王利利，張凱睿，范云鵬，劉迎秋，麻武仁，張為民，宋曉平

(西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西 楊凌 712100)

隨著我國經(jīng)濟的發(fā)展，養(yǎng)殖業(yè)在大規(guī)模的擴增，而由細菌引起的疾病嚴重制約畜牧業(yè)的的發(fā)展。其中大腸埃希菌和沙門菌可引起畜禽腸道感染及嚴重的腹瀉性疾病，且這兩種致病菌易產(chǎn)生耐藥性[1-3]；金黃色葡萄球菌可引起心包炎、皮膚炎、肺炎等多種疾病[4]；鏈球菌可引起奶牛乳房炎、豬鏈球菌病等[5-6]。臨床上常使用抗菌藥防治細菌性感染疾病，但是所帶來的藥物殘留及耐藥性也日趨嚴重，中草藥因其資源豐富、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，成為替代抗生素的重要途徑[7]。

鵝掌楸屬(Liriodendron)植物是傳統(tǒng)的藥用植物，具有很高的藥用價值?！度珖胁菟巺R編》記載以中國鵝掌楸(Liriodendronchinense)的樹皮及樹根入藥，能夠祛風除濕，止咳消喘，用于治療風濕關節(jié)痛，風寒咳嗽等病癥[8]。李曉娜等[9]研究表明，北美鵝掌楸(L.tulipifera)葉乙醇提取物對金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、枯草芽孢桿菌等臨床分離株有不同程度抑菌；張悅等[10]通過研究6種植物粗提物對大腸桿菌的抑制作用，篩選出鵝掌楸乙醇提取物和水提物的抑制率達到70%以上。現(xiàn)代研究表明，鵝掌楸屬植物主要含有生物堿、倍半萜、黃酮、苯丙素等成分，具有抗菌、抗瘧疾、抗腫瘤等作用[11]。本試驗采用系統(tǒng)溶劑法萃取得到雜種鵝掌楸(L.chinense×tulipifera)葉醇提物的不同部位，并通過瓊脂平板法和微量肉湯稀釋法檢測各部位的抗菌作用，以期為進一步研究和應用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物

雜種鵝掌楸樹葉，2018年05月11日采自西北農(nóng)林科技大學南校區(qū)鵝掌楸路，清洗后自然陰干，粉碎過20目篩，密封袋保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試驗菌株

大腸埃希菌 ATCC25922、沙門菌 CMCC(B)50071、金黃色葡萄球菌 ATCC6538、無乳鏈球菌 ATCC12386，由西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院微生物實驗室提供；大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌臨床分離株，從患子宮內(nèi)膜炎奶牛子宮分泌物中分離得到；沙門菌臨床分離株，由華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院提供。

1.1.3 主要試劑

無水乙醇(批號2019041002)，石油醚(批號2019041701)，乙酸乙酯(批號2018011001)，正丁醇(批號2019012101)，二甲基亞砜(批號2018042601)，吐溫-80(批號201801240)，成都市科隆化學品有限公司；氯仿，批號180030，洛陽昊華化學試劑有限公司；營養(yǎng)肉湯(批號20180330)，營養(yǎng)瓊脂(批號20161016)，北京奧博星生物技術有限責任公司；胎牛血清，批號18090505，浙江天杭生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取物的制備

稱取雜種鵝掌楸樹葉粉末200 g，置于圓底燒瓶中，使用體積分數(shù)95%的乙醇加熱回流提取4次，每次2 h，藥渣用60%的乙醇提取2次，每次2 h，過濾合并濾液，減壓濃縮，得醇提浸膏57.15 g。浸膏用適量水分散，依次用石油醚(60～90 ℃)、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取3～4次，每次3～4 h，減壓濃縮并回收各部位溶劑，干燥后分別制得各部位提取物[12]。其中石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水部位提取物分別為9.25、2.11、1.65、10.25及25.20 g。石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇部位提取物用3% DMSO和3%吐溫-80溶解，水部位提取物用蒸餾水溶解，在超凈工作臺中過 0.22μm 微孔濾膜，分別配成質(zhì)量濃度為 10 mg/mL 的藥液。干凈玻璃棒分別蘸取各藥液，點在pH試紙的中部，待試紙變色后，經(jīng)與標準比色卡比較，各藥液pH值均在6～8之間。

1.2.2 體外抗菌試驗

供試菌液的制備:在超凈工作臺中，使用接種環(huán)將大腸埃希菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，鏈球菌接種于含血清的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，然后挑取大腸埃希菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌的單菌落接種于無菌普通肉湯中，鏈球菌單菌落接種于在含血清的營養(yǎng)肉湯上，于37 ℃，180 r/min搖床中培養(yǎng)6 h后，用生理鹽水將菌液校正至0.5麥氏比濁標準[13]。

抑菌圈的測定:采用瓊脂平板打孔法，使用移液槍分別吸取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌受試菌液100 μL，加于普通營養(yǎng)瓊脂平板上，鏈球菌受試菌液 100 μL，加于含血清營養(yǎng)瓊脂平板上，迅速用玻璃涂布器在平板上均勻涂布菌液，然后在瓊脂平板上均勻打孔，孔徑6 mm，孔間距>20 mm，在酒精燈上迅速加熱，封底，將鵝掌楸不同部位提取物的受試藥液100 μL加入到各個孔中，并設置溶劑對照，于37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h后，觀察結果，每種供試菌抑菌試驗重復3次，測量抑菌圈平均值[14]。判定標準：當抑菌圈直徑≥20 mm時，表示極度敏感；當15 mm≤抑菌圈直徑<20 mm時，表示高度敏感；當10 mm≤抑菌圈直徑<15 mm時，表示中度敏感；當6 mm≤抑菌圈直徑<10 mm時，表示低度敏感或者耐藥[15]。

最小抑菌和殺菌濃度的測定:采用微量肉湯稀釋法測定鵝掌楸不同部位提取物的供試藥液對不同菌株的最小抑菌濃度(MIC)。具體方法是：使用營養(yǎng)肉湯將菌液稀釋100倍[16]，然后接種于96孔培養(yǎng)板的1～10 孔，每孔接種100 μL，之后將供試藥物加至第1孔，吹吸幾次，使孔內(nèi)溶液混勻，吸出100 μL加至第2孔，依次進行倍比稀釋，最后第9 孔中吸出100 μL棄掉。其中第10孔加入100 μL 3% DMSO和3%吐溫-80，混勻后吸出100 μL棄掉，作為溶劑對照，第11孔為只加營養(yǎng)肉湯100μL的對照孔，檢測培養(yǎng)基是否污染，第 12 孔為只加菌液的對照孔，檢測菌液是否生長良好，重復3次[17]。接種完成后，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，觀察其MIC，每孔加入5 μL 4% TTC，放置一段時間，觀察各孔是否變紅，未變紅的最后一孔的濃度為最小抑菌濃度。將最低抑菌濃度以上的幾個濃度細菌接種到固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜，觀察，菌落數(shù)小于5個的最小稀釋度的藥物濃度即為最低殺菌濃度(MBC)[18]。

2 結果

2.1 雜種鵝掌楸體外抑菌圈直徑測定

鵝掌楸石油醚部位提取物對沙門菌、金黃色葡萄球菌參考菌株有中等抗菌作用，抑菌圈直徑分別為 11.0、10.0 mm；氯仿部位提取物對沙門菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌參考菌株有強抗菌作用，抑菌圈直徑分別為18.0、16.0、17.0 mm；乙酸乙酯部位提取物對沙門菌參考菌株有中等抗菌作用，抑菌圈直徑為10.0 mm；石油醚、氯仿、乙酸乙酯部位提取物對大腸埃希菌參考菌株，乙酸乙酯部位提取物對金黃色葡萄球菌、鏈球菌參考菌株，正丁醇、水部位提取物對 4 種供試參考菌株均無抑菌作用，抑菌圈直徑為 6.0 mm(表1)。

表1 雜種鵝掌楸部位提取物對參考菌株的抑菌圈直徑 (mm)

鵝掌楸氯仿部位提取物對沙門菌臨床分離株有中等抗菌作用，抑菌圈直徑為11.0 mm；對金黃色葡萄球菌、鏈球菌臨床分離株有強抗菌作用，抑菌圈直徑分別為15.0、16.0 mm；氯仿部位提取物對大腸埃希菌臨床分離株，石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水部位提取物對 4 種供試臨床分離株均無抑菌作用，抑菌圈直徑為 6.0 mm(表2)。

表2 鵝掌楸部位提取物對臨床分離菌株的抑菌圈直徑 mm

2.2 鵝掌楸各部位提取物最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

石油醚部位提取物對大腸埃希菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌參考菌株的MIC分別為5、1.25、1.25、2.5 mg/mL，MBC分別為5、2.5、2.5、2.5 mg/mL；氯仿部位提取物MIC分別為5、0.625、0.312 5、0.625 mg/mL，MBC分別為5、1.25、0.312 5、1.25mg/mL；乙酸乙酯部位提取物MIC均別為2.5 mg/mL，MBC 分別為 2.5、5、5、5 mg/mL(表3)。

表3 鵝掌楸部位提取物對參考菌株的MIC和MBC mg/mL

石油醚部位提取物對大腸埃希菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌臨床分離株的 MIC分別為 5、2.5、1.25及2.5 mg/mL，MBC分別為 5、5、2.5及2.5 mg/mL；氯仿部位提取物MIC分別為 5、1.25、0.312 5、0.62 5 mg/mL，MBC分別為 5、2.5、0.312 5及1.25 mg/mL；乙酸乙酯部位提取物 MIC分別為 2.5、5、1.25、2.5 mg/mL，MBC分別為 2.5、5、5及5 mg/mL(表4)。

表4 鵝掌楸部位提取物對臨床分離菌株的MIC和MBC mg/mL

3 討論

中藥化學成分及其復雜，每味中藥都含有多類化學成分，在進行中藥活性成分提取時，通常依據(jù)相似相溶的原理來制備提取物[19]。楊國旭[20]對雜交鵝掌楸莖皮的醇提物進行了不同溶劑溶解分段，并證明了雜交鵝掌楸莖皮的二氯甲烷粗提部分對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌具有抑菌作用，抑菌率48.8%。趙亞琦等[21]用瓊脂稀釋法檢測鵝掌楸樹皮及葉片提取物抑菌作用，結果表明鵝掌楸樹皮和樹葉提取物對大腸埃希菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和糞鏈球菌有明顯抑菌效果。另有研究表明，鵝掌楸心材的醇提物以及番荔枝堿(anonaine)和鵝掌楸堿(liriodenine)等對多種細菌具有抑制作用[22-23]。

本試驗通過雜種鵝掌楸葉各系統(tǒng)提取物的抗菌作用研究，發(fā)現(xiàn)雜種鵝掌楸葉提取物對沙門菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌有不同程度的抗菌作用，其中氯仿部位提取物作用最強，對沙門菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌有強抗菌作用，說明其抗菌活性成分屬于極性較小的化合物；石油醚和乙酸乙酯部位提取物對沙門菌、乙酸乙酯部位提取物對金黃色葡萄球菌有中等抑菌作用，說明石油醚和乙酸乙酯部位也含有抗菌活性成分。對于試驗中出現(xiàn)抑菌圈與MIC結果不一致的原因，分析可能是因為藥物經(jīng)稀釋后，抑菌效果有些減弱的快，有些減弱的慢，另外發(fā)揮抑菌作用的化學成分在結構上也不相同，導致在肉湯或瓊脂中擴散速度不同，在后續(xù)研究中，將對氯仿活性部位進行分離純化，以期為雜種鵝掌楸葉抗菌成分的研究及應用提供參考依據(jù)。