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      基于GC-MS代謝組學技術委陵菜與星毛委陵菜的初生代謝比較研究

      2020-07-14 00:50:00吳可心徐明遠唐中華
      植物研究 2020年5期
      關鍵詞:委陵菜代謝物物種

      智 慧 艾 丹 吳可心 郭 云 徐明遠 唐中華

      (1.呼倫貝爾職業(yè)技術學院,呼倫貝爾 021000; 2.東北林業(yè)大學化學化工與資源利用學院,哈爾濱 150040; 3.黑龍江中醫(yī)藥大學,哈爾濱 150040)

      我國蒙藥資源豐富,但隨著人們的健康意識逐漸增強以及在經濟利益的驅動下,一些野生蒙藥資源被過度采挖和使用,致使很多藥用植物產量持續(xù)下降,甚至一些名貴藥材瀕臨滅絕,故對蒙藥資源的保護迫在眉睫[1]。薔薇科(Rosaceae)委陵菜屬(Potentilla)植物一般為一年生或多年生草本,少有灌木,廣泛分布于北溫帶,可在多種生境中生長,如在山地灌叢、礫石質坡地、溝谷、林下、林緣、草甸、草原、溪邊、農田邊及鹽堿地均可發(fā)現該屬植物,多為其他植物群落的伴生種[2]。委陵菜屬植物資源豐富,《內蒙古植物志》中記載了28種委陵菜屬植物[3]。委陵菜屬植物具有非常高的藥用、牧用、工業(yè)用、觀賞以及水土保持價值[4]。

      中藥委陵菜為薔薇科植物委陵菜(PotentillachinensisSer.)的干燥全草,具有清熱解毒,涼血止痢。用于赤痢腹痛、久痢不止、痔瘡出血、癰腫瘡毒[5]。研究表明,委陵菜含有黃酮類成分、有機酸類成分、多糖類成分、三萜類等活性成分[6~10],同時,藥理研究結果表明,委陵菜具有保護肝臟功能、抗腫瘤、降血糖、抗感染等作用,對胃腸炎、細菌性痢疾有較好的治療作用[11~16]。星毛委陵菜(PotentillaacaulisL.),別名無莖委陵菜,是一種匍匐型多年生草本植物,生長在典型草原帶的沙質草原、礫石質草原及放牧退化草原。通常形成直徑30~40 cm的斑塊狀小群落,是草原放牧退化的標志性植物[17]。

      近年來代謝組學尤其是氣相色譜與質譜聯用技術在民族醫(yī)藥的研究中得到了廣泛運用,包括中藥整體性評價、中藥質量標志物、中藥藥效作用機制研究,中草藥活性成分的研究,中藥材基原鑒別,中藥代謝及毒理評價等領域有著廣泛應用[18~20]。其中,對于藥材的基原鑒別報道很多,有研究利用氣相色譜—質譜聯用技術對3種姜黃屬植物進行了質量控制和鑒別的代謝組學研究[21];也有研究利用該技術鑒別了川芎和當歸在初生代謝上的差異,找到了兩種中藥材的差異代謝物[22];還有研究用該技術與其他技術聯合使用區(qū)分了丁香屬藥用植物的代謝差異[23]。另外,還有研究利用GC-MS技術對委陵菜中的揮發(fā)性成分進行了分析,檢定出32個揮發(fā)性化學成分,主要為α-法尼烯(17.68%)、2-乙基呋喃(14.48%)、葉醇(7.96%)、可巴烯(6.87%)、己醛(6.76%)、羥基丙酮(5.21%)和石竹烯(4.52%)[24]。

      委陵菜作為一種常用的蒙藥材,有較好的開發(fā)和利用價值,但其同屬植物在外觀性狀上差異并不大,在臨床上容易被混用。為了保證藥用委陵菜的品質,同時為該屬植物的鑒別提供理論依據。本研究利用GC-MS分析技術和代謝組學的研究策略對委陵菜屬中藥用植物委陵菜和飼用植物星毛委陵菜的全草中的小分子初生代謝物進行全面比較,從初生代謝層面分析比較兩種委陵菜屬植物的異同。本研究結果彌補了委陵菜屬植物初生代謝產物研究的不足,為委陵菜屬植物的鑒別藥用資源開發(fā)和利用提供試驗研究基礎,對服務于蒙醫(yī)藥產業(yè)現代化具有重要的意義。

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      植物樣品于2018年7月份采自內蒙古鄂溫克自治旗,每個植物分別采集3個生物學重復,每個重復包括6株植物全草,經呼倫貝爾學院黃學文教授鑒定分別為委陵菜(PotentillachinensisSer.)和星毛委陵菜(PotentillaacaulisL.),將其洗凈后自然晾干,備用。

      甲醇(色譜級,北京百靈威科技有限公司)、L-2-氯-苯丙氨酸(阿拉丁)、甲氧胺鹽酸鹽(上海笛柏生物科技有限公司)、BSTFA(含1%TMCS)衍生試劑(阿拉丁)、正己烷(分析純,天津市富宇精細化工有限公司)、氯仿(濟南匯豐達化工有限公司)、吡啶(阿拉丁)。

      1.2 儀器與設備

      7890A-5975C氣相色譜質譜聯用儀(安捷倫公司,美國),BSA224S-CW電子天平(賽多利斯公司,德國),KQ500-DB數控超聲波清洗機(昆山超聲儀器有限公司),TGL-16高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司),SHZ-82A氣浴恒溫振蕩器(常州金壇良友儀器有限公司),DK-98-ⅡA電熱恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司),Xinyi-24高通量組織研磨機(寧波新藝超聲設備有限公司),ZLS-2真空離心濃縮儀(湖南赫西儀器裝備有限公司)。

      1.3 樣品的制備

      稱取委陵菜和星毛委陵菜樣品90 mg,放入1.5 mL的離心管中,依次加入2顆小鋼珠,540 μL的冷甲醇和60 μL的內標(L-2-氯-苯丙氨酸,0.3 mg·mL-1,甲醇配置),在-80℃冰箱中放置2 min,放入研磨機中研磨(60 Hz)2 min后取出繼續(xù)超聲提取30 min,取出1顆小鋼珠,加入300 μL的氯仿,研磨機中渦旋(20 Hz)2 min,加入600 μL的水,研磨機中渦旋(20 Hz)2 min,超聲提取30 min,低溫離心(14 000 r·min-1,4℃)10 min,取700 μL的上清液,裝入玻璃衍生瓶中,快速離心濃縮儀揮干,向玻璃衍生小瓶中加入400 μL的甲氧胺鹽酸吡啶溶液(15 mg·mL-1),渦旋震蕩2 min后,于震蕩培養(yǎng)箱中37℃肟化反應90 min,取出后再加入400 μL的BSTFA(含1%TMCS)衍生試劑和60 μL的正己烷,渦旋震蕩2 min后,于70℃反應60 min,取出樣品,室溫放置30 min,進行GC-MS代謝組學分析。

      1.4 數據處理和多元統計分析

      使用R軟件平臺并采用XCMS軟件包下進行數據的特征峰提取和預處理,將預處理完畢的數據矩陣歸一化后導入SIMCA-P(version 13,Umetrics,Ume?,瑞典)軟件進行PCA分析和OPLS-DA等多元統計分析[25],再以據變量對分組貢獻得分(VIP得分)大于1和組間變化的差異檢驗(學生氏t檢驗)顯著性(P<0.05)為差異性代謝產物的篩選標準。并將差異代謝物輸入到kegg數據庫和MetaboAnalyst(https://www.metaboanalyst.ca/)數據庫進行代謝途徑的富集和篩選[14]。

      2 結果與分析

      2.1 GC-MS原始數據的分析和處理

      由圖1可以看出,兩個委陵菜屬植物的GC-MS色譜峰基線較平穩(wěn),且色譜峰被有效的分離,該方法穩(wěn)定、可靠,研究數據可進行后續(xù)統計分析和處理。另外,兩種植物的色譜峰從數量和峰強度也顯示出顯著不同。對GC-MS原始數據進行預處理后,在兩種委陵菜屬植物樣品中共掃描到134個色譜峰,根據色譜峰的保留時間等信息在NIST數據庫和Wiley Registry代謝組數據庫對檢測到的色譜峰定性注釋,共定性出了43個代謝產物。其中,12個代謝產物只存在于委陵菜中,8個代謝產物只存在于星毛委陵菜中,22個代謝物在兩物種中都存在,如表1所示。

      圖1 兩種為委陵菜屬植物的總離子流氣相色譜圖 a.委陵菜;b.星毛委陵菜Fig.1 Ion flow gas chromatography of two species of Potentilla a.P.chinensis; b.P.acaulis

      2.2 兩委陵菜屬植物的代謝組學差異分析

      2.2.1 PCA分析

      為判別委陵菜和星毛委陵菜兩物種的代謝物累積差異,首先選擇主成分分析方法進行分析,得到了一個擬合了2個主成分的PCA模型,累計R2X=0.948,Q2=0.843,2個模型參數數值均大于0.5,且二者數值相差不大,說明所建立的PCA模型穩(wěn)定,可用于代謝差異分析。由圖2可知,委陵菜樣品均位于PC1負半軸,星毛委陵菜樣品均位于PC1正半軸,二者被明顯分開,說明兩個物種樣品在代謝物的組成上有明顯不同。PCA分析的缺點是不能夠忽略組內誤差,并消除與研究目的無關的隨機誤差,因此它是一種無監(jiān)督的分析方法。為更加準確地顯示兩種委陵菜屬植物間的代謝差異,應使用有監(jiān)督的OPLS-DA模型進行進一步分析。

      2.2.2 OPLS-DA模型的分析結果2.2.2.1 OPLS-DA模型的建立

      OPLS-DA模型分析的優(yōu)勢是它可以過濾掉代謝物中與分類變量不相關的正交變量,并對非正交變量和正交變量分別分析,可以更加準確的發(fā)現代謝物在不同物種中的差異情況。OPLS-DA分析以變量重要性為依據進行差異代謝物篩選,更能把握多位數據整體特征和變異規(guī)律[26]。如圖3所示,委陵菜樣品主要分布在置信區(qū)間的左側,星毛委陵菜樣品主要分布在置信區(qū)間的右側,這說明該模型能夠對兩種委陵菜屬植物的樣品進行有效區(qū)分。建立的OPLS-DA模型共得到2個主成分,RX2=0.951,RY2=1,Q2=1,這3個模型參數均大于0.5,說明本研究中所建立的OPLS-DA模型可能夠有效解釋兩物種間的代謝差異。

      表1 委陵菜和星毛委陵菜樣品代謝物的定性結果

      注:A.委陵菜;B.星毛委陵菜

      Note:A.P.chinensis; B.P.acaulis

      圖2 2種樣品的PCA得分圖Fig.2 PCA scores plot of two samples

      圖3 2種樣品的OPLS-DA得分圖Fig.3 OPLS-DA scores plot of two samples

      圖4 2種樣品的OPLS-DA模型置換檢驗結果Fig.4 Two samples OPLS-DA model permutation test results

      2.2.2.2 OPLS-DA模型的置換驗證

      置換驗證通過隨機改變分類變量Y的排列順序,多次建立對應的OPLS-DA模型以獲取隨機模型的R2和Q2值,可有效評估檢驗模型是否發(fā)生過擬合和評估模型的統計顯著性。對OPLS-DA模型的置換檢驗結果如圖4所示。最右側原始的R2點始終高于左側的R2點,右側的原始Q2點始終高于左側的Q2點,說明OPLS-DA模型不存在過擬合現象,模型穩(wěn)定性較好,可以較好地解釋兩組樣本之間的差異。

      2.2.2.3 兩種委陵菜屬植物樣品間的差異代謝物確定

      以OPLS-DA模型的VIP得分(VIP>1),并結合t檢驗(t-test)的結果P值(P<0.05)來尋找兩物種間的標志性差異性代謝物。由表2可知,兩委陵菜樣品共篩選出33種差異代謝產物,篩選出的33種差異代謝物中17種在委陵菜中的相對含量高于星毛委陵菜,且倍數在3.88~16.19,16種代謝物在星毛委陵菜中的相對含量較高,且倍數在-4.91~-16.176含量差異顯著。說明兩種植物雖屬同屬,由于物種不同,相同代謝產物的含量也有明顯差異。

      2.3 差異代謝物分析

      2.3.1 差異性代謝產物通路分析

      利用Kegg數據庫找到所有差異代謝物KEGG ID,將這些ID輸入到MetaboAnalyst數據庫通過代謝富集,識別出兩物種可能的差別代謝途徑,并對這些代謝途徑進行篩選,最終獲得與代謝物差異相關性最高的途徑,結果如表3所示。富集分析共標注到5個較為重要的代謝途徑,包括半乳糖代謝、淀粉和蔗糖代謝、氨酰生物合成、氨基糖和核苷酸糖代謝和果糖、甘露糖代謝途徑。

      2.3.2 不同代謝通路兩物種的代謝差異

      在圖5中顯示的是參與代謝途徑的主要代謝物在兩種委陵菜屬植物中相對含量的差異。其中,在半乳糖代謝途徑中的代謝物塔格糖、蔗糖、甘露糖只在委陵菜中被檢測到,葡萄糖在委陵菜中的相對含量較星毛委陵菜高63.41%,而肌醇和蜜二糖的含量則在星毛委陵菜中的含量較委陵菜中分別高160.40%和133.27%。在淀粉和蔗糖代謝途徑中的代謝物蔗糖海藻糖只在委陵菜中被檢測到,葡萄糖和木糖的相對含量在委陵菜中的相對含量較星毛委陵菜分別高63.41%和73.37%,而果糖只在星毛委陵菜中被檢測到。在氨酰生物合成代謝途徑中,丙氨酸只在委陵菜中被檢測到,纈氨酸只在星毛委陵菜中被檢測到,脯氨酸的相對含量在委陵菜中較星毛委陵菜中高25.28%。在氨基糖和核苷酸糖代謝途徑中,甘露糖只在委陵菜中被檢測到,果糖只在星毛委陵菜中被檢測到,葡萄糖和木糖的相對含量在委陵菜中的相對含量較星毛委陵菜分別高63.41%和73.37%。在果糖和甘露糖代謝途徑中,代謝物甘露糖只在委陵菜中被檢測到,2-磷酸果糖只在星毛委陵菜中被檢測到,甘露醇在星毛委陵菜中的相對含量較委陵菜中高1625.94%。

      表2 兩物種樣品差異代謝物的結果

      表3 差異代謝物參與的代謝途徑明細

      圖5 不同代謝途徑中主要代謝物在兩物種的相對含量差異 a.半乳糖代謝;b.淀粉和蔗糖代謝;c.氨酰生物合成;d.氨基糖和核苷酸糖代謝;e.果糖和甘露糖代謝 字母不同代表該代謝物在兩物種間的差異顯著(P<0.05)Fig.5 The relative content of major metabolites in different metabolic pathways in the two species is different a.Galactose metabolism; b.Starch and sucrose metabolism; c.Aminoacyl-tRNA biosynthesis; d.Amino sugar and nucleotide sugar metabolism; e.Fructose and mannose metabolism Different letters indicate that the metabolite is significantly different between the two species(P<0.05)

      3 討論

      在本研究中,我們利用GC-MS技術及非靶向代謝組學的研究策略研究了在兩種委陵菜屬植物樣品的初生代謝差異,由圖1及表1可以看出,在兩種植物樣品中共掃描到134個色譜峰,鑒定出43個代謝物,代謝物的種類包括糖類、醇類、氨基酸類、有機酸類及脂肪酸類代謝物,前人也就此做了大量的研究。如Aizat等[27]用氣相色譜法對辣椒進行代謝組學分析,鑒定了辣椒中的糖、氨基酸、有機酸;也有人利用GC-MS聯用技術在對姜科植物的小分子代謝物、初生代謝物進行了分析,鑒定了其中的氨基酸類,糖類、有機酸類和醇類物質[28]。以上研究和本研究的結果均顯示,GC-MS技術作為一種成熟的檢測手段可用于兩個委陵菜屬植物的代謝輪廓分析。

      多元統計分析,作為一種常用的分析手段越來越多的應用到中藥材代謝組數據分析中,有研究利用多元統計分析比較了東北林蛙油及其類似品、偽品的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜,結果顯示,OPLS-DA的分析結果優(yōu)于無監(jiān)督的PCA分析和系統聚類分析[29]。從表1可以看出,在鑒定出的43種代謝物中,除了12種代謝物在委陵菜中特異性的積累,8種代謝物在星毛委陵菜中特異性的積累,另外有22種代謝物在兩物種中同時積累,需要合適的方法來找到兩物種的差異代謝物,進而區(qū)分兩物種在代謝途徑上的差別。本研究采用PCA和OPLS-DA的統計學方法顯示來分析兩種委陵菜屬植物的代謝差異,圖2中PCA得分圖結果顯示,鑒定的43種代謝物在兩物種的累積顯示出顯著的差異,進一步利用OPLS-DA結合分析t檢驗找到了兩物種的差異代謝物33個。以上結果表明,多元統計分析方法可顯著區(qū)分本研究中的兩個植物,且相關模型的建立穩(wěn)定可靠。

      本研究利用OPLS-DA分析找到的兩個物種的33種差異代謝物輸入到MetaboAnalyst數據庫中進行通路富集,共富集到半乳糖代謝、淀粉和蔗糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、果糖和甘露糖代謝和氨酰生物合成5個主要的代謝途徑,其中,前4個代謝途徑在植物中均屬植物碳代謝范疇,氨酰生物合成屬植物氮代謝范疇。碳水化合物是植物光合作用的主要產物之一,可分為以木質素和纖維素為代表的結構性碳水化合物和以葡萄糖、蔗糖糖為代表的非結構性碳水化合物[30]。非結構性碳水化合物直接參與植物的許多重要的生命代謝過程,對植物的生長發(fā)育和植物物質對環(huán)境因子的響應有著重要的影響[31]。由圖5結果顯示,在參與代謝途徑的9種糖類物質中,塔格糖、蔗糖、甘露糖、葡萄糖、海藻糖和木糖在委陵菜中的累積顯著高于星毛委陵菜,而蜜二糖、果糖和2-磷酸果糖主要在星毛委陵菜中累積,這表明兩物種從光合作用到初級能量轉化的碳代謝有著顯著的不同。本研究中在氨酰生物合成富集到的3個代謝物均屬于氨基酸類代謝物,此類代謝物主要參與植物的氮素代謝[32~33]。它們在植物體內有多種生物功能,如提高植物的抗病能力[34],抵御生物脅迫與非生物脅迫的能力[35~36],調節(jié)植物的生長發(fā)育[37~38],同時該類物質通過次生代謝途徑可合成多種次生代謝物質[39]。在本研究中,通過代謝通路富集到3個氨基酸類代謝物中,丙氨酸、脯氨酸在委陵菜中的累積高于星毛委陵菜,纈氨酸則主要存在于星毛委陵菜中。研究結果表明,兩委陵菜屬植物在植物碳、氮代謝均顯示出顯著的不同,這從初生代謝角度為星毛委陵菜沒有和委陵菜一樣被作為藥用植物提供了一定的理論依據。

      4 結論

      本研究基于GC-MS的代謝組學技術對來自內蒙古藥用植物委陵菜和內蒙古草原常見的牧草星毛委陵菜樣品進行代謝組學分析,考察了委陵菜屬兩種常見物種的代謝差異。實驗共鑒定出43個代謝產物,其中,8個代謝產物只存在于委陵菜中,12個代謝產物只存在于星毛委陵菜中,22個代謝產物在兩個物種中都存在。對樣品進行了主成分分析和正交偏最小二乘法分析,找到了兩個物種間的33種差異代謝物,其中,17種代謝物在委陵菜中的相對含量高于星毛委陵菜,16種代謝物在星毛委陵菜中的相對含量較高。代謝通路富集結果表明,兩物種的C、N代謝相關途徑也顯著不同。綜上所述,基于GC-MS技術的代謝組學分析方法用于分析不同物種的委陵菜屬植物代謝輪廓具有一定的可行性,可為不同物種藥用植物的次生代謝物累積的差異以及藥理藥效的不同的研究提供理論依據。本研究的結果表明,利用氣相色譜與質譜聯用技術,結合代謝組學的研究方法和思路,分析和比較委陵菜屬植物初生代謝產物的代謝差異,可為該屬植物的藥用資源開發(fā)提供理論基礎。

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