王萌慧 高瑛 李家璜，2 華子春，2

（1. 南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 醫(yī)藥生物技術(shù)國家重點實驗室，南京 210023；2. 江蘇省產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所 常州南京大學(xué)高新技術(shù)研究院，常州 213164）

生物納米磁珠是由復(fù)合鐵氧體強磁核、磁核外層的高分子殼層材料構(gòu)成的磁性微球，又稱磁珠。磁珠表面能夠包裹功能基層，如各種離子、抗體、抗原、核酸和酶等，被應(yīng)用于靶向藥物載體、細胞分離、核酸和蛋白生物大分子的分離、免疫檢測、微生物檢測、固定化酶等多個生物領(lǐng)域［1-4］。近年來，磁珠以其分散性良好、對生物分子的結(jié)合快速有效、絮凝可逆可控等優(yōu)點，在生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注［5-6］。

利用磁珠表面的功能基層與蛋白質(zhì)的特異性吸附，可以進行蛋白質(zhì)的富集純化或者用于免疫檢測［7-9］。以表面經(jīng)過特殊修飾的磁珠作為工具，對蛋白質(zhì)進行分離濃縮，是一種簡便快捷的蛋白質(zhì)純化技術(shù)。Lin等［10］合成氨基苯硼酸修飾的磁珠，用以吸附和提純糖蛋白；Uygun等［11］制備了磁性納米珠，用于從雞卵清蛋白中純化溶菌酶，納米珠對溶菌酶的吸附能力良好。表面包裹抗體或抗原的免疫磁珠可用于免疫檢測，利用免疫磁珠的生物標(biāo)記對腫瘤的生物標(biāo)志物進行檢測，近年來已經(jīng)引起研究者們很大的研究興趣。Feng等［12］使用免疫磁珠可快速檢測前列腺特異性抗原；Pan等［13］用固定化癌胚抗原抗體的磁性納米顆粒作為免疫傳感器，可以檢測人血清中的癌胚抗原。

無論對于蛋白質(zhì)的分離純化還是免疫檢測等，磁珠表面與蛋白質(zhì)的非特異性結(jié)合都是不利的。一方面，非特異性吸附會影響純化蛋白的純度和磁珠載量；另一方面，非特異性吸附容易干擾免疫檢測的結(jié)果，導(dǎo)致檢測結(jié)果的假陽性。例如，林梅雙［14］利用磁珠吸附濃縮乙型肝炎表面抗原（HBsAg）陽性血清中的HBsAg，雖然提高了抗原濃度，但是洗脫液中有較多的與磁珠非特異性吸附的雜蛋白；石若冰等［15］使用Cu2+螯合的磁性微球純化大腸桿菌表達的鎮(zhèn)痛抗腫瘤多肽，用200 mmoL/L的咪唑溶液可完全洗脫多肽，但同時也包含了與磁珠非特異性吸附的雜蛋白；田晶晶等［16］為避免由于非特異性吸附造成檢測結(jié)果的假陽性，研究不同的偶聯(lián)緩沖液，從而改善蛋白與磁珠的非特異吸附程度。納米磁珠對蛋白質(zhì)的非特異性吸附是一直存在的問題。

為研究蛋白質(zhì)與磁珠的非特異性吸附，本實驗選取兩種無功能基層的普通納米磁珠，分析6種不同的蛋白質(zhì)與磁珠吸附的行為，探討蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)與非特異性吸附之間的關(guān)聯(lián)。選取的磁珠A和磁珠B均為二氧化硅包被的四氧化三鐵磁性納米顆粒，磁珠A的粒徑為500 nm，磁珠B的粒徑為400 nm。在水溶液中，磁珠的二氧化硅表面會形成大量羥基，這類磁珠可以用來特異性提取核酸，而不會與蛋白質(zhì)等其他雜質(zhì)結(jié)合，進而用來研究磁珠與蛋白質(zhì)的非特異性結(jié)合。依據(jù)蛋白與磁珠吸附的特異性、蛋白結(jié)構(gòu)、蛋白實用性及蛋白大小，本實驗選取了6種蛋白。選取的磁受體蛋白（dMagR）是為數(shù)不多的可以與磁珠特異性結(jié)合的蛋白［17-18］，選取磁受體蛋白突變體（dMagR mutant）作為與磁珠特異性吸附的陰性對照。此外，考慮到蛋白的二級結(jié)構(gòu)及實驗室中的實用性，選取了人膜聯(lián)蛋白A5（Annexin A5）和人腫瘤壞死因子 -α（TNFα）?？紤]到蛋白大小，選取了基于上述2種蛋白的融合蛋白——磁受體蛋白-紅色熒光蛋白（dMagR-RFP）和人膜聯(lián)蛋白A5-增強綠色熒光蛋白（Annexin A5-EGFP）。分析該6種蛋白與磁珠的吸附作用，并采用計算機分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，探討蛋白質(zhì)的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)與磁珠非特異性吸附的關(guān)系，旨為納米磁珠在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用提供一定的借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 于南京金斯瑞公司合成dMagR的基因序列，將其活性位點的3個半胱氨酸突變?yōu)?個丙氨酸成為dMagR mutant，RFP基因片段來自于本實驗室，使用pET28a（+）質(zhì)粒，構(gòu)建表達不同蛋白的BL21菌株（表1）。所有菌株均為卡那霉素抗性。

表1 表達不同蛋白的菌株

1.1.2 試劑與儀器 納米磁珠A（二氧化硅包被的四氧化三鐵磁性納米顆粒，粒徑500 nm）和納米磁珠B（二氧化硅包被的四氧化三鐵磁性納米顆粒，粒徑400 nm），大腸桿菌表達菌株BL21（DE3），卡那霉素（K+），異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），恒溫搖床，磁力吸附架，高壓細胞破碎機（永聯(lián)生物科技公司，上海），MOE2019軟件（Chemical computing Group ULC，加拿大），Discovery Studio 2.55軟件、Discovery Studio 2017R2客戶端軟件（BIOVIA公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 蛋白表達 將上述菌株以1%接種量，接種于LB培養(yǎng)基中，先37℃，220 r/min于搖床中培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8，再降溫至20℃，轉(zhuǎn)速降低至150 r/min，按照表1添加誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)表達16-18 h后收菌，用一定體積的TBS緩沖液（20 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，pH 8.0）重懸，保證不同菌株的重懸裂解液OD值相同，用高壓細胞破碎機裂解細菌獲得菌體裂解液，用于后續(xù)磁珠吸附實驗。

1.2.2 磁珠吸附 將10 mg/mL的磁珠溶液200 μL與500 μL的表達不同蛋白的菌體裂解液（磁珠孵育液）混勻，使磁珠過飽和，室溫孵育30 min，然后使用磁力吸附架吸附磁珠，棄去上清液，使用TBS緩沖液1 mL洗滌樣品6次，隨后使用50 μL 1×電泳緩沖液重懸磁珠沉淀，煮沸樣品15 min，洗脫分離和磁珠沉淀結(jié)合的蛋白，離心取上清10 μL樣品，進行SDS-PAGE電泳檢測，使用Image J進行灰度分析，計算磁珠的蛋白吸附率。公式如下：

1.2.3 蛋白結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)分析 人源Annexin A5、人 TNFα、RFP和 EGFP的3級結(jié)構(gòu)來源于Protein Data Bank（https：//www.rcsb.org/），分別為 ：2XO3、6RMJ、3M22和2WSN；果蠅dMagR的序列從 Uniprot獲取（https：//www.uniprot.org/，序列號Q8T3X9），以序列相似性（positives）為62%，來源于大腸桿菌（E.coli）的SufA 蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：1R98）為模板，利用MOE2019軟件構(gòu)建果蠅dMagR的三級結(jié)構(gòu)，分析各個蛋白結(jié)構(gòu)，并計算各蛋白質(zhì)的性能，包括可及表面、親疏水性、理論等電點。利用Discovery Studio 2.55軟件構(gòu)建了融合蛋白結(jié)構(gòu)，并分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。采用Discovery Studio 2017R2客戶端軟件對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)作圖展示。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用 GraphPad Prism 軟件進行數(shù)據(jù)的顯著性差異分析，P< 0.05 表示具有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 突變體dMagR mutant和磁珠有非特異性吸附

本研究將dMagR作為蛋白質(zhì)與磁珠特異性吸附的陽性對照。同時，將dMagR中與鐵硫簇結(jié)合的活性中心3個半胱氨酸（Cys）突變?yōu)楸彼幔ˋla）——突變體dMagR mutant，使其喪失與鐵硫簇結(jié)合的能力，從而不能與磁珠特異性吸附，作為陰性對照。利用磁珠A和B分別對dMagR及其突變體dMagR mutant進行吸附。無論是用磁珠A還是磁珠B進行吸附，吸附后均可獲得單一蛋白條帶（圖1-A，圖1-C）。突變體dMagR mutant在兩種磁珠中均有吸附，吸附量均低于野生型dMagR，磁珠A對兩種蛋白質(zhì)的吸附率均高于磁珠B（圖1-B，圖1-D）。

2.2 磁珠的非特異性吸附與蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)有關(guān)

為了探討蛋白質(zhì)的自身性質(zhì)對非特異性吸附的影響，除了dMagR mutant，本研究還另外選取兩種不會與實驗所用磁珠發(fā)生特異性吸附的蛋白——人腫瘤壞死因子-α（TNFα）和人膜聯(lián)蛋白A5（Annexin A5），分別與兩種磁珠吸附，SDS-PAGE分析，3種蛋白與磁珠均有不同程度的非特異性吸附，磁珠A對蛋白的吸附量均要高一些。磁珠A和磁珠B可以從細菌裂解液中吸附蛋白獲得單一條帶，分別對不同磁珠吸附所得的同一張電泳圖中的條帶進行灰度值分析，得出不同磁珠吸附蛋白的吸附率。研究發(fā)現(xiàn)不論磁珠A還是磁珠B，3種蛋白質(zhì)與磁珠的非特異性吸附量呈現(xiàn)相同的趨勢：TNFα> dMagR mutant >Annexin A5（圖2-A，圖2-B）。

圖1 不同磁珠吸附dMagR及突變體dMagR mutant蛋白的SDS-PAGE分析及蛋白吸附率

進一步對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進行分析。軟件分析上述3種蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)（圖3）并計算TNFα、dMagR mutant 和Annexin A5的分子量、可及表面、親水表面性比例，蛋白質(zhì)電荷以及二級結(jié)構(gòu)比例（表2）。3種蛋白質(zhì)的分子量與可及表面比較：dMagR mutant< TNFα

圖2 不同磁珠吸附不同蛋白的吸附率比較

圖3 TNFα、dMagR mutant和Annexin A5的結(jié)構(gòu)

值得注意的是蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，TNFα的二級結(jié)構(gòu)以β折疊為主，dMagR mutant 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)是β 折疊+α 螺旋混合，而Annexin A5的二級結(jié)構(gòu)全部是α-螺旋。對β折疊比例比較可知：TNFα > dMagR mutant > Annexin A5，與蛋白質(zhì)在磁珠上的吸附趨勢相一致，結(jié)果表明蛋白質(zhì)中β折疊比例大小與蛋白的非特異性吸附量呈正相關(guān)，α螺旋比例大小則與蛋白質(zhì)吸附量呈負相關(guān)。

2.3 融合蛋白與磁珠的特異性及非特異性吸附

為了驗證蛋白質(zhì)大小及二級結(jié)構(gòu)比例對蛋白與磁珠吸附的影響，分別將能夠特異性吸附的dMagR蛋白及其融合體dMagR-RFP及其融合體dMagRRFP、非特異性吸附蛋白Annexin A5及其融合蛋白Annexin A5-EGFP進行磁珠吸附實驗發(fā)現(xiàn)，兩種融合蛋白在磁珠A吸附量較原來的蛋白均有所增加，磁珠B中Annexin A5-EGFP吸附量也高于Annexin A5，但是對dMagR-RFP的吸附與dMagR相比略有減少（圖4-B和圖4-C）。對兩種融合蛋白的結(jié)構(gòu)進行分析（圖5），與dMagR及Annexin A5融合的蛋白均為β折疊為主的蛋白。對二級結(jié)構(gòu)比例進行計算（表3），非特異性吸附蛋白Annexin A5融合EGFP后，蛋白大小增加（圖4-A），β折疊比例升高，與磁珠的非特異性吸附增加，且兩種磁珠顯示的結(jié)果一致（圖4-B，圖4-C）。而對于特異性吸附的蛋白dMagR而言，在融合RFP后，分子量增加（圖4-A），β折疊比例略有升高，與磁珠A的吸附明顯增加，但與磁珠B的吸附略有減少（圖4-B和圖4-C）。

表2 不同蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)性質(zhì)參數(shù)

圖4 不同磁珠對不同大小的融合蛋白的吸附分析

3 討論

為了探究不同蛋白質(zhì)與生物納米磁珠的特異性與非特異性吸附，本研究使用了2種納米磁珠、6種不同的蛋白質(zhì)來探討納米磁珠和蛋白質(zhì)的特異性與非特異性吸附。已有研究報道細菌裂解液中的磁受體蛋白dMagR可以與磁珠特異性吸附，進而可以獲得單一dMagR蛋白條帶［17］。此外，將dMagR與酶連接，利用dMagR與磁珠的特異性吸附，只需一步就可以將酶從細菌裂解液中純化并固定［18］。因此，選取磁受體蛋白dMagR作為特異性吸附的陽性對照，突變dMagR的活性中心獲得dMagR mutant作為特異性吸附的陰性對照。由于突變體dMagR mutant中的半胱氨酸Cys被突變成丙氨酸Ala，不能與［2Fe-2S］鐵硫簇結(jié)合［17］，喪失與磁珠特異性吸附的性質(zhì)，使得理論上突變體dMagR mutant蛋白與磁珠不具有吸附能力。然而，本研究發(fā)現(xiàn)dMagR mutant蛋白與磁珠仍然具有吸附能力，分析其原因，認為是蛋白與磁珠的非特異性吸附導(dǎo)致的。此外，不僅dMagR mutant蛋白與磁珠具有非特異性吸附，TNFα與磁珠的非特異性吸附更強，利用該非特異性吸附的性質(zhì)可以將蛋白從細菌裂解液中純化，獲得目的蛋白，且條帶單一、純度較高。吳明琿等［19］以羧基修飾的聚苯乙烯磁珠作為載體，包裹人血清白蛋白抗體，可以純化人血清白蛋白。而本研究利用蛋白質(zhì)與磁珠的非特異性吸附，無需使用包裹特殊功能基團的生物納米磁珠即可純化獲得單一條帶的目的蛋白，是一種簡單可行的蛋白純化方法，可為以后的蛋白純化技術(shù)提供一種新思路。

圖5 dMagR-RFP和Annexin A5-EGFP的結(jié)構(gòu)

表3 不同蛋白結(jié)構(gòu)的性質(zhì)參數(shù)

為了研究蛋白與磁珠產(chǎn)生非特異性的原因，本研究重點關(guān)注了不同蛋白的基本理化性質(zhì)和蛋白二級結(jié)構(gòu)。TNFα、dMagR mutant 和 Annexin A5這3種蛋白的非特異性吸附能力為：TNFα > dMagR mutant> Annexin A5。由于dMagR mutant蛋白分子量最小，Annexin A5分子量最大，TNFα分子量居中，因此蛋白大小與其非特異性吸附能力無明顯的關(guān)聯(lián)。本研究對二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，隨著蛋白與磁珠非特異性能力的增強，蛋白的β折疊比例增加，α螺旋比例降低，這說明蛋白與磁珠非特異性吸附的能力與蛋白β折疊結(jié)構(gòu)的比例呈正相關(guān)。Vertegel等［20］研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)接近納米顆粒表面時，相互作用變強，將促使蛋白質(zhì)的α螺旋結(jié)構(gòu)減少，蛋白質(zhì)活性變?nèi)酢orde［21］依據(jù)熱力學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在許多條件下，蛋白與磁珠的吸附是由熵增加驅(qū)動的。當(dāng)?shù)鞍着c納米磁珠表面接近時，蛋白α螺旋結(jié)構(gòu)含量的減少，會導(dǎo)致沿多肽鏈的旋轉(zhuǎn)自由度的增加，隨之而來的熵增可以促進蛋白質(zhì)與磁珠的吸附［21］。上述研究顯示，α螺旋結(jié)構(gòu)可能不利于蛋白質(zhì)與納米磁珠的吸附。這可能是α螺旋結(jié)構(gòu)比例低、β折疊結(jié)構(gòu)比例高的蛋白質(zhì)易于與磁珠吸附的原因之一。

對于TNFα、dMagR mutant 和 Annexin A5這3種蛋白，磁珠A和磁珠B的吸附能力差異較大，磁珠A吸附力強于磁珠B。其主要差異為粒徑的差異，磁珠A的粒徑大于磁珠B。Vertegel等［20］研究發(fā)現(xiàn)，較大的納米顆粒有較大的吸附作用，粒徑大的顆粒表面會有多層吸附，進而導(dǎo)致吸附量的增加。磁珠A粒徑為500 nm，磁珠B粒徑為400 nm，因此會導(dǎo)致磁珠A對蛋白的吸附力強于磁珠B。此外，磁珠的表面粗糙度也會影響磁珠對蛋白的吸附能力［22］，增大磁珠的表面粗糙度，會導(dǎo)致蛋白吸附量的提高，這也可能是兩種磁珠對蛋白吸附能力不同的原因。

對于分子量增大的融合蛋白，特異性蛋白dMagR融合RFP后，β折疊比例升高，與不同磁珠吸附有不同的結(jié)果，吸附率有升高也有降低，這可能是由于蛋白本身性質(zhì)及磁珠性質(zhì)導(dǎo)致的。dMagR蛋白與磁珠的吸附既有特異性吸附也有非特異性吸附，因此蛋白的β折疊比例升高不一定導(dǎo)致總吸附量的增加。磁珠的粒徑和分散性，也會導(dǎo)致不同的蛋白吸附量［23］。磁珠A的粒徑大于磁珠B，磁珠A對蛋白的吸附力大于磁珠B，磁珠表面的粗糙度也會影響蛋白與磁珠的吸附能力，從而導(dǎo)致dMagRRFP蛋白與兩種磁珠的吸附能力不同。而非特異性蛋白Annexin A5融合EGFP后，β折疊比例升高，與磁珠的非特異性吸附率升高。這與本研究上述的研究結(jié)果相一致，β折疊比例與蛋白的非特異性吸附能力呈正比，因此β折疊比例升高的Annexin A5-EGFP蛋白與磁珠的非特異性吸附能力增強。

4 結(jié)論

蛋白質(zhì)大小不是影響磁珠吸附蛋白能力的決定性因素，磁珠對蛋白的非特異性吸附能力與蛋白的β折疊結(jié)構(gòu)比例呈正相關(guān)，蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)對蛋白質(zhì)與磁珠之間的非特異性吸附有重要影響。