黃加玲, 劉鳳嬌,2, 王婷婷, 劉翠娥, 鄭鳳英,2, 王振紅, 李順興,2

(1. 閩南師范大學(xué)化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院,2. 現(xiàn)代分離分析科學(xué)與技術(shù)福建省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室&污染監(jiān)測(cè)與控制福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 漳州 363000)

胃癌是人類(lèi)最常見(jiàn)惡性腫瘤之一, 是全球癌癥致死的第三大原因[1]. 目前尚無(wú)高敏感性、高特異性的胃癌篩查和診斷方法, 而胃液能直接反映胃代謝情況, 測(cè)試高危人群的胃液pH值是簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、有效的胃癌篩查指標(biāo)之一[2]. 監(jiān)測(cè)新生兒胃液的pH值可預(yù)測(cè)胃腸功能[3], 從而防止新生兒窒息[4,5]. 因此, 精確測(cè)量胃液中的pH值非常重要.

目前體內(nèi)胃液pH值檢測(cè)常采用插管方式, 從胃管抽吸胃液, 用0.01級(jí)pH精密試紙測(cè)定[6]; 或采用動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)法, 經(jīng)鼻留置反流監(jiān)控導(dǎo)管, 將包含有雙晶銻金屬電極pH監(jiān)測(cè)導(dǎo)管監(jiān)測(cè)器放置于下食道括約肌位置(LES)上5 cm處[7]. 測(cè)試方式易使患者產(chǎn)生不適感, 且監(jiān)測(cè)器依賴(lài)進(jìn)口, 費(fèi)用高. 熒光法不僅在觀察pH值時(shí)空變化上有優(yōu)勢(shì), 且具有較高的靈敏度, 大多數(shù)情況下對(duì)細(xì)胞無(wú)損、對(duì)人體無(wú)害.

與傳統(tǒng)有機(jī)染料及半導(dǎo)體量子點(diǎn)相比, 熒光碳量子點(diǎn)具有光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定[8]、水溶性[9]、易表面官能化[10,11]、生物相容性好[12]和細(xì)胞毒性較低[13]等優(yōu)勢(shì), 近幾年廣泛用于生物成像[14]、化學(xué)傳感[15,16]、納米醫(yī)學(xué)[17,18]、光催化[19]和電催化[20]等領(lǐng)域. 其中N,S-CQDs量子產(chǎn)率較高、毒性低[21,22], 已用來(lái)測(cè)量細(xì)胞內(nèi)pH值, 但對(duì)低pH值(<5.00)準(zhǔn)確的熒光測(cè)量數(shù)據(jù)仍比較缺乏. 雖已有適用于胃酸環(huán)境的N,S-CQDs, 但其精度僅為0.1[23].

本文以水楊酸和硫脲為原料, 采用一步水熱法合成了N,S-CQDs, 并對(duì)其實(shí)時(shí)、原位監(jiān)測(cè)人體胃液pH值進(jìn)行了分析研究, 結(jié)果對(duì)胃癌早期診斷和預(yù)防新生兒窒息具有重要意義.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

水楊酸(C7H6O3)和2-氨基吡啶(C5H6N2)購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司; 牛血清蛋白、胃蛋白酶和黏液素購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司; 葡萄糖(C6H12O6)、尿素[CO(NH2)2]、硫脲(CH4N2S)、Na2HPO4、NaH2PO4、NaOH、HCl、NaCl、MgCl2、CaCl2、KCl、CoCl2、NiCl2、CdCl2、MnCl2、FeCl3、CrCl3、CuCl2、MnCl2、PbCl2、ZnCl2、MgCl2和 HgCl均購(gòu)于西隴化工股份有限公司; 以上所有試劑均為分析純; 透析袋(1000 Da)購(gòu)于美國(guó)聯(lián)合碳化Viskase公司; 實(shí)驗(yàn)用水為電阻率≥18.2 MΩ·cm的超純水, 由美國(guó)Millipore-Q 超純水機(jī)制備.

PHS-3E型pH計(jì)(上海雷磁儀器有限公司); JEM-2100型場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡(TEM, 日本JEOL公司); D8 Advance型X射線衍射儀(XRD, 德國(guó)Bruker公司); Thermo Scientific Escalab 250Xi型X射線光電子能譜儀(XPS, 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司); Zetasizer Nano ZS90型納米粒度及電位儀(英國(guó)Malvern公司); Nicolet iS5型傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR, 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司); ZF-20D型暗箱式紫外分析儀(上海市寶山顧村電光儀器廠); UV-5800PC型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司); Cary Eclipse型熒光分光光度計(jì)(美國(guó)Agilent 公司).

1.2 N,S-CQDs的制備

將1 mg硫脲和3 mg水楊酸溶于30 mL超純水, 超聲10 min, 轉(zhuǎn)移至50 mL聚四氟乙烯內(nèi)襯高壓反應(yīng)釜中. 將反應(yīng)釜于烘箱中加熱至200 ℃, 恒溫8 h, 自然冷卻至室溫. 將溶液在11000 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min, 除去大顆粒雜質(zhì), 再經(jīng)透析袋(1000 Da)透析24 h, 經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾, 將溶液冷凍干燥, 獲得的固體置于冰箱中于4 ℃下保存, 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要再將固體重新溶解于超純水中.

1.3 熒光量子產(chǎn)率計(jì)算

鑒于N,S-CQDs熒光激發(fā)波長(zhǎng)為302 nm, 將2-氨基吡啶溶于0.1 mol/L硫酸溶液中(折射率:η=1.33), 測(cè)得產(chǎn)率(在285 nm處量子產(chǎn)率60%), 作為標(biāo)準(zhǔn)參照物. 將碳量子點(diǎn)溶于超純水中(η=1.33), 通過(guò)將積分的光致發(fā)光強(qiáng)度和吸光度值與2-氨基吡啶進(jìn)行比較, 測(cè)量N,S-CQDs量子產(chǎn)率, 其相對(duì)熒光量子產(chǎn)率(Φ, %)計(jì)算公式為

(1)

式中,Φ(%)為相對(duì)熒光量子產(chǎn)率;I為熒光發(fā)射峰的積分面積;A為熒光激發(fā)波長(zhǎng)的紫外-可見(jiàn)光吸光度值;η(%)為折射率; 下標(biāo)R是指量子產(chǎn)率的參考熒光物質(zhì).

1.4 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

N,S-CQDs具有較低的細(xì)胞毒性和良好的生物相容性, 處理人類(lèi)細(xì)胞24 h, 細(xì)胞存活率高于90%[21,22], 適用于人體組織, 但其環(huán)境毒性測(cè)試尚未見(jiàn)報(bào)道. 鑒于銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa, FACHB-905, 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所國(guó)家淡水藻種庫(kù))屬湖泊、水庫(kù)及其它水域生態(tài)系統(tǒng)中常見(jiàn)藍(lán)藻, 以此為水生浮游生物模式, 測(cè)試N,S-CQDs的環(huán)境毒性. 藻種培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[24]方法, 每組設(shè)3個(gè)平行實(shí)驗(yàn), 所有實(shí)驗(yàn)用容器、溶液、超純水均作滅菌處理. 擬定對(duì)照組細(xì)胞的細(xì)胞存活率為 100%, 使用下式計(jì)算細(xì)胞存活率(Cell viability,%):

Cell viability=(ODtreated/ODcontrol)×100%

(2)

式中, ODtreated和ODcontrol分別代表實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的藻體生物量, 即對(duì)應(yīng)藻液在680 nm波長(zhǎng)處的光密度.

1.5 胃液pH值檢測(cè)

參照文獻(xiàn)[25]方法配制含有機(jī)物、無(wú)機(jī)物和消化酶的人體胃液(pH=1.07±0.07, 4 ℃). 取9 mL胃液, 用HCl或NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH值(2.01, 2.26, 2.53, 2.76 3, 3.26, 3.53, 3.77, 3.99, 4.20, 4.54, 5.11), 加入N,S-CQDs溶液(10 mg/mL, 1 mL), 在λex=302 nm熒光激發(fā)下分別測(cè)定發(fā)射峰λem=409 nm處的熒光強(qiáng)度. 以熒光發(fā)射峰強(qiáng)度值(FL intensity)對(duì)pH值做線性擬合, 得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式和相關(guān)系數(shù)(R2), 探究碳量子點(diǎn)對(duì)胃液pH值的響應(yīng)情況.

1.6 金屬離子對(duì)熒光檢測(cè)干擾

金屬離子可對(duì)N,S-CQDs熒光性能產(chǎn)生干擾[26,27]. 以0.5 mmol/L胃中常見(jiàn)金屬離子(Na+, K+, Fe3+, Mn2+, Cd2+, Ca2+, Pb2+, Zn2+, Hg+, Co2+, Mg2+, Ni2+)為干擾物, 測(cè)試它們對(duì)N,S-CQDs的熒光響應(yīng). 鑒于胃癌組織中鐵含量顯著高于正常胃黏膜組織[28], 且主要以Fe(Ⅲ)存在, 實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了Fe(Ⅲ)濃度(0, 1, 2, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 400, 500 μmol/L)對(duì)N,S-CQDs(10 mg/mL, 1 mL)熒光性能的影響.

2 結(jié)果與討論

2.1 N,S-CQDs的結(jié)構(gòu)表征

由圖1(A)的TEM照片可知, N,S-CQDs粒徑均勻、分散性好、大致呈圓球狀. 由粒徑呈正態(tài)分布圖[圖1(B)]可見(jiàn), 其平均粒徑為6.69 nm. 由單納米顆粒圖像[圖1(C)]可得碳量子點(diǎn)晶格間距為0.21 nm, 與石墨(sp2)碳的(002)衍射面幾乎相同. XRD譜圖[圖1(D)]在約2θ=24.9°處出現(xiàn)一個(gè)典型的石墨結(jié)構(gòu)特征峰[13], 進(jìn)一步證實(shí)N,S-CQDs的結(jié)晶性較好.

Fig.1 HRTEM images(A, C), size distribution(B) and XRD pattern(D) of N,S-CQDs

Fig.2 FTIR spectrum of N,S-CQDs

Fig.3 XPS spectra of C1s(A), N1s(B), O1s(C) and S2p(D) of N,S-CQDs

Fig.4 UV-Vis absorption spectrum and fluorescence spectra of N,S-CQDs(A) and fluorescence spectroscopy of N,S-CQDs with different excitation wavelengths(B) Insets in (A) are photos of N,S-CQDs irradiated by natural light(left) and 300 nm UV light(right).

N,S-CQDs作為熒光探針, 實(shí)際環(huán)境中離子強(qiáng)度、抗光漂白性、熒光持久度、酸堿可逆性等均對(duì)其性能發(fā)揮起著至關(guān)重要的作用, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示. N,S-CQDs的熒光強(qiáng)度和光譜特征在0～2.0 mol/L NaCl介質(zhì)中沒(méi)有明顯變化[圖5(A)]. 當(dāng)N,S-CQDs溶液的pH值分別為4.27, 7.42和8.88時(shí), 紫外燈照射1 h其熒光強(qiáng)度的變化見(jiàn)圖5(B), 發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的抗光漂白性. 將pH值為4.27的N,S-CQDs溶液置于4 ℃冰箱內(nèi), 每隔30 d測(cè)量一次熒光光譜, 結(jié)果如圖5(C)所示, 90 d后其熒光強(qiáng)度依然保持不變. 圖5(D)表征了N,S-CQDs的pH可逆性, 用于評(píng)價(jià)N,S-CQDs在酸堿介質(zhì)之間切換時(shí)的可逆行為. 用NaOH和HCl溶液調(diào)節(jié)pH值在2～8之間切換5次后仍表現(xiàn)出顯著的pH可循環(huán)發(fā)光特性, 這表明N,S-CQDs具有極好的可逆pH性能. 總體來(lái)說(shuō), N,S-CQDs具有很高的光致發(fā)光穩(wěn)定性, 是很有前途的熒光納米傳感材料.

Fig.5 Effects of NaCl concentration(A), irradiation time(B), storage time(C) and cycle number(D) on the fluorescence intensity of N,S-CQDs

2.2 浮游植物細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

利用銅綠微囊藻細(xì)胞實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了N,S-CQDs環(huán)境毒性. 圖6結(jié)果表明, N,S-CQDs對(duì)藻細(xì)胞幾乎沒(méi)有毒性, 在高濃度(400 μg/mL)N,S-CQDs孵育銅綠微囊藻細(xì)胞48 h, 存活率仍達(dá)到82.8%. 說(shuō)明N,S-CQDs對(duì)浮游植物細(xì)胞毒性低, 環(huán)境友好.

Fig.6 Survival rate of Microcystis aeruginosa cells cultured in N,S-CQDs with different concentrations for 0, 24 and 48 h

Fig.7 Effect of different metal ions on the fluorescence intensity of N,S-CQDsa. Blank; b. Na+; c. K+; d. Fe3+; e. Mn2+; f. Cd2+; g. Ca2+; h. Pb2+; i. Zn2+; j. Hg+; k. Co2+; l. Mg2+; m. Ni2+.

2.3 抗金屬離子干擾性能

金屬離子對(duì)基于N,S-CQDs熒光傳感體系的干擾情況如圖7所示; 大多數(shù)金屬共存未引起N,S-CQDs熒光性能變化, 即N,S-CQDs抗金屬離子干擾性強(qiáng); 只有Fe(Ⅲ)離子能顯著猝滅N,S-CQDs熒光, 這歸因于Fe(Ⅲ)可與碳量子點(diǎn)表面的氨基、羧基配位, 破壞了輻射躍遷, 從而導(dǎo)致熒光猝滅[33].

Fe(Ⅲ)濃度與N,S-CQDs熒光猝滅程度間的關(guān)系如圖8(A)所示. 隨著Fe(Ⅲ)濃度增加, 在λex=302 nm下, N,S-CQDs熒光強(qiáng)度減弱. 如圖8(B)所示, 在λem=409 nm處猝滅效率[(F0-F)/F0]與Fe(Ⅲ)濃度在2～150 μmol/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系(R2=0.995). 人體胃液中鐵離子濃度約為2.15～9.83 μmol/L[37], 即使按最大濃度10 μmol/L計(jì)算, 且全部以Fe(Ⅲ)形態(tài)存在, 根據(jù)線性關(guān)系得出N,S-CQDs在胃液中熒光強(qiáng)度仍可保留91%以上, 胃液中鐵離子所能引起的熒光猝滅有限, 對(duì)胃液中pH精確檢測(cè)影響不顯著, 即干擾效應(yīng)可控.

Fig.8 Fluorescence emission spectra of N,S-CQDs with different concentrations of Fe(Ⅲ)(A) and the linear relationship between(F0-F)/F0 and Fe(Ⅲ) concentration(B)

2.4 N,S-CQDs對(duì)胃液pH值的檢測(cè)

為評(píng)價(jià)N,S-CQDs熒光傳感器檢測(cè)人體胃液pH值的可行性, 配制不同pH值(2.01～5.11)全仿生胃液, 用在λex=302 nm下測(cè)定胃液熒光值. 如圖9(A)所示, 在胃液中N,S-CQDs熒光強(qiáng)度隨pH值的升高而逐漸增強(qiáng), 說(shuō)明N,S-CQDs對(duì)pH值敏感性強(qiáng). 雖然胃液中N,S-CQDs熒光強(qiáng)度比有所減弱, 但其發(fā)射波長(zhǎng)409 nm處的熒光強(qiáng)度與pH值在2.01～5.11范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系, 相關(guān)系數(shù)為0.9931[圖9(B)], 精度達(dá)到0.01級(jí), 說(shuō)明這種基于N,S-CQDs的熒光pH傳感器能達(dá)到胃癌和新生兒胃功能診斷要求, 為胃液pH值實(shí)時(shí)、原位監(jiān)測(cè)提供可能.

Fig.9 Influence of pH value on the fluorescence intensity of N,S-CQDs in gastric juice(A) and the linear relationship between FL intensity at 409 nm and pH value(B) pH: a. 2.01; b. 2.26; c. 2.53; d. 2.76; e. 3.00; f. 3.26; g. 3.53; h. 3.77; i. 3.99; j. 4.20; k. 4.54; l. 5.11.

Fig.10 Zeta potential of N,S-CQDs

表面態(tài)、量子效應(yīng)和碳核是影響碳量子點(diǎn)性能的主要因素[21]. 羧基在酸性溶液中可被質(zhì)子化, 從而導(dǎo)致碳量子點(diǎn)聚集, 引起熒光猝滅, 也即pH值越小, 熒光強(qiáng)度越弱. 而且在低pH值條件下, N,S-CQDs表面氮以氨基形式存在, 氨基的鈍化效果比較敏感. 因此, 從圖9(A)看出熒光峰的位置隨著pH值的降低發(fā)生明顯的移動(dòng). 結(jié)合FTIR和XPS表征結(jié)果認(rèn)為, N,S-CQDs熒光的pH響應(yīng)性可能與其表面基團(tuán)的質(zhì)子化或去質(zhì)子化有關(guān)[23,38]. 為了進(jìn)一步驗(yàn)證, 測(cè)試了不同pH值下N,S-CQDs溶液的Zeta電位. 結(jié)果如圖10所示, N,S-CQDs溶液在低pH值的, 其表面電位為正值, 隨著pH值不斷升高, 其表面成負(fù)電性, 且絕對(duì)值不斷增大.

本文制備的N,S-CQDs和已報(bào)道碳量子點(diǎn)的pH熒光探針性能數(shù)據(jù)列于表1. 可以看到, 本文制備的N,S-CQDs在原材料成本、量子產(chǎn)率和胃環(huán)境適應(yīng)性等方面優(yōu)勢(shì)明顯.

Table 1 pH Detection with carbon quantum dot-based fluorescent probes

3 結(jié) 論

以水楊酸和硫脲等廉價(jià)前驅(qū)體為碳源、氮源和硫源, 采用一步水熱法合成了N,S-CQDs, 將其作為熒光納米傳感器, 用于原位、實(shí)時(shí)地檢測(cè)胃液中pH值. 與其它碳量子點(diǎn)相比, 合成的N,S-CQDs熒光強(qiáng)、抗干擾能力優(yōu)、光穩(wěn)定性高、量子產(chǎn)率(36.23%)高, 特別適用于胃癌早期診斷和新生兒健康防護(hù).