GPNMB、ERK、MMP3和MMP9在腎癌原發(fā)灶和骨轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)及相關(guān)性分析

翟建坡，劉寧，王海，王海東，滿立波

0 引言

轉(zhuǎn)移性腎癌中骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生率約為24%～32%。骨轉(zhuǎn)移為腎癌第二大常見轉(zhuǎn)移部位[1]。非轉(zhuǎn)移性黑色素瘤糖蛋白B（glycoprotein non-metastatic melanoma protein B,GPNMB）是近期發(fā)現(xiàn)的和多種惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移相關(guān)的一個蛋白[2-4]，其是由GPNMB基因編碼的蛋白，該基因位于7q15，編碼Ⅰ型跨膜蛋白。GPNMB與腎癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)生的時間、骨轉(zhuǎn)移的范圍、骨轉(zhuǎn)移的數(shù)目、腎癌原發(fā)灶和骨轉(zhuǎn)移灶病理分級之間的關(guān)系是本研究的目的，并探討了GPNMB骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2009年—2018年北京積水潭醫(yī)院泌尿外科、骨腫瘤科、脊柱外科收治的初診為腎癌骨轉(zhuǎn)移的患者臨床病理資料23例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）初診為腎癌骨轉(zhuǎn)移患者；（2）全身骨掃描或PETCT明確診斷為骨轉(zhuǎn)移者；（3）腎癌原發(fā)灶和骨轉(zhuǎn)移灶均行手術(shù)治療，且有明確病理標(biāo)本者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）非透明細(xì)胞癌者；（2）骨轉(zhuǎn)移灶行放療者；（3）已行靶向藥物治療者。分析指標(biāo)包括：患者的性別、年齡、骨轉(zhuǎn)移發(fā)生的時間、骨轉(zhuǎn)移的部位、骨轉(zhuǎn)移的數(shù)目、有無合并內(nèi)臟轉(zhuǎn)移以及腎癌原發(fā)灶和骨轉(zhuǎn)移灶的病理分級。腎癌原發(fā)灶和骨轉(zhuǎn)移灶分別切取病理切片作免疫組織化學(xué)分析。

1.2 主要試劑及來源

GPNMB抗體、ERK抗體、MMP3抗體和MMP9抗體均購自美國Abcam公司。即用型二抗試劑及酶底物顯色劑DAB等試劑購自中杉金橋生物有限公司。GPNMB、ERK、MMP3和MMP9的工作濃度分別是1:500、1:300、1:300和1:1000，用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對照。

1.3 免疫組織化學(xué)分析及結(jié)果判定

組織切片脫蠟、水化后，0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）抗原修復(fù)，3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，正常山羊血清封閉30 min。滴加一抗后4°C濕盒中孵育過夜。加酶標(biāo)二抗室溫20 min，DAB顯色3 min，Harris蘇木精對比染色、脫水、封片。用奧林巴斯BX53型生物顯微鏡觀察，細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色為陽性細(xì)胞。由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師采用雙盲法判斷結(jié)果。結(jié)果均采用雙評分半定量法進(jìn)行評分，依據(jù)陽性細(xì)胞比例評分：細(xì)胞陽性率＜5%為1分，5%～50%為2分，≥50%為3分；依據(jù)染色強(qiáng)度評分：不著色為1分，淡黃色為2分，黃色為3分，棕黃色為4分。最終得分為陽性細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度評分之積。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以數(shù)量及百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。計量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，原發(fā)灶與骨轉(zhuǎn)移灶蛋白表達(dá)量差異的組間比較采用配對樣本t檢驗(yàn)。其余兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床病理資料

收集到初診為腎癌骨轉(zhuǎn)移的患者23例，見表1。其中男女患者的比例是1.87:1?；颊咧心挲g最小的為38歲，年齡最大的為75歲，平均年齡58.6±9.5歲。12例患者原發(fā)灶Fuhrman分級為Ⅱ級者，其骨轉(zhuǎn)移灶Ⅱ級8例、Ⅲ級4例；9例患者原發(fā)灶Fuhrman分級為Ⅲ級者，其骨轉(zhuǎn)移灶Ⅲ級7例、Ⅳ級2例；2例患者原發(fā)灶和骨轉(zhuǎn)移灶均為Ⅳ級。在內(nèi)臟轉(zhuǎn)移中，最常見的臟器轉(zhuǎn)移為肺轉(zhuǎn)移有5例，其次為腎上腺轉(zhuǎn)移有2例，另有腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肝臟轉(zhuǎn)移者各有1例。

表1 腎癌骨轉(zhuǎn)移患者的基本情況Table 1 Clinicopathological features of renal cell carcinoma patients with bone metastasis

2.2 GPNMB、ERK、MMP3和MMP9在腎癌原發(fā)灶和骨轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)

GPNMB在腎癌原發(fā)灶和骨轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)量分別是3.65±1.87和5.91±3.68，兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001）；ERK表達(dá)量分別是3.96±1.36和5.52±3.15，兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.016）；MMP3的表達(dá)量分別是3.13±1.74和4.78±2.29，兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.036）；MMP9的表達(dá)量分別是3.91±1.76和5.26±2.98，兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.023）。

2.3 腎癌原發(fā)灶和骨轉(zhuǎn)移灶GPNMB的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

依據(jù)腎癌原發(fā)灶中GPNMB表達(dá)情況分為GPNMB高表達(dá)組（8例）和GPNMB低表達(dá)組（15例）?；颊叩男詣e、骨轉(zhuǎn)移時間和內(nèi)臟轉(zhuǎn)移在兩組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。GPNMB高表達(dá)組中，7例患者的骨轉(zhuǎn)移灶≥2處；而GPNMB低表達(dá)組患者中，只有5例患者骨轉(zhuǎn)移灶≥2處；兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.027）。GPNMB高表達(dá)組與低表達(dá)組患者中發(fā)生中軸骨轉(zhuǎn)移、四肢骨轉(zhuǎn)移、中軸骨和四肢骨均轉(zhuǎn)移的例數(shù)組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.035）。Fuhrman分級為Ⅱ級、Ⅲ級和Ⅳ級的患者在GPNMB高表達(dá)組和低表達(dá)組中例數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.01）。ERK、MMP3和MMP9在GPNMB高表達(dá)組和低表達(dá)組中的表達(dá)量組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖1、表2。

依據(jù)骨轉(zhuǎn)移灶中GPNMB的表達(dá)分為：GPNMB高表達(dá)組（11例）和GPNMB低表達(dá)組（12例），見表3?；颊叩男詣e、骨轉(zhuǎn)移時間、骨轉(zhuǎn)移數(shù)目、骨轉(zhuǎn)移范圍、內(nèi)臟轉(zhuǎn)移和Fuhrman分級在兩組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。ERK、MMP3和MMP9在GPNMB高表達(dá)組和低表達(dá)組中的表達(dá)量組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

3 討論

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)GPNMB可以促進(jìn)各種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，其中包括黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌和腎癌等[5-7]。腫瘤原發(fā)灶中的GPNMB表達(dá)與疾病的預(yù)后相關(guān)。Rose的研究發(fā)現(xiàn)GPNMB是乳腺癌預(yù)后不良的因素，GPNMB高表達(dá)的乳腺癌患者疾病復(fù)發(fā)時間短，患者總體生存率低[8]。赫崇軍等研究了GPNMB在腎癌原發(fā)灶和骨轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)及其意義，發(fā)現(xiàn)GPNMB在腎癌原發(fā)灶中的表達(dá)水平低于轉(zhuǎn)移灶，并且GPNMB高表達(dá)是患者預(yù)后不良的指標(biāo)[9]。Qin也研究了GPNMB與腎癌患者的預(yù)后，發(fā)現(xiàn)GPNMB高表達(dá)和低表達(dá)腎癌患者的中位總生存期分別是53.5月和69.月（P=0.002）[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，GPNMB高表達(dá)組患者更容易發(fā)生中軸骨和四肢骨的全身轉(zhuǎn)移（P=0.035）。既往研究多探討GPNMB與疾病預(yù)后之間的關(guān)系，而本研究則側(cè)重其與患者骨轉(zhuǎn)移的數(shù)目，骨轉(zhuǎn)移范圍等骨轉(zhuǎn)移臨床指標(biāo)的關(guān)系，并且發(fā)現(xiàn)腎癌原發(fā)灶中GPNMB高表達(dá)與腎癌骨轉(zhuǎn)移的臨床參數(shù)相關(guān)。因此腎癌原發(fā)灶中GPNMB的表達(dá)，可在一定程度上預(yù)測腎癌骨轉(zhuǎn)移的范圍。

表2 原發(fā)灶GPNMB的表達(dá)與腎癌骨轉(zhuǎn)移臨床病理特征的關(guān)系Table 2 Correlation of GPNMB expression in primary tumor with clinicopathological features of renal cell carcinoma patients with bone metastasis

圖1 GPNMB、ERK、MMP3和MMP9高表達(dá)與低表達(dá)Figure 1 High and low expression of GPNMB,ERK,MMP3 and MMP9

表3 骨轉(zhuǎn)移灶GPNMB的表達(dá)與腎癌骨轉(zhuǎn)移臨床病理特征的關(guān)系Table 3 Correlation of GPNMB expression in bone metastasis with clinicopathological features of renal cell carcinoma patients with bone metastasis

骨轉(zhuǎn)移灶中GPNMB的表達(dá)較腎癌原發(fā)灶明顯提高。本研究骨轉(zhuǎn)移灶中GPNMB高表達(dá)與骨轉(zhuǎn)移的數(shù)目和范圍、內(nèi)臟轉(zhuǎn)移等無相關(guān)性，提示腎癌原發(fā)灶中表達(dá)GPNMB的腫瘤細(xì)胞容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，而骨轉(zhuǎn)移灶中癌細(xì)胞不同于原發(fā)灶，其中GPNMB等相關(guān)蛋白在骨轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)普遍升高從而降低了其預(yù)測骨轉(zhuǎn)移范圍和程度的價值。

GPNMB促進(jìn)腫瘤骨轉(zhuǎn)移的確切機(jī)制尚不明確。Ren探討了胃癌中GPNMB的致病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)GPNMB被敲除后胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力降低，另外GPNMB通過PI3K/AKT/CCL4信號通路，募集免疫抑制細(xì)胞和增加免疫細(xì)胞的衰竭，從而增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的免疫抑制能力[11]。另有研究發(fā)現(xiàn)GPNMB能激活細(xì)胞內(nèi)的MAPK-ERK信號通路[12-14]。ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被激活后可以促進(jìn)多種MMP的產(chǎn)生[15-17]，其中也包括MMP3和MMP9蛋白。MMP蛋白則可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移能力，尤其是增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生[18-19]。Fiorentini在前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，GPNMB通過提高細(xì)胞內(nèi)MMP2和MMP9的活性，促進(jìn)了人前列腺癌細(xì)胞系DU145和PC3的腫瘤浸潤性[7]。在腎癌骨轉(zhuǎn)移患者中，GPNMB是否也可能通過ERK信號通路的激活來促進(jìn)腎癌細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生，也是本研究探討的目的。本研究發(fā)現(xiàn)，腎癌原發(fā)灶和骨轉(zhuǎn)移灶中GPNMB的高表達(dá)與ERK、MMP3和MMP9高表達(dá)相關(guān)，提示GPNMB可能通過激活ERK信號通路上調(diào)MMP3和MMP9促進(jìn)腎癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生，當(dāng)然這需要細(xì)胞分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究明確了本中心腎癌骨轉(zhuǎn)移患者的基本情況，并對腎癌原發(fā)灶和骨轉(zhuǎn)移灶中GPNMB、ERK、MMP3和MMP9蛋白的表達(dá)與骨轉(zhuǎn)移的時間、范圍、數(shù)目等指標(biāo)進(jìn)行了相關(guān)性分析，得出了初步的結(jié)論，但是該研究也存在一定局限性。由于該研究只調(diào)查了筆者所在醫(yī)療機(jī)構(gòu)的患者，因此研究存在一定的選擇偏倚。研究結(jié)論尚需要進(jìn)行更大規(guī)模的前瞻、隨機(jī)、多中心的研究來證實(shí)，且GPNMB導(dǎo)致骨轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制也需要進(jìn)行分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步探討。