胡麗超　李佳麗　楊占甲　王敬真　程自想　高凱

[摘要] 目的 探討組織因子（membrane-bound full-length，flTF）及其可溶性剪切體（alternatively spliced tissue factor， asTF）在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)，并分析其臨床意義。方法 ?采用RT-PCR方法檢測2015年7月—2018年12月方便選取在鄭州人民醫(yī)院行結(jié)腸癌切除術(shù)的42例患者的結(jié)腸癌組織及癌旁正常組織中flTF及asTF mRNA表達(dá)水平，并分析與腫瘤轉(zhuǎn)移力的影響。結(jié)果 結(jié)腸癌組織中flTFmRNA表達(dá)水平[5.53（4.80～13.32）]高于癌旁組織[0.36（0.02～1.21）]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;結(jié)腸癌組織中asTFmRNA表達(dá)水平[1.26（0.74～2.02）]高于癌旁組織[0.11（0.06～0.57）]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中flTF的表達(dá)水平[8.64（5.98～12.71）]高于無轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織（2.25（1.57～5.32）、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中asTF表達(dá)水平[5.19（4.96～7.84）]高于無轉(zhuǎn)移組（0.67（0.23～1.08）），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 flTF及asTF在結(jié)腸癌中組織中異常高表達(dá)，并與結(jié)腸癌侵襲與轉(zhuǎn)移相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 組織因子;可溶性剪切體;結(jié)腸癌

[中圖分類號] R735 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1674-0742（2020）04（c）-0010-03

Expression and Clinical Significance of Tissue Factor and Its Soluble Spliceosome in Colon Cancer

HU Li-chao， LI Jia-li， YANG Zhan-jia， WANG Jing-zhen， CHENG Zi-xiang， GAO Kai

Department of Blood Transfusion， Zhengzhou People's Hospital， Zhengzhou， Henan Province， 450003 China

[Abstract] Objective To investigate the expression of tissue factor （membrane-bound full-length （flTF） and its alternative spliced tissue factor （asTF） in colon cancer tissues， and analyze its clinical significance. Methods RT-PCR was used to detect the expression levels of flTF and asTF mRNA in colon cancer tissues and adjacent normal tissues of 42 patients who were conveniently selected and underwent colon cancer resection at Zhengzhou People's Hospital from July 2015 to December 2018. Influence of transfer force. Results The expression level of flTFmRNA[5.53（4.80～13.32）] in colon cancer tissues was higher than that in adjacent tissues[0.36（0.02～1.21）]， and the difference was statistically significant（P<0.05）; the expression level of asTFmRNA in colon cancer tissues[1.26（0.74～2.02）]， higher than adjacent tissues [0.11（0.06～0.57）]， and the difference was statistically significant. The expression level of flTF [8.64 （5.98 ～ 12.71）] in colon cancer tissues with distant metastasis was higher than that in colon cancer tissues without metastasis [2.25 （1.57～5.32）] and colon cancer tissues with distant metastases. The level （5.19 （4.96～7.84）） was higher than that in the non-metastatic group （0.67 （0.23～1.08））， and the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion flTF and asTF are abnormally highly expressed in colon cancer tissues， and are associated with colon cancer invasion and metastasis.

[Key words] Tissue factor; Soluble spliceosome; Colon cancer

組織因子（tissue factor， TF），又稱組織凝血活酶或凝血因子III，作為外源性凝血途徑的啟動因子參與機(jī)體凝血過程，此外作為凝血系統(tǒng)中唯一在細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白，具有受體特性并發(fā)揮許多非凝血功能。研究發(fā)現(xiàn)組織因子常異常表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞表面，跨膜的全長組織因子（membrane-bound full-length，flTF）和亞型異常剪接組織因子（alternatively spliced tissue factor， asTF）均可影響腫瘤多種病理過程，如腫瘤相關(guān)血管生成、腫瘤相關(guān)血栓、腫瘤增值及遷移等[1]。該課題組前期結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620高表達(dá)flTF，通過激活細(xì)胞表面PAR2受體促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增值和遷移[2]，該研究方便收集2015年7月—2018年12月在鄭州人民醫(yī)院行結(jié)腸癌切除術(shù)的42例患者的結(jié)腸癌組織及癌旁正常組織，繼續(xù)探討flTF和asTF在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況及對腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，報道如下。

1 ?資料與方法

1.1 ?一般資料

方便收集在鄭州人民醫(yī)院行結(jié)腸癌切除術(shù)的42例患者的結(jié)腸癌組織及癌旁正常組織（>3 cm），所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)確診，42例患者年齡36～67歲，平均年齡（47.7±8.5）歲，其中腺癌25例，鱗細(xì)胞癌12例，其他5例;發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者10例，未發(fā)生轉(zhuǎn)移者32例。

1.2 ?試劑

TRIzol購自Invitrogen公司，RIPA購自碧云天生物技術(shù)有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Toyobo公司，實(shí)時熒光定量PCR試劑盒購自康為世紀(jì)有限公司，ECL顯色試劑、PVDF膜購自Millipore公司。

1.3 ?方法

總RNA抽提及RT-qPCR的擴(kuò)增：取100 mg結(jié)腸癌組織和癌旁組織分別加入1 mlTrizol試劑，徹底勻漿，按照試劑說明書提取總RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，CFX96熒光定量PCR分析儀（美國Bio Rad公司）檢測flTF、asTF及β-actin mRNA表達(dá)水平。引物序列見表1，目的基因相對表達(dá)量為目的基因拷貝數(shù)與β-actin拷貝數(shù)的比值。

1.4 ?統(tǒng)計方法

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料采用（x±s）表示，正態(tài)分布數(shù)據(jù)兩組間比較采用t檢驗(yàn)，計數(shù)資料[n（%）]行χ2檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 ?結(jié)果

2.1 ?結(jié)腸癌組織及癌旁組織中flTF mRNA的表達(dá)

采用實(shí)時定量PCR檢測42例結(jié)腸癌組織及癌旁組織中flTF mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示結(jié)腸癌組織flTF mRNA相對表達(dá)量5.53（4.80～13.32）明顯高于癌旁正常組織0.36（0.02～1.21），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖1。

2.2 ?結(jié)腸癌組織及癌旁組織中asTF mRNA的表達(dá)

采用實(shí)時定量PCR檢測42例結(jié)腸癌組織及癌旁組織中asTF mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示結(jié)腸癌組織asTF mRNA相對表達(dá)量1.26（0.74～2.02）明顯高于癌旁組織0.11（0.06～0.57），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖2。

2.3 ?結(jié)腸癌組織中TF的表達(dá)與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系

比較42例結(jié)腸癌組織中有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移標(biāo)本組與無轉(zhuǎn)移組中flTF及asTF的表達(dá)差異，結(jié)果顯示有轉(zhuǎn)移組flTF mRNA表達(dá)高于無轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。

3 ?討論

組織因子作為機(jī)體凝血過程的啟動子，也發(fā)揮許多非凝血功能，參與血管新生、炎癥、動脈粥樣斑塊形成等多種生理病理過程。大量研究表明TF異常表達(dá)在多種腫瘤細(xì)胞表面，如胰腺癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌中，TF可與凝血因子Ⅶ形成復(fù)合物（TF-FⅦ）激活細(xì)胞表面蛋白酶激活受體，促進(jìn)腫瘤相關(guān)血管生成和腫瘤增殖，并與腫瘤的侵襲、遷移、預(yù)后及藥物抵抗等相關(guān)[3]。近年來新發(fā)現(xiàn)的組織因子異常剪接組織因子（alternatively spliced tissue factor，asTF），由于TF前體mRNA的整個第5號外顯子被異常剪切導(dǎo)致第6號外顯子編碼的跨膜區(qū)和胞漿區(qū)缺失，形成由206個氨基酸組成的可溶性的asTF。與flTF信號傳導(dǎo)和作用機(jī)制不同，asTF不參與凝血過程，卻可以通過與整合素家族結(jié)合促進(jìn)腫瘤相關(guān)血管生成[4]?，F(xiàn)有研究針對flTF的功能和作用機(jī)制研究較多，對asTF的作用研究較少，asTF在腫瘤進(jìn)展中所起的作用和具體機(jī)制仍不明確。

該研究通過RT-PCR方法檢測結(jié)腸癌組織及癌旁正常組織flTF的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中flTF mRNA[5.53（4.80～13.32）]較癌旁正常組織[0.36（0.02～1.21）]異常高表達(dá)，在有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中flTF表達(dá)比癌旁正常組織中高4倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。Eriksson O通過免疫組織化學(xué)方法也證實(shí)結(jié)腸癌組織中高表達(dá)TF，Clouston HW體外培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞株DLD-1發(fā)現(xiàn)其TF活性異常增強(qiáng)（10.5±5.23），該研究結(jié)果與其結(jié)果一致[5-6]。然而結(jié)腸癌組織中aTF表達(dá)水平還未有研究，該研究通過RT-PCR方法同時檢測結(jié)腸癌組織及癌旁組織的asTF mRNA水平并分析與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)asTF也異常高表達(dá)于結(jié)腸癌組織中，并在有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中更高表達(dá)，提示flTF及asTF的高表達(dá)都與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其是腫瘤進(jìn)展的觸發(fā)因素還是結(jié)果及兩者之間的關(guān)聯(lián)還有待進(jìn)一步研究探討。相繼有研究者發(fā)現(xiàn)TF亞型的高表達(dá)與其他腫瘤進(jìn)展也有一定的關(guān)系，Wu M等[7]研究發(fā)現(xiàn)flTF及asTF均高表達(dá)于胃癌組織中[7.45（0.34～33.68）、0.88（0.07～26.00）]，高表達(dá)flTF及asTF的胃癌患者生存期較短，推測flTF及asTF表達(dá)水平是關(guān)系胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素。Rollin等[8]在57例非小細(xì)胞肺癌患者中的臨床研究中發(fā)現(xiàn)腫瘤中asTF的高表達(dá)可縮短患者的生存時間;Kocaturk等[9]指出asTF與乳腺癌腫瘤的大小、分期密切相關(guān)。提示flTF及asTF可能作為臨床中監(jiān)測腫瘤進(jìn)展的危險因子。體內(nèi)外研究表明運(yùn)用TF亞型抗體能抑制胰管腺癌、乳腺癌、肺癌等的增殖和轉(zhuǎn)移，提示TF可能成為惡性腫瘤新的治療靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2020-01-06）