彭永帥，張利衛(wèi)，王軍，李月勤，王海燕

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動物醫(yī)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046)

無漿體是一種專性血液寄生的可經(jīng)硬蜱傳播的病原體，世界范圍內(nèi)分布廣泛[1]。我國報(bào)道的有關(guān)無漿體的病原包括牛無漿體(Anaplasmabovis)、山羊無漿體(A.capra)、綿羊無漿體(A.ovis)、嗜吞噬細(xì)胞無漿體(A.phagocytophilum)、邊緣無漿體(A.marginale)、中央無漿體(A.centrale)和扁平無漿體(A.platys)共7個種。其中牛無漿體和綿羊無漿體流行最為廣泛，在我國多地區(qū)的牛場和羊場均有報(bào)道，且感染率較高[1-2]。山羊無漿體是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種人獸共患無漿體，最早在黑龍江省牡丹江市中心醫(yī)院病人的血樣品中檢測到，并被正式命名[3]。后來又分別在綿羊、山羊、硬蜱和一些野生動物的樣品中被檢測到，可見山羊無漿體的宿主范圍非常廣泛[4-6]。

當(dāng)前，PCR檢測技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于各種疾病的診斷，多重PCR方法是根據(jù)常規(guī)PCR方法衍生而來的技術(shù)，在同一個PCR反應(yīng)體系中用2組或2組以上的引物同時擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能檢測到相應(yīng)的2種或2種以上的病原，比常規(guī)PCR的費(fèi)用低且效率更高[7]。

本研究設(shè)計(jì)一種雙重PCR方法，該方法操作簡單快速且特異性和重復(fù)性良好，能夠同時對牛無漿體和山羊無漿體2種病原進(jìn)行快速檢測，方便科研工作者和畜牧獸醫(yī)相關(guān)人員對該病的診斷。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

采用2018年8月27日和9月28日采自陜西麟游羊全血DNA樣品30份，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。牛無漿體(A.bovis)、山羊無漿體(A.capra)、綿羊無漿體(A.ovis)、呂氏泰勒蟲(T.luwenshuni)、牛巴貝斯蟲(Babesiabovis)、尤氏泰勒蟲(T.uilenbergi)、綿羊泰勒蟲(T.ovis)、環(huán)形泰勒蟲(T.annulata)、雙芽巴貝斯蟲(Babesiamotasi)和剛地弓形蟲(T.gondii)陽性樣品DNA由實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 DNA的提取

參考哺乳動物血液基因組DNA提取試劑盒(上海萊楓)說明書進(jìn)行血液樣品的提取，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物的設(shè)計(jì)

利用Clustal X 2.1序列分析軟件，針對GenBank中登錄牛無漿體gltA序列(登錄號KP076365)與其他物種同源序列對比，用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)1對特異性引物abgltAf1/abgltAr1，由上海生工生物工程公司合成。參考YANG等[4]合成山羊無漿體的msp4序列位點(diǎn)引物acmsp4f4/acmsp4r1，引物信息見表1。

表1 引物的設(shè)計(jì)

病原引物名稱序列長度/bp參考文獻(xiàn)牛無漿體abgltAf1AGGTGCAGCTGCGTTATGGGGabgltAr1TGTCCCGCTCTTGCCGTCTTTG133本研究設(shè)計(jì)山羊無漿體acmsp4f4GCTGAATGTGGGGATAATTTATacmsp4r4ATGGCTGCTTCCTTTCGGTTA641[4]

1.4 PCR擴(kuò)增

1.4.1 單重PCR擴(kuò)增

以羊全血基因組DNA為模板，分別用2種引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳后拍照成像。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件分別見表2和表3。

表2 單對引物的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

試劑體積/μL10×La Buffer2.5dNTP Mixture4上游引物0.4下游引物0.4La Taq酶 0.25DNA2ddH2O15.45

表3 單對引物的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件

預(yù)變性變性退火延伸循環(huán)次數(shù)延伸保存溫度94℃94℃60℃72℃時間5min30s30s1min4072 ℃10 ℃10 min∞

1.4.2 雙重PCR擴(kuò)增

以羊全血基因組DNA為模板，將2對引物abgltAf1/abgltAr1、acmsp4f4/acmsp4r1加入到同一個PCR反應(yīng)體系中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5 %瓊脂糖凝膠電泳，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件詳情見表4和表5。

表4 雙重PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

試劑體積/μL10×La Buffer2.5dNTP Mixture4LaTaq 酶0.25abgltAf1/acmsp4f4各0.4 abgltAr1/acmsp4r4各0.4 DNA2.0ddH2O14.65

表5 雙重PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件

預(yù)變性變性退火延伸循環(huán)次數(shù)延伸保存溫度94 ℃94 ℃60 ℃72時間5 min30 s30 s1 min40次721010 min∞

1.5 雙重PCR方法反應(yīng)體系及反應(yīng)條件的優(yōu)化

對反應(yīng)體系和反應(yīng)條件中的循環(huán)次數(shù)、引物的劑量、LaTaq酶的劑量和退火溫度進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化。

1.5.1 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

(1)最適循環(huán)次數(shù)的優(yōu)化：25 μL PCR體系保持不變，即各成分的濃度及體積保持不變。配制共5組，每組中分別加入DNA模板2 μL，ddH2O作陰性對照。為減少誤差將同時使用5臺PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在其他PCR條件均不變的情況下，循環(huán)次數(shù)分別是25、30、35、40、45。

(2)最適引物劑量的優(yōu)化：加入引物的劑量分別是 0.3、0.4、0.5、0.6和0.7 μL，采用25 μL PCR體系，條件及其他各成分不變進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.5.2 PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

(1)LaTaq酶劑量的優(yōu)化：在25 μL PCR體系中，保持其他各成分不變，只改變LaTaq酶的體積，加入LaTaq酶的劑量分別是0.2、0.25、0.3、0.35和0.4 μL。PCR反應(yīng)條件采用優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增。

(2)退火溫度的優(yōu)化：在25 μL PCR體系中，保持反應(yīng)條件和體系不變，只改變退火溫度。使用梯度PCR儀將退火溫度設(shè)置成55～65 ℃。

1.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

1.6.1 序列測定

將所得PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程進(jìn)行測序。將得到的基因序列在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站上進(jìn)行Blast比對。

1.6.2 特異性驗(yàn)證

用綿羊無漿體、呂氏泰勒蟲、牛巴貝斯蟲、尤氏泰勒蟲、綿羊泰勒蟲、環(huán)形泰勒蟲、雙芽巴貝斯蟲和剛地弓形蟲陽性DNA樣品作為特異性試驗(yàn)的模板，按最佳反應(yīng)體系及條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增以檢驗(yàn)所建立PCR方法的特異性。

1.6.3 重復(fù)性驗(yàn)證

以牛無漿體和山羊無漿體陽性樣品為模板，用優(yōu)化好的PCR反應(yīng)體系及條件進(jìn)行不同批次、批間的重復(fù)試驗(yàn)，并通過計(jì)算kappa系數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果的一致性。

1.6.4 臨床樣本檢測

采用2018年9月28日和8月27日采自陜西麟游羊全血DNA樣品30份，利用該研究所建立的最佳PCR體系進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增

單獨(dú)用牛無漿體引物(abgltAf1/abgltAr1)擴(kuò)增羊全血基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示在約133 bp處出現(xiàn)條帶，與預(yù)期目的片段大小相符(圖1)。

單獨(dú)用山羊無漿體引物(acmsp4f4/acmsp4r4)擴(kuò)增陽性山羊無漿體陽性樣品，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示在約641 bp處出現(xiàn)條帶，大小與預(yù)期目的片段大小相符(圖2)。

M. DL2000 DNA Marker；1～3. 樣品編號；P. 陽性對照；N. 陰性對照

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

M. DL 2000 DNA Marker；1～3. 樣品編號；P. 陽性對照；N. 陰性對照

圖2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

同時采用牛無漿體引物abgltAf1/abgltAr1和山羊無漿體引物acmsp4f4/acmsp4r4兩套引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示得到2條特異性條帶，其中一條特異性條帶約133 bp，另一條約641 bp，與預(yù)期目的片段大小相符(圖3)。

2.2 雙重PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.2.1 最適退火溫度的優(yōu)化結(jié)果

退火溫度在55～65 ℃區(qū)間內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示當(dāng)退火溫度在61 ℃時條帶最亮，故以61 ℃作為雙重PCR的最適退火溫度，見圖4。

2.2.2 最適酶劑量的優(yōu)化結(jié)果

通過使用不同劑量酶進(jìn)行雙重PCR反應(yīng)，結(jié)果顯示在當(dāng)酶的劑量為0.3、0.35和0.4 μL時亮度變化不明顯，故雙重PCR體系酶的最適劑量為0.30 μL(見圖5)。

M. DL 2000 DNA Marker；1～3. 樣品編號；P. 陽性對照；N. 陰性對照

圖3 雙引物的PCR擴(kuò)增

M. DL 2000 DNA Marker；1～8. 樣品編號的溫度分別是65 ℃、64 ℃、 63 ℃、 61 ℃、59 ℃、57 ℃、56 ℃、55 ℃；N. 陰性對照

圖4 不同退火溫度的PCR擴(kuò)增

M. DL 2000 DNA Marker；1～5. 樣品編號的酶劑量分別是：0.20、0.25、0.30、0.35和0.40 μL；N. 陰性對照

圖5 不同酶劑量的PCR擴(kuò)增

2.2.3 最適引物劑量的優(yōu)化結(jié)果

通過采用不同的引物劑量進(jìn)行雙重PCR試驗(yàn)，結(jié)果顯示當(dāng)引物劑量為0.3、0.4、0.5和0.7 μL時133 bp目的條帶亮度不及0.6 μL，故確定最佳引物濃度0.6 μL (圖6)。

M. DL2000 DNA Marker；1～5. 樣品編號的引物劑量分別是：0.3、0.4、0.5、0.6和0.7 μL；N. 陰性對照

圖6 不同引物劑量的PCR擴(kuò)增

2.2.4 最適循環(huán)次數(shù)的優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)不同循環(huán)次數(shù)觀察出現(xiàn)條帶的亮度，以確定最佳循環(huán)次數(shù)。通過調(diào)整發(fā)現(xiàn)，在循環(huán)次數(shù)為40的2條特異性條帶比其他循環(huán)次數(shù)得到的條帶要亮，所以本研究的最適循環(huán)次數(shù)為40(見圖7)。

M. DL2000 DNA Marker；1～5. 樣品編號的循環(huán)次數(shù)分別是：25、30、35、40、45；N. 陰性對照

圖7 不同循環(huán)次數(shù)的PCR擴(kuò)增

2.3 優(yōu)化后的雙重PCR反應(yīng)體系及條件

通過對PCR反應(yīng)體系中引物劑量、酶的劑量的優(yōu)化及反應(yīng)條件中退火溫度、循環(huán)次數(shù)的優(yōu)化后，確定的雙重PCR的最適反應(yīng)體系及條件分別見表6和表7。

2.4 序列分析

將測序結(jié)果利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站的BLAST比對功能進(jìn)行分析，結(jié)果顯示本研究所得到的牛無漿體和山羊無漿體序列分別與已報(bào)道的序列一致。

表6 PCR擴(kuò)增體系

試劑體積/μL10×La Baffer2.5dNTP Mixture4abgltAf1/acmsp4f4各0.6abgltAr1/acmsp4r4各0.6La Taq酶0.3ddH2O15.2DNA2

表7 PCR擴(kuò)增條件

預(yù)變性變性退火延伸循環(huán)次數(shù)再延伸保存溫度94 ℃94 ℃61 ℃72 ℃時間5 min30 s30 s1 min40次72 ℃10 ℃10 min∞

2.5 特異性試驗(yàn)

采用本研究優(yōu)化的雙重PCR反應(yīng)體系及條件，用引物acmsp4f4/acmsp4r4和引物abgltAf1/abgltAr1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)混合陽性樣品(牛無漿體、山羊無漿體)與分別感染牛無漿體、山羊無漿體的樣品均出現(xiàn)相應(yīng)條帶，而綿羊無漿體、呂氏泰勒蟲、牛巴貝斯蟲、尤氏泰勒蟲、綿羊泰勒蟲、環(huán)形泰勒蟲、雙芽巴貝斯蟲和剛地弓形蟲血液樣品則均未出現(xiàn)條帶，表明本研究所建立的雙重PCR特異性良好(見圖8)。

M. DL 2000 DNA Marker；1.牛無漿體+山羊無漿體;2.牛無漿體;3.山羊無漿體;4.綿羊無漿體;5.呂氏泰勒蟲;6.牛巴貝斯蟲;7.尤氏泰勒蟲;8.綿羊泰勒蟲;9.環(huán)形泰勒蟲;10.雙芽巴貝斯蟲;11.剛地弓形蟲

圖8 PCR擴(kuò)增特異性

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

用本研究的最佳PCR體系及條件，對3個批次的15份牛無漿體和山羊無漿體混合感染的陽性樣品進(jìn)行了3次重復(fù)試驗(yàn)，每次批間試驗(yàn)設(shè)置3個重復(fù)進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果一致，kappa系數(shù)為1，表明本研究的雙重PCR檢測方法具有良好的重復(fù)性(見圖9)。

M. DL 2000 DNA Marker；1～3. 樣品編號；P. 陽性對照；N. 陰性對照

圖9 重復(fù)性PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.7 臨床樣本檢測

分別用單重PCR法和本研究所建立的雙重PCR法進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示雙重PCR方法擴(kuò)增牛無漿體的陽性率為60.0%(18/30)，山羊無漿體的陽性率為66.7%(20/30)，混合感染陽性率為66.7%(20/30)。單重PCR結(jié)果顯示牛無漿體的陽性率為66.7%(20/30)，山羊無漿體的陽性率為73.3%(22/30)，牛無漿體和山羊無漿體混合感染率為73.3%(22/30)，雙重PCR與單重PCR檢測陽性率差異不顯著(見表8)。

表8 不同病原感染陽性率統(tǒng)計(jì) %

方法病原牛無漿體山羊無漿體牛無漿體+山羊無漿體雙重PCR60.0(18/30)66.7(20/30)66.7(20/30)單重PCR66.7(20/30)73.3(22/30)73.3(22/30)

3 討論

山羊無漿體和牛無漿體在小型反芻動物混合感染情況非常普遍，且感染率較高。YANG等[5]采用常規(guī)PCR技術(shù)對甘肅地區(qū)家養(yǎng)的小型反芻動物中無漿體的發(fā)生情況進(jìn)行了研究，結(jié)果表明牛無漿體和山羊無漿體的平均感染率分別為24.4%和18.2%。SEO等[8]對1 219頭牛進(jìn)行多位點(diǎn)基因檢測，分別檢測到牛無漿體的16S rRNA基因和山羊無漿體的4個基因。PENG等[9]采用對我國山羊無漿體進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果表明山羊無漿體在我國分布廣泛，尤其在河南、陜西等地區(qū)感染率較高。

已有研究者通過相關(guān)試驗(yàn)證明，msp4和gltA序列在無漿體屬中高度保守，因此被廣泛用于檢測無漿體[10-11]。本研究通過對引物劑量增加和減少，分別產(chǎn)生“弱”和“強(qiáng)”的不同條帶，結(jié)果表明在劑量為0.6 μL時為該研究的最佳引物劑量。所有引物的退火溫度也需要進(jìn)行優(yōu)化，以獲得特異性高的擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，61 ℃為本研究的最適退火溫度值。在優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件后，成功擴(kuò)增出了預(yù)期大小的產(chǎn)物且2個引物組沒有產(chǎn)生交叉雙聚體，根據(jù)產(chǎn)物長度的差異可以識別該研究中的2種病原。與單重PCR相比，雙重PCR對兩種引物的特異性和重復(fù)性更好。本研究建立的雙重PCR方法能夠特異性檢測出牛無漿體和山羊無漿體，擴(kuò)增出133 bp和641 bp的目的條帶，且不能檢測出其他病原(綿羊無漿體、呂氏泰勒蟲、牛巴貝斯蟲、尤氏泰勒蟲、綿羊泰勒蟲、環(huán)形泰勒蟲、雙芽巴貝斯蟲和剛地弓形蟲)，表現(xiàn)出良好的特異性；根據(jù)本研究的最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，對不同批次、批間的羊血液樣品進(jìn)行了3次重復(fù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果一樣，表明本研究的雙重PCR檢測方法具有良好的重復(fù)性。

目前用于檢測無漿體的PCR方法有常規(guī)PCR、套式PCR、熒光定量PCR等，檢測準(zhǔn)確、特異性好，但每次PCR反應(yīng)只能檢測1種病原，而多重PCR技術(shù)能夠同時檢測2種或2種以上的不同病原，檢測效率明顯提高，因此建立一種雙重PCR技術(shù)將為基層獸醫(yī)工作人員和科研工作者提供一種非常有效的工具，將大大提高無漿體的檢測效率。據(jù)報(bào)道，有研究者采用多重PCR技術(shù)進(jìn)行檢測邊緣無漿體和中央無漿體[12]；也有可同時檢測泰勒蟲屬和無漿體屬的二重PCR技術(shù)的相關(guān)報(bào)道[13]，但能夠能時檢測山羊無漿體和牛無漿體的PCR技術(shù)除本研究外尚無相關(guān)報(bào)道。

綜上，本研究建立了一種可同時檢測山羊無漿體和牛無漿體的雙重PCR方法，特異性、重復(fù)性良好，操作簡便，省時省力，可用于兩種無漿體感染的快速鑒別診斷和流行病學(xué)監(jiān)測。