幼蟲纖維素酶分布特點以及酶比活力的不同，研究開發(fā)竹象蟲幼蟲防治藥物，減少幼蟲對竹筍的傷害，為竹林防害提供相關依據(jù)[16-17]。竹象蟲腸道具有獨特理化環(huán)境，是消化纖維素的天然工廠，其腸道是共生微生物的生長繁殖提的理想場所[18]，本文通過對長足大竹象幼蟲腸道不同組織部位纖維素酶活性的初步研究，揭示了長足大竹象幼蟲體內3 種纖維素酶的活性及分布等特征，為進一步闡明不同長足大竹象降解纖維素的機制和研究竹象蟲對富含纖維素植物等生物質能的合理利用和開發(fā)奠定基礎，為開發(fā)利用長足大竹象內源的纖維素酶作為新型的生物質能源產(chǎn)業(yè)奠定了一定的科學基礎[19-20]。

長足大竹象對纖維素的降解是一個復雜的需要多種酶參與的過程，同時也不排除長足大竹象腸道內是否有內源纖維素酶的作用。對于竹象蟲腸道內纖維素酶活性的最適反應時間、pH 值、溫度還未精確，同時本文采用的測定方法是制備初酶液的，未將纖維素酶提取出來，對于如何高效提取腸道內纖維素酶的方法還有待研究。