張俊杰， 彭姍姍， 尚益民， 李碩， 柴帥杰

(鄭州輕工業(yè)大學食品與生物工程學院，河南 鄭州 450002)

農作物產量的提高往往通過增加化肥的供應劑量來實現(xiàn)[1]。然而，長期不當?shù)氖┓蕰е颅h(huán)境嚴重惡化，如土壤酸化和土壤養(yǎng)分降低等。為了減少施用化肥帶來的不利影響，施用有機肥成為維持作物高產和提高土壤肥力的替代方法[2]。生物固氮作為土壤中氮元素來源的重要途徑，對農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和土壤營養(yǎng)狀況的改善有著重要的作用[3]。紫云英(AstragalussinicusL.)作為草本豆科植物，具有豐富的生物量和較高的固氮能力，十分適應濕稻田土壤，是中國、日本和韓國冬季休耕稻田中最傳統(tǒng)和最受歡迎的綠肥。紫云英還田有助于提高土壤酸堿緩沖性，增加土壤電導率，對提高土壤有機碳含量有很好的促進作用，從而提高土壤養(yǎng)分含量。此外，種植翻壓紫云英對土壤微生物生長具有較好的促進作用[4]。紫云英是稻區(qū)最主要種植和利用的冬季綠肥作物，也是中國傳統(tǒng)農業(yè)的精華[5]。紫云英蜂蜜是重要的出口農產品，紫云英作物是優(yōu)質的蜜源植物和飼草原料。紫云英綠肥作為純天然有機肥料，沒有重金屬、農藥等殘留，能滿足人們對有機食品的需求，同時能改善施用農藥化肥產生的面源污染[6]。根瘤菌(Rhizobium)是與豆科植物共生形成共生固氮體系的細菌微生物，通過將大氣中的無機氮轉化為有機氮，為宿主豆科作物提供更多氮素[7]。根瘤菌具有較強的宿主專一性，幾乎每種根瘤菌只能與部分豆科植物形成共生關系，但是由于長期受到環(huán)境脅迫和寄主選擇的影響，不同根瘤菌各自向著不同的方向發(fā)生適應性進化，從而形成了豐富的生物多樣性[8-9]。特殊基因片段經過PCR擴增后用限制性內切酶酶切，然后通過對比高濃度凝膠電泳得到的酶切圖譜從而揭示細菌的多態(tài)性，其中主要包括16S rRNA/23S rRNA和兩者之間的序列(intergenic spacer, IGS)，已被廣泛用于根瘤菌分類的限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)分析中。目前關于紫云英根瘤菌的研究資料并不多，對紫云英根瘤菌多樣性及系統(tǒng)分類研究的報道也較少。本研究選取湖南省益陽市南縣和大通湖區(qū)的土壤作為研究對象，通過對該地區(qū)的紫云英共生根瘤菌的分離鑒定，采用IGS-PCR-RFLP方法分析，調查了該地區(qū)紫云英根瘤菌的遺傳多樣性，對選育高效優(yōu)良紫云英根瘤菌菌種并推廣于全國農林生產具有指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料

研究土壤取自湖南省益陽市南縣和大通湖區(qū)。紫云英種子由河南省農業(yè)科學院植物營養(yǎng)與資源環(huán)境研究所提供。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

植物低氮營養(yǎng)液：Ca(NO3)20.03 g，CaSO40.46 g，KCl 0.46 g，MgSO4·5H2O 0.8 g，H2MoO40.02 g，去離子水1 000 mL

水瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂粉8 g,去離子水1 000 mL。

YMA培養(yǎng)基：酵母粉3 g，K2HPO40.25 g，甘露醇10 g，無水MgSO40.1 g，KH2PO40.25 g，NaCl 0.l g，瓊脂粉18 g，去離子水1 000 mL，pH值6.8～7.2。

TY培養(yǎng)基: CaCl2·2H2O 0.7 g，胰蛋白胨5 g，酵母粉3 g，去離子水1 000 mL，pH 值6.8～7.2。

試劑均購自北京索萊寶科技有限公司，分析純。試劑及培養(yǎng)基均在121 ℃滅菌30 min。

1.3 紫云英根瘤菌的捕捉

將紫云英種子統(tǒng)一浸泡在質量分數(shù)0.2 %的升汞溶液中，進行消毒處理30 s，將其置于水瓊脂培養(yǎng)基28 ℃ 暗培養(yǎng)至種子萌發(fā)。用植物低氮營養(yǎng)液拌勻蛭石間歇滅菌2次后進行栽種，采用蛭石加土樣加蛭石的栽種模式。栽種完成將其置于人工氣候培養(yǎng)箱(杭州匯爾儀器設備有限公司，RIH-1000B)，8～16 h光照培養(yǎng)30 d。將紫云英根部沖洗干凈，用無菌的鑷子將根瘤取下，并對其進行質量分數(shù)0.2 %的升汞消毒處理30 s，將根瘤搗碎，吸取液體在YMA培養(yǎng)基上“Z”字形劃線，28 ℃恒溫暗培養(yǎng)3～5 d，并用3次劃線的方式對其進行純化。將所得菌株保存在YMA斜面，用于短期保存和日常實驗，同時與質量分數(shù)20%甘油混合并長期保存于-80 ℃冰箱中。

1.4 根瘤菌DNA的提取

DNA的提取方法參照TEREFEWORK[10]的方法。首先在YMA固體培養(yǎng)基上挑取單菌落，接種于5 mL TY液體培養(yǎng)基，28 ℃，180 r·min-1轉速振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，對收集的菌液通過GUTC作用裂解細胞，去除蛋白質等雜質，吸附沉淀核酸DNA，雙蒸水溶解獲得供試菌株的總DNA。用質量分數(shù)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測合格的DNA樣品在-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 rRNA基因間隔區(qū)段的PCR-RFLP檢測

IGS PCR擴增使用引物IGS 1490/132′，所用引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。具體試驗方法參考張俊杰等[11]的研究。所得PCR產物用質量分數(shù)1.0 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測。

IGS PCR產物選用3 種限制性內切酶(XhoI、NdeI和HaeIII)進行酶切，具體參考張俊杰等[11]方法。所用限制性內切酶均來自上海生工生物工程股份有限公司。酶切產物用質量分數(shù)2.5 % 的瓊脂糖凝膠在60～80 V 電壓下電泳1～2 h，然后用DNI 凝膠成像系統(tǒng)(DNI Bio-imaging system，MiniBIS Pro)檢測酶切結果，根據酶切條帶的大小對其進行具體的分型。

1.6 供試菌株16S rRNA的序列測定和系統(tǒng)發(fā)育分析

根據不同采樣地點獲得的菌株及其在不同的IGS類型中的分布挑選代表菌株，使用正向引物P1和反向引物P6進行16S rRNA基因擴增。具體參考張俊杰等[11]方法。所有供試菌株的PCR產物在含有Goldview I型核苷酸染料的瓊脂糖凝膠中電泳檢測，并對合格的樣品進行測序。PCR擴增產物的測序由上海生工生物工程股份有限公司完成。利用DNAMAN軟件進行雙向測序結果的拼接，將完整的16S rRNA序列提交保存在GenBank數(shù)據庫中，進行同源序列搜索(BLAST search)，下載保存于提交序列相似性較高的16S rRNA基因序列，選用MEGA 7.0軟件的Clustal W功能進行序列比對，采用Kimura 2-parameter模型，bootstrap 值為1 000，獲得Neighbour-Joining 系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.7 代表菌株持家基因和共生基因PCR擴增測序和系統(tǒng)發(fā)育分析

對代表菌株進行持家基因(atpD、glnII)和共生基因(nodC、nifH)的 PCR擴增，atpD擴增使用引物atpD225F/782R；glnII擴增使用引物glnII12F/689R；nodC擴增使用引物nodCfor540/rev1160；nifH擴增使用引物nifHF/R。具體參考張俊杰等[11]方法。所有供試菌株的PCR產物在含有Goldview I型核苷酸染料的瓊脂糖凝膠中電泳檢測，然后進行測序。PCR擴增產物的測序由上海生工生物工程股份有限公司完成。用MEGA 7.0對測序結果進行系統(tǒng)發(fā)育分析，分析方法同1.6內容。

2 結果與分析

2.1 根瘤菌的分離、純化及保藏

本研究中共分離獲得68株紫云英根瘤菌菌株，所有的菌株在YMA平板培養(yǎng)基上28 ℃條件下培養(yǎng)3～4 d后，可以形成直徑2～4 mm的單菌落。在回接驗證試驗中所有分離菌株均能在紫云英根系誘導出根瘤。

2.2 供試菌株IGS PCR-RFLP結果與分析

所有供試菌株的IGS PCR產物經過XhoI、NdeI和HaeIII共3 種限制性內切酶的酶切，在質量分數(shù)2.5 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測得到RFLP 圖譜，然后對限制性內切酶的酶切圖譜進行歸類，再結合3種內切酶的分類結果，對每株菌的3種酶切類型進行合并，最終68株紫云英供試菌株一共被分為6種IGS類型(T1～T6)，見表1。其中，NA、NB和NC分別表示為采樣點南縣的3個重復，DA和DB和DC分別表示為采樣點大通湖區(qū)的3個重復。T1 為主導類群，包含49株供試菌株，占所有供試菌株的72.1 %，而T5 和T6 類型中菌株數(shù)目最少，僅包含2株供試菌株。

表1 供試菌株的IGS PCR-RFLP結果Table 1 The IGS PCR-RFLP results of all the isolates

續(xù)表 Continuing table

2.3 16S rRNA的測序及系統(tǒng)發(fā)育分析

根據IGS PCR-RFLP 的結果，從6種IGS酶切類型中隨機選擇了8株代表菌株對其進行進一步的分子生物學鑒定，分別是NC-11、DA-9、DB-13、NA-13、NB-7、NB-11、NA-2和NA-8。將得到的16S rRNA基因序列經過修正拼接后提交到GeneBank并利用NCBI 數(shù)據庫中的BLAST工具進行序列比對，選取相關種屬中序列相似性較高的參考序列，利用Mega 7.0 軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析。如圖1所示，基于代表菌株16S rRNA 序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，8株代表菌株分布在2個進化枝中。在進化分枝I(Clade-I)中包括6株代表菌株與已知代表菌株華癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobiumhuakuii)CCBAU 2609T、MesorhizobiumjarvisiiATCC 33669T，其序列相似性均為100%。在進化分枝II(Clade II)中包括2株供試代表菌株和已知代表菌株慶笙中慢生根瘤菌(Mesorhizobiumqingshengii)CCBAU 33460T，其序列相似性為100%。供試菌株與其他中慢生根瘤菌屬(Mesorhizobium)已知種的16S rRNA基因序列相似性≥97.4 %，與外源模式菌株大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)USDA6T的相似性≤87.4 %，所以供試菌株可以被鑒定為中慢生根瘤菌屬。

圖1 基于代表菌株16S rRNA 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 The phylogenetic tree of 16S rDNA gene sequences based on the representatives strains

2.4 持家基因atpD和glnII的多位點序列分析

對根據不同IGS類型選取的8株代表菌株，將得到的atpD和glnII的基因序列經過修正后提交到GeneBank并利用NCBI 數(shù)據庫中的BLAST工具進行序列比對，選取相關種屬中序列相似性較高的參考序列，利用Mega 7.0 軟件進行多位點序列分析。如圖2所示，8個供試代表菌株分成了2組，其中7株供試代表菌株與已知代表菌株MesorhizobiumjarvisiiATCC 33669T聚為1個分支，其序列相似性≥99.5 %。另外1株供試代表菌株與已知代表菌株MesorhizobiumqingshengiiCCBAU 33460T聚為1個分支，序列相似性≥98.9 %。所有供試代表菌株與其他模式參考菌株的序列相似性均≤97 %。表明2個組中的代表菌株分別為Mesorhizobiumjarvisii和Mesorhizobiumqingshengii。

2.5 共生基因nodC和nifH的系統(tǒng)發(fā)育分析

供試代表菌株的共生基因nodC和nifH的基因序列經過修正后，提交到GeneBank并利用NCBI數(shù)據庫中的BLAST工具進行序列比對，選取相關種屬中序列相似性較高的參考序列，利用Mega 7.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析。如圖3所示，在nodC系統(tǒng)發(fā)育樹中，所有代表菌株與MesorhizobiumqingshengiiCCBAU 33460T形成了具有100 %內部相似性的獨特分支。而Mesorhizobiumjarvisii的原宿主是百脈根，這一結果暗示了在宿主紫云英的嚴格篩選下，共生基因nodC可能在中慢生根瘤菌屬內發(fā)生了水平轉移。結果表明，Mesorhizobiumjarvisii可以作為新的共生生物型與紫云英共生結瘤，如圖4所示，共生基因nifH的系統(tǒng)發(fā)育樹也表現(xiàn)出相同的拓撲結構。

圖2 代表菌株的持家基因合并序列(atpD-glnII)MLSA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The phylogenetic tree of MLSA based on concatenated sequences of atpD-glnII of the representative strains

圖3 代表菌株的共生基因nodC系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic tree of symbiotic gene nodC of the representatives strains

圖4 代表菌株的共生基因nifH系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結論和討論

本研究以湖南省益陽市南縣和大通湖區(qū)2個地點的紫云英根瘤菌為研究對象，共分離獲得68株根瘤菌菌株，通過IGS PCR-RFLP、16S rRNA PCR，持家基因(atpD、glnII) 以及共生基因(nodC、nifH)的基因測序及系統(tǒng)發(fā)育分析等分子生物學方法對所有供試菌株進行遺傳多樣性的研究。首先，通過IGS PCR-RFLP 把所有供試菌株分為6 種酶切類型，表明了該地區(qū)的紫云英根瘤菌的遺傳多樣性較高；其次,通過對供試菌株的16S rRNA測序及系統(tǒng)發(fā)育分析表明所有的供試菌株為中慢生根瘤菌屬(Mesorhizobium)，這暗示了根瘤菌的宿主專一性[12]；進而通過MLSA(atpD-glnII)分析表明，所有供試菌株可以被鑒定為M.jarvisii和M.qingshengii這2個種群，其中M.jarvisii為主導類群，這與之前的研究結果保持一致[13]。2013年在江西省首次報道能與紫云英共生結瘤的根瘤菌M.qingshengii[14]，在本研究中發(fā)現(xiàn)有4株菌為M.qingshengii。此次M.qingshengii在湖南地區(qū)的發(fā)現(xiàn)表明了該種群具有一定的區(qū)域適應性。本次分離的菌株中并未發(fā)現(xiàn)M.huakuii，但在之前的相關報道[15]中M.huakuii是湖南省和安徽省的優(yōu)勢種群。對共生基因nodC和nifH系統(tǒng)發(fā)育分析結果表明，所有供試菌株與M.qingshengii含有相同的共生基因，表明了宿主的專一性[16]。此外，M.jarvisii的原宿主為百脈根，而M.qingshengii的原宿主為紫云英。通過對共生基因nodC和nifH的分析，發(fā)現(xiàn)共生基因在屬內存在橫向轉移現(xiàn)象，這與已有相關研究結果一致[17-19]。